魯美靜 文懷昌 汪 懿 王夢麗 張愷辰 陳永權(quán)

（安徽省蕪湖市皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院麻醉科，蕪湖 241000）

1 材料與方法

1.1材料 大鼠心肌細(xì)胞系H9C2（上海越研生物科技公司）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司）；RPMI1640培養(yǎng)基、細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）、LipofectamineTM2000試劑盒、Annexin VFITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；PCR引物、miR-204-3p抑制劑（anti-miR-204-3p組）及抑制劑陰性序列（antimiR-NC，上海生工生物工程有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司）；兔抗鼠細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、p21、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白（Bax）多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽還原酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇H9C2細(xì)胞，采用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對數(shù)生長期H9C2細(xì)胞以1×105個/孔接種于6孔板，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染anti-miR-204-3p、anti-miR-NC，6 h后更換培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞備用。

1.2.2細(xì)胞分組處理 未轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為對照組（Con組）、LPS組和不同劑量（4、8、16 μmol/L）地佐辛組，其中Con組細(xì)胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，LPS組細(xì)胞用含1μg/ml LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)，不同劑量地佐辛組細(xì)胞分別用含4、8、16 μmol/L地佐辛與含LPS的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)［5］。轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-204-3p的細(xì)胞均用含16 μmol/L地佐辛和1 μg/ml LPS的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)，分別記為16 μmol/L地佐辛+anti-miR-NC組 和16 μmol/L地 佐 辛+anti-miR-204-3p組。

1.2.3CCK-8檢測細(xì)胞增殖 將細(xì)胞以5×103個/孔接種于96孔板，按1.2.2分組處理。培養(yǎng)24 h后，加入10μl CCK-8溶液孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處光密度（OD）值。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 將細(xì)胞以

2.5×104個/孔接種于24孔板，按1.2.2分組處理。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，PBS清洗2次。參照AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒說明書，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.5Western blot檢測CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá) 將細(xì)胞以2.5×104個/孔接種于24孔板，按1.2.2分組處理。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，PBS清洗2次，加入RIPA試劑提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，分別置于CyclinD1（1∶500）、p21（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）和Bax（1∶1 000）一抗孵育液中4℃孵育過夜，置于山羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育液中7℃孵育1 h，加入顯影液避光顯影，曝光拍照。

左達(dá)邊笑邊搖頭，“沒時間了，離開這是非之地，你轉(zhuǎn)告張仲平，如果有來世，我會和他成為最好的朋友，現(xiàn)在，在我跳樓之前，你，快滾！”

1.2.6試劑盒檢測LDH、MDA、SOD和GSH-Px水平 將 細(xì)胞以2.5×104個/孔接 種 于24孔 板，按

1.2.2分組處理。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清和細(xì)胞，將上清3 500 r/min離心10 min，保留上清，按照LDH試劑盒說明書檢測上清中LDH水平。細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液充分裂解，3 500 r/min離心10 min，保留上清，參照MDA、SOD和GSH-Px試劑盒說明書檢測其水平。

1.2.7RT-qPCR檢測miR-204-3p表達(dá) 將細(xì)胞以

2.5×104個/孔接種于24孔板，按1.2.2分組處理。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共35個循環(huán)。引物序列為miR-204-3p F：5'-GTTTGCTGGGAAGGCAAAG-3'，R：5'-TGTTTTGCTGGGAAGGCAAA-3'；內(nèi)參U6 F：5'-GTCCAAGGCGCTAGAGCGCAGCT-3'，R：5'-CGAATGCTAAGGCTCTCGAC-3'。2-ΔΔCt法計算miR-204-3p相對表達(dá)。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以xˉ±s表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與Con組比較，LPS組H9C2細(xì)胞OD值及CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。與LPS組比較，不同劑量地佐辛組H9C2細(xì)胞OD值及CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性（P＜0.05，圖1、表1）。

表1 地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s，n=3）Tab.1 Effect of dezocine on proliferation and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=3）

表1 地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s，n=3）Tab.1 Effect of dezocine on proliferation and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=3）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with LPS group，2）P＜0.05；compared with 4 μmol/L dezocine group，3）P＜0.05；compared with 8μmol/L dezocine group，4）P＜0.05.

