崔勤濤 王學(xué)惠 劉永強(qiáng) 劉曉晨 段長(zhǎng)恩（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管外科，新鄉(xiāng) 453100）

急性心肌梗死是指冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)急性堵塞，導(dǎo)致部分心肌缺血性壞死的一種嚴(yán)重冠心病，心肌缺血后實(shí)現(xiàn)再灌注，雖然可以有效恢復(fù)血流、限制心肌梗死范圍，但會(huì)加重心肌缺血后損傷，表現(xiàn)為心功能障礙、內(nèi)皮功能損傷、心肌組織代謝異常、細(xì)胞壞死及凋亡等［1-2］。心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中，涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、心肌纖維能量代謝、鈣超載等多種生理過(guò)程的相互作用［3-4］。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB可調(diào)節(jié)許多促炎細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子，參與心肌缺血再灌注損傷［5］。隨著基因組學(xué)的飛速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）可能參與各類冠心病的發(fā)生發(fā)展［6］。lncRNA核內(nèi)富集轉(zhuǎn)錄物1（nuclear enriched abundant transcript 1，lncRNA Neat1）表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，可與核蛋白物質(zhì)結(jié)合形成亞核結(jié)構(gòu)paraspeckle，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝，參與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾?。?］。最新研究表明，lncRNA Neat1可減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷［7］。同時(shí)，ZOU等［8］研究發(fā)現(xiàn)，沉默lncRNA Neat1可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性，抑制心肌細(xì)胞的凋亡。但lncRNA Neat1是否可介導(dǎo)NF-κB作用于心肌缺血再灌注損傷尚不清楚，基于此，本研究通過(guò)構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，深入探討lncRNA Neat1介導(dǎo)NF-κB在心肌缺血再灌注損傷的作用，以期為臨床治療心肌缺血再灌注損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物48只健康Wistar大鼠，清潔級(jí)，雄性，體質(zhì)量280～320 g，6周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK（京）2019-0015，大鼠均飼養(yǎng)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（豫）2018-0320，各項(xiàng)操作均符合3R原則，倫理審批號(hào)為IACUC-2020-08。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 無(wú)序序列和lncRNA Neat1慢病毒干擾載體由北京海創(chuàng)科業(yè)生物技術(shù)有限公司提供；ELISA試劑盒、生化試劑盒、蛋白二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；蛋白一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling；lncRNA Neat1、IL-6和TNF-α引物由上海信帆生物科技有限公司提供；SYBR Premix Dimer Eraser熒光劑購(gòu)自日本TaKaRa。PhysioSuite呼吸機(jī)購(gòu)自美國(guó)Kent；Vevo770動(dòng)物超聲儀購(gòu)自加拿大Visual Sinics。

1.2方法

1.2.1心肌缺血再灌注大鼠模型的構(gòu)建 腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，進(jìn)行氣管插管后打開PhysioSuite呼吸機(jī)，距離胸骨左緣約0.5 cm處作切口，打開胸腔、暴露心臟，于左心耳根部下方2 mm進(jìn)針，肺動(dòng)脈圓錐旁出針結(jié)扎左前降支，當(dāng)心尖處變蒼白、心臟搏動(dòng)減弱提示左前降支結(jié)扎成功，結(jié)扎30 min后解開結(jié)扎線，恢復(fù)灌注120 min，逐層縫合后關(guān)胸，術(shù)后注意保溫。

1.2.2動(dòng)物分組與處理 將48只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、shRNA NC組和sh-Neat1組，每組12只，除假手術(shù)組外，其余各組大鼠采用左前降支結(jié)扎法構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，假手術(shù)組開胸后僅穿線但不結(jié)扎，其他操作一致。shRNA NC組和sh-Neat1組建模前24 h于心肌表面選取5個(gè)注射點(diǎn)，分別注射無(wú)序序列和lncRNA Neat1慢病毒干擾載體（正向序列：5'-gatccATTCGTCAGGGTTGTAAACGAATTTACAACCCTACTGACGAATTTTTTTg-3'，反 向 序 列：5'-aattcAAAAAAATTCGTCAGTAGGGTTGTAAATTCGTTTACAACCCTACTGACGAATg-3'），注射10μl，病毒滴度為2×108TU/ml，共50μl，假手術(shù)組和模型組注射等量生理鹽水。

