魯美靜 文懷昌 汪 懿 王夢麗 張愷辰 陳永權(quán)
(安徽省蕪湖市皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院麻醉科,蕪湖 241000)
1.1材料 大鼠心肌細胞系H9C2(上海越研生物科技公司);胎牛血清(FBS,浙江天杭生物科技股份有限公司);RPMI1640培養(yǎng)基、細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、LipofectamineTM2000試劑盒、Annexin VFITC/PI細胞凋亡試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);Trizol試劑(美國Invitrogen公司);PCR引物、miR-204-3p抑制劑(anti-miR-204-3p組)及抑制劑陰性序列(antimiR-NC,上海生工生物工程有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司);兔抗鼠細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bax)多克隆抗體(美國Santa Cruz公司);乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽還原酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。
1.2方法
1.2.1細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇H9C2細胞,采用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對數(shù)生長期H9C2細胞以1×105個/孔接種于6孔板,采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染anti-miR-204-3p、anti-miR-NC,6 h后更換培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h,收集細胞備用。
1.2.2細胞分組處理 未轉(zhuǎn)染細胞分為對照組(Con組)、LPS組和不同劑量(4、8、16 μmol/L)地佐辛組,其中Con組細胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng),LPS組細胞用含1μg/ml LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng),不同劑量地佐辛組細胞分別用含4、8、16 μmol/L地佐辛與含LPS的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)[5]。轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-204-3p的細胞均用含16 μmol/L地佐辛和1 μg/ml LPS的培養(yǎng)基共同培養(yǎng),分別記為16 μmol/L地佐辛+anti-miR-NC組 和16 μmol/L地 佐 辛+anti-miR-204-3p組。
1.2.3CCK-8檢測細胞增殖 將細胞以5×103個/孔接種于96孔板,按1.2.2分組處理。培養(yǎng)24 h后,加入10μl CCK-8溶液孵育2 h,酶標儀檢測450 nm處光密度(OD)值。
1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 將細胞以
2.5×104個/孔接種于24孔板,按1.2.2分組處理。培養(yǎng)24 h后收集細胞,PBS清洗2次。參照AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒說明書,采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。
1.2.5Western blot檢測CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表達 將細胞以2.5×104個/孔接種于24孔板,按1.2.2分組處理。培養(yǎng)24 h后收集細胞,PBS清洗2次,加入RIPA試劑提取細胞總蛋白,BCA法進行蛋白定量,行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉溶液封閉1 h,分別置于CyclinD1(1∶500)、p21(1∶500)、Bcl-2(1∶1 000)和Bax(1∶1 000)一抗孵育液中4℃孵育過夜,置于山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育液中7℃孵育1 h,加入顯影液避光顯影,曝光拍照。
左達邊笑邊搖頭,“沒時間了,離開這是非之地,你轉(zhuǎn)告張仲平,如果有來世,我會和他成為最好的朋友,現(xiàn)在,在我跳樓之前,你,快滾!”
1.2.6試劑盒檢測LDH、MDA、SOD和GSH-Px水平 將 細胞以2.5×104個/孔接 種 于24孔 板,按
1.2.2分組處理。培養(yǎng)24 h后收集細胞上清和細胞,將上清3 500 r/min離心10 min,保留上清,按照LDH試劑盒說明書檢測上清中LDH水平。細胞中加入細胞裂解液充分裂解,3 500 r/min離心10 min,保留上清,參照MDA、SOD和GSH-Px試劑盒說明書檢測其水平。
1.2.7RT-qPCR檢測miR-204-3p表達 將細胞以
2.5×104個/孔接種于24孔板,按1.2.2分組處理。培養(yǎng)24 h后收集細胞,Trizol試劑提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進行PCR擴增。擴增條件:95℃5 min,95℃10 s,60℃30 s,72℃30 s,共35個循環(huán)。引物序列為miR-204-3p F:5'-GTTTGCTGGGAAGGCAAAG-3',R:5'-TGTTTTGCTGGGAAGGCAAA-3';內(nèi)參U6 F:5'-GTCCAAGGCGCTAGAGCGCAGCT-3',R:5'-CGAATGCTAAGGCTCTCGAC-3'。2-ΔΔCt法計算miR-204-3p相對表達。
1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件分析數(shù)據(jù),計量資料以xˉ±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞增殖和凋亡的影響 與Con組比較,LPS組H9C2細胞OD值及CyclinD1、Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05),細胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達升高(P<0.05)。與LPS組比較,不同劑量地佐辛組H9C2細胞OD值及CyclinD1、Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05),細胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達降低(P<0.05),且呈劑量依賴性(P<0.05,圖1、表1)。
表1 地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞增殖和凋亡的影響(±s,n=3)Tab.1 Effect of dezocine on proliferation and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS(±s,n=3)
表1 地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞增殖和凋亡的影響(±s,n=3)Tab.1 Effect of dezocine on proliferation and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS(±s,n=3)
Note:Compared with Con group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 4 μmol/L dezocine group,3)P<0.05;compared with 8μmol/L dezocine group,4)P<0.05.