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圖1 地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡及增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of dezocine on LPS-induced H9C2 cells apoptosis and expressions of proliferation and apoptosisrelated proteins

2.2地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與Con組比較，LPS組H9C2細(xì)胞MDA含量及培養(yǎng)上清中LDH含量升高（P＜0.05），細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.05）。與LPS組比較，不同劑量地佐辛組H9C2細(xì)胞MDA含量及培養(yǎng)上清中LDH含量降低（P＜0.05），細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性（P＜0.05，表2）。

表2 地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響（±s，n=3）Tab.2 Effect of dezocine on oxidative stress of LPS-induced H9C2 cells（±s，n=3）

表2 地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響（±s，n=3）Tab.2 Effect of dezocine on oxidative stress of LPS-induced H9C2 cells（±s，n=3）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with LPS group，2）P＜0.05；compared with 4 μmol/L dezocine group，3）P＜0.05；compared with 8μmol/L dezocine group，4）P＜0.05.

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2.3地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞miR-204-3p表達(dá)的影響 與Con組比較，LPS組H9C2細(xì)胞miR-204-3p表達(dá)降低（P＜0.05）。與LPS組比較，不同劑量地佐辛組H9C2細(xì)胞miR-204-3p表達(dá)升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性（P＜0.05，表3）。

表3 地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞miR-204-3p表達(dá)的影響（±s，n=3）Tab.3 Effect of dezocine on expression of miR-204-3p in H9C2 induced by LPS（±s，n=3）

表3 地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞miR-204-3p表達(dá)的影響（±s，n=3）Tab.3 Effect of dezocine on expression of miR-204-3p in H9C2 induced by LPS（±s，n=3）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with LPS group，2）P＜0.05；compared with 4 μmol/L dezocine group，3）P＜0.05；compared with 8μmol/L dezocine group，4）P＜0.05.

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2.4干擾miR-204-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)地佐辛對LPS處理的H9C2細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與16 μmol/L地佐辛組或16 μmol/L地佐辛+anti-miR-NC組比較，16μmol/L地佐辛+anti-miR-204-3p組H9C2細(xì)胞OD值及CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），而16 μmol/L地佐辛組或16 μmol/L地佐辛+anti-miRNC組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖2、表4）。

圖2 干擾miR-204-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡及增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Interfering with miR-204-3p reversed effect of dezocine on LPS-induced H9C2 cells apoptosis and expressions of proliferation and apoptosis-related proteins

表4 干擾miR-204-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)地佐辛對LPS處理的H9C2細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s，n=3）Tab.4 Interfering with miR-204-3p reverses effect of dezocine on proliferation and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=3）

表4 干擾miR-204-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)地佐辛對LPS處理的H9C2細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s，n=3）Tab.4 Interfering with miR-204-3p reverses effect of dezocine on proliferation and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=3）

Note：Compared with 16μmol/L dezocine group，1）P＜0.05；compared with 16μmol/L dezocine+anti-miR-NC group，2）P＜0.05.

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2.5干擾miR-204-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與16 μmol/L地佐辛 組 或16 μmol/L地 佐 辛+anti-miR-NC組 比 較，16 μmol/L地 佐 辛+anti-miR-204-3p組H9C2細(xì) 胞MDA含量及培養(yǎng)上清中LDH含量升高（P＜0.05），細(xì)胞SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.05），而16 μmol/L地佐辛組或16 μmol/L地佐辛+anti-miR-NC組各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表5）。

表5 干擾miR-204-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響（±s，n=3）Tab.5 Interfering with miR-204-3p reverses effect of dezocine on oxidative stress of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=3）

表5 干擾miR-204-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響（±s，n=3）Tab.5 Interfering with miR-204-3p reverses effect of dezocine on oxidative stress of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=3）

Note：Compared with 16μmol/L dezocine group，1）P＜0.05；compared with 16μmol/L dezocine+anti-miR-NC group，2）P＜0.05.