1.2.3超聲檢測(cè)大鼠心功能變化 各組大鼠處理結(jié)束后，采用Vevo770動(dòng)物超聲儀采集二維心臟超聲圖像，記錄心率（heart rate，HR）和左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.2.4ELISA檢測(cè)血清心損傷標(biāo)志物 各組大鼠處理結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血，分離血清置于-20℃待測(cè)。參照ELISA試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)血清肌紅蛋白（myoglobin，Mb）、心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin，cTnⅠ）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）的含量。

1.2.5生化試劑盒檢測(cè)大鼠血清SOD和MDA含量 取適量血清，參照生化試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

1.2.6大鼠心肌組織病理染色的觀察 各組大鼠處理結(jié)束后，快速分離大鼠心肌組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色和MASSON染色，顯微鏡下觀察大鼠心肌組織病理變化情況，其中MASSON染色后心肌組織呈紅色，癜痕組織呈藍(lán)色。

1.2.7Western blot檢測(cè)心肌組織中相關(guān)蛋白的表達(dá) 預(yù)先配制蛋白裂解液，取適量心肌組織加入蛋白裂解液，勻漿后置于冰上裂解40 min，4℃、12 000 g離心10 min，吸取上清液測(cè)定蛋白濃度，取等量蛋白水浴變性后點(diǎn)樣至SDS-PAGE凝膠，于90 V下電泳90 min，再以恒定電流300 mA將蛋白條帶電轉(zhuǎn)至PVDF膜，取出PVDF膜浸泡至5%脫脂奶粉中，室溫下孵育90 min，再分別置于一抗中，4℃孵育過(guò)夜，再置于二抗中，37℃孵育40 min，最后進(jìn)行顯影。以ACTIN為內(nèi)參，計(jì)算α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、TGF-β、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、NF-κB P65及p-NF-κB P65的相對(duì)蛋白表達(dá)。

1.2.8熒光定量PCR檢測(cè)心肌組織中l(wèi)ncRNA Neat1、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá) 取適量心肌組織，根據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書，提取總RNA，再經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA鏈，混合SYBR Premix Dimer Eraser熒光劑，進(jìn)行熒光定量PCR。采用2-ΔΔCt法計(jì) 算lncRNA Neat1、IL-6和TNF-α mRNA的 表達(dá)量。

1.2.9免疫熒光檢測(cè)NF-κB P65細(xì)胞核轉(zhuǎn)位情況 取心肌組織石蠟切片（厚度2μm），置于丙酮中浸泡20 min，用10 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液高溫抗原修復(fù)20 min，置于1%Triton中浸泡1 h，血清封閉1 h后，孵育NF-κB P65抗體（稀釋比為1∶50），4℃下反應(yīng)過(guò)夜，然后孵育FITC抗兔熒光二抗（稀釋比為1∶50），37℃反應(yīng)1 h，最后經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理，以±s表示，各組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠心肌組織中l(wèi)ncRNA Neat1的表達(dá)

熒光定量PCR檢測(cè)心肌組織中l(wèi)ncRNA Neat1水平，結(jié)果顯示，假手術(shù)組、模型組、shRNA NC組及sh-Neat1組心肌組織中l(wèi)ncRNA Neat1表達(dá)分別為

1.00±0.15、8.34±0.58、8.29±0.46、1.92±0.37，各組lncRNA Neat1的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=446.850，P=0.000，n=5）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠lncRNA Neat1表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，sh-Neat1組lncRNA Neat1表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），但模型組和shRNA NC組lncRNA Neat1表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示sh-Neat1干擾lncRNA Neat1成功。

2.2各組大鼠心損傷標(biāo)志物水平的比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠外周血Mb、cTnⅠ、CK-MB水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，sh-Neat1組Mb、cTnⅠ、CK-MB水平降低（P＜0.05），但模型組和shRNA NC組的上述指標(biāo)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心損傷標(biāo)志物水平的比較（±s，n=5）Tab.1 Comparison on levels of myocardial injury markers among all groups（±s，n=5）