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圖1 地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞凋亡及增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Fig.1 Effect of dezocine on LPS-induced H9C2 cells apoptosis and expressions of proliferation and apoptosisrelated proteins
2.2地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞氧化應(yīng)激的影響 與Con組比較,LPS組H9C2細胞MDA含量及培養(yǎng)上清中LDH含量升高(P<0.05),細胞中SOD和GSH-Px活性降低(P<0.05)。與LPS組比較,不同劑量地佐辛組H9C2細胞MDA含量及培養(yǎng)上清中LDH含量降低(P<0.05),細胞中SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05),且呈劑量依賴性(P<0.05,表2)。
表2 地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞氧化應(yīng)激的影響(±s,n=3)Tab.2 Effect of dezocine on oxidative stress of LPS-induced H9C2 cells(±s,n=3)
表2 地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞氧化應(yīng)激的影響(±s,n=3)Tab.2 Effect of dezocine on oxidative stress of LPS-induced H9C2 cells(±s,n=3)
Note:Compared with Con group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 4 μmol/L dezocine group,3)P<0.05;compared with 8μmol/L dezocine group,4)P<0.05.
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2.3地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞miR-204-3p表達的影響 與Con組比較,LPS組H9C2細胞miR-204-3p表達降低(P<0.05)。與LPS組比較,不同劑量地佐辛組H9C2細胞miR-204-3p表達升高(P<0.05),且呈劑量依賴性(P<0.05,表3)。
表3 地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞miR-204-3p表達的影響(±s,n=3)Tab.3 Effect of dezocine on expression of miR-204-3p in H9C2 induced by LPS(±s,n=3)
表3 地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞miR-204-3p表達的影響(±s,n=3)Tab.3 Effect of dezocine on expression of miR-204-3p in H9C2 induced by LPS(±s,n=3)
Note:Compared with Con group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.05;compared with 4 μmol/L dezocine group,3)P<0.05;compared with 8μmol/L dezocine group,4)P<0.05.
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2.4干擾miR-204-3p表達逆轉(zhuǎn)地佐辛對LPS處理的H9C2細胞增殖和凋亡的影響 與16 μmol/L地佐辛組或16 μmol/L地佐辛+anti-miR-NC組比較,16μmol/L地佐辛+anti-miR-204-3p組H9C2細胞OD值及CyclinD1、Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05),細胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達升高(P<0.05),而16 μmol/L地佐辛組或16 μmol/L地佐辛+anti-miRNC組各指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖2、表4)。
圖2 干擾miR-204-3p表達逆轉(zhuǎn)地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞凋亡及增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Fig.2 Interfering with miR-204-3p reversed effect of dezocine on LPS-induced H9C2 cells apoptosis and expressions of proliferation and apoptosis-related proteins
表4 干擾miR-204-3p表達逆轉(zhuǎn)地佐辛對LPS處理的H9C2細胞增殖和凋亡的影響(±s,n=3)Tab.4 Interfering with miR-204-3p reverses effect of dezocine on proliferation and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS(±s,n=3)
表4 干擾miR-204-3p表達逆轉(zhuǎn)地佐辛對LPS處理的H9C2細胞增殖和凋亡的影響(±s,n=3)Tab.4 Interfering with miR-204-3p reverses effect of dezocine on proliferation and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS(±s,n=3)
Note:Compared with 16μmol/L dezocine group,1)P<0.05;compared with 16μmol/L dezocine+anti-miR-NC group,2)P<0.05.
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2.5干擾miR-204-3p表達逆轉(zhuǎn)地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞氧化應(yīng)激的影響 與16 μmol/L地佐辛 組 或16 μmol/L地 佐 辛+anti-miR-NC組 比 較,16 μmol/L地 佐 辛+anti-miR-204-3p組H9C2細 胞MDA含量及培養(yǎng)上清中LDH含量升高(P<0.05),細胞SOD和GSH-Px活性降低(P<0.05),而16 μmol/L地佐辛組或16 μmol/L地佐辛+anti-miR-NC組各指標差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,表5)。
表5 干擾miR-204-3p表達逆轉(zhuǎn)地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞氧化應(yīng)激的影響(±s,n=3)Tab.5 Interfering with miR-204-3p reverses effect of dezocine on oxidative stress of H9C2 cells induced by LPS(±s,n=3)
表5 干擾miR-204-3p表達逆轉(zhuǎn)地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞氧化應(yīng)激的影響(±s,n=3)Tab.5 Interfering with miR-204-3p reverses effect of dezocine on oxidative stress of H9C2 cells induced by LPS(±s,n=3)
Note:Compared with 16μmol/L dezocine group,1)P<0.05;compared with 16μmol/L dezocine+anti-miR-NC group,2)P<0.05.