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3 討論

LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁主要成分，可引起細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等，導(dǎo)致多器官功能損傷，是建立心肌細(xì)胞損傷模型的常用誘導(dǎo)劑［6］。本研究顯示，LPS可抑制H9C2細(xì)胞增殖，且促進(jìn)其氧化應(yīng)激和凋亡，與XU等［7］結(jié)果一致，說明LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型建立成功。

地佐辛作為一種阿片受體激動-拮抗劑，常用于手術(shù)麻醉［8］。研究顯示，地佐辛可能通過抑制HCN通道開放增加抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Cu/Zn-SOD和Mn-SOD表達(dá)減少β淀粉樣多肽誘發(fā)的原代大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡［9］。地佐辛可通過抑制Caspase-3表達(dá)和降低細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷［10］。本研究顯示，不同劑量地佐辛促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞增殖，且抑制其凋亡。細(xì)胞增殖和凋亡受多種基因調(diào)控。CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，其表達(dá)升高可加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖［11］。p21是細(xì)胞周期抑制因子，其表達(dá)增加則抑制細(xì)胞增殖［12］。Bax和Bcl-2參與調(diào)控細(xì)胞凋亡。Bax是促凋亡蛋白，其表達(dá)升高可加速細(xì)胞凋亡；而Bcl-2與Bax作用相反，其表達(dá)升高抑制細(xì)胞凋亡［13］。本研究顯示，不同劑量地佐辛抑制了LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞CyclinD1和Bax蛋白表達(dá)，促進(jìn)p21和Bcl-2蛋白表達(dá)，進(jìn)一步說明地佐辛可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞增殖，且抑制其凋亡。

氧化應(yīng)激是心肌損傷的重要機(jī)制之一［14］。正常生理條件下，機(jī)體組織處于氧化和抗氧化動態(tài)平衡。病理條件下，機(jī)體組織自由基生成速率超過清除速率，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。LDH是一種存在于細(xì)胞質(zhì)的糖酵解酶。細(xì)胞受損時，細(xì)胞膜通透性增加，LDH被立即釋放至細(xì)胞外，培養(yǎng)基中LDH活性高低可反映細(xì)胞受損程度［15］。MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，可反映機(jī)體組織氧化應(yīng)激水平［16］。SOD和GSH-Px是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除自由基，減輕自由基對機(jī)體組織的損傷［17］。本研究顯示，不同劑量地佐辛降低了LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH及細(xì)胞MDA水平，且提高了細(xì)胞SOD和GSH-Px活性，表明地佐辛減輕了LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

作為一種miRNA，miR-204-3p參與多種疾病發(fā)展進(jìn)程。目前對miR-204-3p的研究多集中于腫瘤。研究顯示，miR-204-3p在結(jié)腸癌、乳頭狀甲狀腺癌、腎細(xì)胞癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因作用［18-20］；而miR-204-3p在口腔鱗狀細(xì)胞癌和骨肉瘤等腫瘤中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤發(fā)展［21-22］。此外，miR-204-3p還參與非腫瘤發(fā)生發(fā)展。如HAN等［23］研究顯示，miR-204-3p可靶向下調(diào)Bdkrb2表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，改善足細(xì)胞功能，為糖尿病腎病治療提供了潛在靶點(diǎn)。本研究顯示，LPS抑制H9C2細(xì)胞miR-204-3p表達(dá)，而地佐辛則促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞miR-204-3p表達(dá)，且下調(diào)miR-204-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用及凋亡和氧化應(yīng)激的抑制作用，提示地佐辛通過上調(diào)miR-204-3p表達(dá)促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞增殖，且抑制其凋亡和氧化應(yīng)激。

綜上，地佐辛可抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，減輕心肌細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與上調(diào)細(xì)胞miR-204-3p表達(dá)有關(guān)。