表1 各組大鼠心損傷標(biāo)志物水平的比較（±s，n=5）Tab.1 Comparison on levels of myocardial injury markers among all groups（±s，n=5）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

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2.3各組大鼠心功能情況的比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠HR和LVEF降低（P＜0.05）；與模型組比較，sh-Neat1組HR和LVEF升高（P＜0.05），但模型組和shRNA NC組上述指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心功能情況的比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of cardiac function among all groups（±s，n=5）

表2 各組大鼠心功能情況的比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of cardiac function among all groups（±s，n=5）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

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2.4各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠MDA升高，SOD降低（P＜0.05）；與模型組比較，sh-Neat1組MDA降低，SOD升高（P＜0.05），但模型組和shRNA NC組上述指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的比較（±s，n=5）Tab.3 Comparison on levels of oxidative stress indexes levels in rats of each group（±s，n=5）

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的比較（±s，n=5）Tab.3 Comparison on levels of oxidative stress indexes levels in rats of each group（±s，n=5）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

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2.5各組大鼠心肌組織病理變化的比較 如圖1 HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列整齊，纖維結(jié)構(gòu)清晰；模型組和shRNA NC組心肌排列紊亂，細(xì)胞間隙加大；sh-Neat1組心肌纖維排列趨于整齊，細(xì)胞間隙較模型組減小。

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化的比較Fig.1 Comparison of pathological changes in myocardial tissues of rats in each group

2.6各組大鼠心肌纖維化情況的比較 如圖2，MASSON染色顯示，假手術(shù)組表現(xiàn)為正常心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，無(wú)明顯的細(xì)胞損傷和壞死；模型組和shRNA NC組有大量纖維癜痕組織形成；與模型組相比，sh-Neat1組纖維癜痕組織明顯減少。

圖2 各組大鼠心肌纖維化情況的比較Fig.2 Comparison of myocardial fibrosis in each group

2.7各組大鼠心肌組織中纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中α-SMA、TGF-β、FN表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，sh-Neat1組α-SMA、TGF-β、FN表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），但模型組和shRNA NC組比較上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、表4。

表4 各組大鼠心肌組織中纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的比較（±s，n=5）Tab.4 Comparison on expressions of fibrosis-related proteins in myocardial tissues of rats in each group（±s，n=5）

表4 各組大鼠心肌組織中纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的比較（±s，n=5）Tab.4 Comparison on expressions of fibrosis-related proteins in myocardial tissues of rats in each group（±s，n=5）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

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圖3 各組大鼠心肌組織中纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 Expressions of fibrosis-related proteins in myocardial tissue of rats in each group

2.8各組大鼠心肌組織IL-6、TNF-α及NF-κB P65磷酸化水平的比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織IL-6和TNF-α mRNA、p-NF-κB P65/NF-κB P65水平上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，sh-Neat1組IL-6和TNF-α mRNA、p-NF-κB P65/NF-κB P65水平下調(diào)（P＜0.05），但模型組和shRNA NC組比較上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4、表5。

表5 各組大鼠心肌組織IL-6、TNF-α及NF-κB P65磷酸化水平的比較（±s，n=5）Tab.5 Comparison on phosphorylation levels of IL-6，TNF-α and NF-κB P65 in myocardial tissues rats in each group（±s，n=5）

表5 各組大鼠心肌組織IL-6、TNF-α及NF-κB P65磷酸化水平的比較（±s，n=5）Tab.5 Comparison on phosphorylation levels of IL-6，TNF-α and NF-κB P65 in myocardial tissues rats in each group（±s，n=5）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

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圖4 各組大鼠血清心肌組織NF-κB P65磷酸化表達(dá)Fig.3 Comparison on expression of NF-κB P65 phosphorylation in serum myocardial tissues of rats in each group

2.9各組大鼠NF-κB P65細(xì)胞核轉(zhuǎn)位情況 如圖5，假手術(shù)組心肌細(xì)胞NF-κB P65表達(dá)于胞漿，模型組和shRNA NC組NF-κB P65在胞漿和胞核均有表達(dá)，但以胞核表達(dá)為主，而sh-Neat1組NF-κB P65表達(dá)以胞漿為主。