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LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁主要成分,可引起細胞凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等,導(dǎo)致多器官功能損傷,是建立心肌細胞損傷模型的常用誘導(dǎo)劑[6]。本研究顯示,LPS可抑制H9C2細胞增殖,且促進其氧化應(yīng)激和凋亡,與XU等[7]結(jié)果一致,說明LPS誘導(dǎo)的心肌細胞損傷模型建立成功。
地佐辛作為一種阿片受體激動-拮抗劑,常用于手術(shù)麻醉[8]。研究顯示,地佐辛可能通過抑制HCN通道開放增加抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Cu/Zn-SOD和Mn-SOD表達減少β淀粉樣多肽誘發(fā)的原代大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞凋亡[9]。地佐辛可通過抑制Caspase-3表達和降低細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷[10]。本研究顯示,不同劑量地佐辛促進LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞增殖,且抑制其凋亡。細胞增殖和凋亡受多種基因調(diào)控。CyclinD1是細胞周期調(diào)控蛋白,其表達升高可加速細胞周期進程,促進細胞增殖[11]。p21是細胞周期抑制因子,其表達增加則抑制細胞增殖[12]。Bax和Bcl-2參與調(diào)控細胞凋亡。Bax是促凋亡蛋白,其表達升高可加速細胞凋亡;而Bcl-2與Bax作用相反,其表達升高抑制細胞凋亡[13]。本研究顯示,不同劑量地佐辛抑制了LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞CyclinD1和Bax蛋白表達,促進p21和Bcl-2蛋白表達,進一步說明地佐辛可促進LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞增殖,且抑制其凋亡。
氧化應(yīng)激是心肌損傷的重要機制之一[14]。正常生理條件下,機體組織處于氧化和抗氧化動態(tài)平衡。病理條件下,機體組織自由基生成速率超過清除速率,產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。LDH是一種存在于細胞質(zhì)的糖酵解酶。細胞受損時,細胞膜通透性增加,LDH被立即釋放至細胞外,培養(yǎng)基中LDH活性高低可反映細胞受損程度[15]。MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一,可反映機體組織氧化應(yīng)激水平[16]。SOD和GSH-Px是機體內(nèi)重要的抗氧化酶,可清除自由基,減輕自由基對機體組織的損傷[17]。本研究顯示,不同劑量地佐辛降低了LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞培養(yǎng)上清中LDH及細胞MDA水平,且提高了細胞SOD和GSH-Px活性,表明地佐辛減輕了LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞氧化應(yīng)激損傷。
作為一種miRNA,miR-204-3p參與多種疾病發(fā)展進程。目前對miR-204-3p的研究多集中于腫瘤。研究顯示,miR-204-3p在結(jié)腸癌、乳頭狀甲狀腺癌、腎細胞癌等腫瘤中表達下調(diào),發(fā)揮抑癌基因作用[18-20];而miR-204-3p在口腔鱗狀細胞癌和骨肉瘤等腫瘤中表達上調(diào),促進腫瘤發(fā)展[21-22]。此外,miR-204-3p還參與非腫瘤發(fā)生發(fā)展。如HAN等[23]研究顯示,miR-204-3p可靶向下調(diào)Bdkrb2表達抑制高糖誘導(dǎo)的足細胞凋亡,改善足細胞功能,為糖尿病腎病治療提供了潛在靶點。本研究顯示,LPS抑制H9C2細胞miR-204-3p表達,而地佐辛則促進LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞miR-204-3p表達,且下調(diào)miR-204-3p表達逆轉(zhuǎn)了地佐辛對LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞增殖的促進作用及凋亡和氧化應(yīng)激的抑制作用,提示地佐辛通過上調(diào)miR-204-3p表達促進LPS誘導(dǎo)的H9C2細胞增殖,且抑制其凋亡和氧化應(yīng)激。
綜上,地佐辛可抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激,減輕心肌細胞損傷,其作用機制可能與上調(diào)細胞miR-204-3p表達有關(guān)。