圖5 各組大鼠NF-κB P65細(xì)胞核轉(zhuǎn)位情況Fig.5 Nuclear translocation of NF-κB P65 cells in each group

3 討論

再灌注是治療心肌缺血的必要途徑，但無(wú)法避免會(huì)加重心肌損傷［9］。因此，了解心肌缺血再灌注損傷具體機(jī)制，對(duì)于其臨床防控具有重要的臨床意義。Neat1廣泛表達(dá)于各種組織中，對(duì)于多種生物學(xué)活動(dòng)具有調(diào)控作用［10］。早期研究發(fā)現(xiàn)，Neat1作為促癌因子，參與肺癌、宮頸癌、肝癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［11-13］。近年來(lái)，研究顯示，WU等［14］通過(guò)建立心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，發(fā)現(xiàn)敲低Neat1可能通過(guò)調(diào)控凋亡通路蛋白，抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。但Neat1在心肌缺血再灌注損傷中的具體作用機(jī)制，仍有待進(jìn)一步分析。

本研究結(jié)果顯示，Neat1在心肌缺血再灌損傷大鼠模型中高表達(dá)，提示Neat1可能參與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展。心肌缺血再灌注損傷后，心肌收縮功能障礙，導(dǎo)致LVEF降低、HR升高，干擾Neat1表達(dá)后明顯提高模型大鼠LVEF、降低HR，保護(hù)大鼠心功能，可能與減少M(fèi)b、cTnⅠ、CK-MB釋放，減輕心肌細(xì)胞損傷有關(guān)。慢性纖維化是機(jī)體應(yīng)對(duì)缺血損傷的一種修復(fù)過(guò)程，主要表現(xiàn)為間質(zhì)纖維化和膠原沉著（FN、膠原蛋白等），α-SMA可反映成纖維化細(xì)胞的活化狀態(tài)，而TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在多種疾病的纖維化中有多重調(diào)節(jié)作用［15-16］。心肌缺血再灌注損傷后，心肌組織有大量纖維癜痕組織形成，心肌組織中α-SMA、TGF-β、FN表達(dá)上調(diào)，干擾Neat1后心肌纖維化程度減輕，可能與下調(diào)α-SMA、TGF-β、FN水平有關(guān)。同時(shí)，氧化應(yīng)激損傷在缺血再灌注過(guò)程中也有重要的生理意義，CHEN等［17］研究發(fā)現(xiàn)，Neat1可促進(jìn)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，參與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。本研究中，干擾Neat1表達(dá)后可以提高心肌SOD水平，減少M(fèi)DA的合成，表明干擾Neat1對(duì)氧化應(yīng)激水平的抑制，可能是減輕心肌損傷的途徑之一。

心肌組織損傷是多因素共同作用的結(jié)果，既往研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)是心肌缺血再灌注損傷的主要因素之一［18］。P65是NF-κB的一個(gè)亞基，正常生理狀態(tài)下，NF-κB P65與NF-κB抑制因子（ⅠκB）以結(jié)合形式分布于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)心肌缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)，刺激IκB的磷酸化和泛素化，磷酸化NF-κB P65將轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，會(huì)增加多種炎癥因子的表達(dá)，加劇心肌損傷［19-20］。本研究顯示，心肌缺血再灌注損傷中NF-κB P65磷酸化水平明顯升高，NF-κB P65表達(dá)以胞核為主，提示損傷狀態(tài)下，NF-κB P65異常激活進(jìn)行核轉(zhuǎn)移。干擾心肌中Neat1表達(dá)后，NF-κB P65表達(dá)以胞漿為主，NF-κB P65磷酸化水平明顯降低，炎癥因子IL-6、TNF-α mRNA水平也降低，提示干擾Neat1可抑制NF-κB P65的核移位，從而減輕心肌缺血再灌注損傷。

綜上所述，lncRNA Neat1在心肌缺血再灌注損傷中高表達(dá)，干擾lncRNA Neat1后可保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷，改善心肌纖維化，可能與減少NF-κB P65細(xì)胞核轉(zhuǎn)位有關(guān)。心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，Neat1是否還可通過(guò)調(diào)控其他途徑作用于心肌缺血再灌注損傷，還有待進(jìn)一步研究。