金 亞 張教國（滕州市中心人民醫(yī)院兒科，滕州 277500）

急性白血病是兒童常見惡性腫瘤之一，其中急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是其中的重要亞型，是導(dǎo)致白血病患兒死亡的主要原因。AML的治療主要包括聯(lián)合化療及造血干細(xì)胞移植，但白血病細(xì)胞易對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，極大影響治療效果，降低患兒生存率［1-3］。miR-200b是miR-200家族成員，能參與介導(dǎo)細(xì)胞自我更新、分化、增殖與凋亡過程，在卵巢癌、肝癌、AML中異常低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)，可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖及肝癌組織血管生成，具有抑癌作用［4-6］；ZEB1基因可促進(jìn)癌細(xì)胞遷移過程中的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化作用，在乳腺癌、AML中高表達(dá)，可作為AML診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，miR-200b可顯著降低ZEB1的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，并減弱癌細(xì)胞的抗雌激素類抗癌藥三苯氧胺耐藥性［7-8］，因而miR-200b/ZEB1軸可能也是改善阿柔比星耐藥的潛在作用靶點(diǎn)。LncRNA XIST是直接靶向調(diào)控miR-200b-3p表達(dá)的長鏈非編碼RNA，在肝癌、AML中表達(dá)明顯增高，沉默LncRNA XIST基因后，miR-200b-3p表達(dá)增強(qiáng)，肝癌細(xì)胞生長及體內(nèi)腫瘤形成受到抑制，并可抑制AML細(xì)胞活性與阿霉素耐藥性，促進(jìn)其凋亡［9-10］。但LncRNA XIST是否可以調(diào)控miR-200b/ZEB1軸進(jìn)而影響AML阿柔比星耐藥性目前尚不清楚，本文通過建立人AML阿柔比星耐藥細(xì)胞株K562/ADM，并對此進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與細(xì)胞 人AML細(xì)胞系K562、RPMI-1640培養(yǎng)基、特級胎牛血清購自上海繼和生物科技有限公司；阿柔比星購自深圳振強(qiáng)生物技術(shù)有限公司；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、LipofectamineTM2000、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（CA1050）、CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；miR-200b、U6、LncRNA XIST、GAPDH、ZEB1及 多 藥 耐 藥1（multidrug resistance 1，MDR1）引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；LncRNA XIST inhibitor、LncRNA XIST inhibitor陰性對照購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；兔源ZEB1一抗、兔源P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）一抗購自美國Abcam公司。

1.1.2主要儀器HBS-1096C酶標(biāo)儀購自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BriCyte E6流式細(xì)胞儀購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；QuantStudio 6 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；1658033小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1人AML阿柔比星耐藥細(xì)胞株K562/ADM建立 將購買的人AML細(xì)胞株K562復(fù)蘇，以RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗接種培養(yǎng)，以終濃度0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 μg/ml［11］的阿柔比星依次處理K562細(xì)胞各24 h，直至細(xì)胞在5 μg/ml的阿柔比星中穩(wěn)定生長，即獲得人AML阿柔比星耐藥細(xì)胞株K562/ADM。

1.2.2K562及K562/ADM細(xì) 胞中LncRNA XIST水平檢測 取K562及K562/ADM細(xì)胞傳代培養(yǎng)，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)得到模板cDNA，使用2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，具體步驟及反應(yīng)條件設(shè)定參照說明書進(jìn)行，運(yùn)用算法2-ΔΔCt分析所得數(shù)據(jù)，得出LncRNA XIST相對表達(dá)水平，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.2.3細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染及標(biāo)本收集 取K562/ADM細(xì)胞傳代，于24孔培養(yǎng)板中接種培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，隨機(jī)分為對照組、LncRNA XIST inhibitor組、阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor陰性對照組、阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor組，參照文獻(xiàn)［10］和說明書，以LipofectamineTM2000分組轉(zhuǎn)染LncRNA XIST inhibitor、LncRNA XIST inhibitor陰性對照，并以O(shè)pti-MEM減血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，更換新的細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)以5μg/ml的阿柔比星處理，24 h后收集各組細(xì)胞，重復(fù)3次，收集3份細(xì)胞標(biāo)本。

1.2.4細(xì)胞增殖檢測 取K562/ADM細(xì)胞傳代接種于96孔培養(yǎng)板，按照1.2.3中方法分組轉(zhuǎn)染并處理（每組6個重復(fù)孔），另選6個孔不接種細(xì)胞作為空白對照組，24 h后更換新的細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)加入CCK-8試劑，采用酶標(biāo)儀測得2 h后各孔吸光度（450 nm波長），記為A值，計(jì)算細(xì)胞存活率（%）=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白對照組）/（A對照組-A空白對照組）×100%。

1.2.5細(xì)胞凋亡檢測 取1.2.3中收集的各組細(xì)胞標(biāo)本1份，加入PBS重懸、計(jì)數(shù)，取含約1×106個細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液離心，洗滌細(xì)胞沉淀后，以Annexin V-FITC 10 μl、PI 5 μl避光孵育，離心、洗滌細(xì)胞沉淀，重懸，混勻后上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6細(xì) 胞LncRNA XIST、miR-200b及ZEB1、MDR1 mRNA水平檢測 取1.2.3中收集的各組細(xì)胞標(biāo)本1份，按照1.2.2中方法進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，選用GAPDH作LncRNA XIST、ZEB1、MDR1的內(nèi)參基因，選用U6作miR-200b的內(nèi)參基因，運(yùn)用算法2-ΔΔCt分析所得數(shù)據(jù)，得出各基因mRNA相對表達(dá)水平，引物序列見表1。

1.2.7細(xì)胞ZEB1和P-gp蛋白表達(dá)檢測 取1.2.3中收集的各組細(xì)胞標(biāo)本1份，提取總蛋白后測量其濃度，并調(diào)至各組相同后煮沸，取各組蛋白樣品液20μl，110 V恒壓下電泳90 min，接著同樣電壓下濕轉(zhuǎn)90 min，所得硝酸纖維素膜封閉后，截下β-actin、P-gp、ZEB1三條目的條帶，孵育一抗，洗膜，孵育二抗，洗膜，顯色，拍攝，在Image J軟件中打開蛋白條帶圖片，定量分析各蛋白灰度值，最終獲得目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，輸入SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩之間比較行LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1LncRNA XIST在AML細(xì) 胞K562及AML耐 藥細(xì)胞K562/ADM中的表達(dá) 與K562細(xì)胞相比，Lnc-RNA XIST在K562/ADM細(xì)胞中表達(dá)明顯升高（P＜0.05），見表2。

表2 K562和K562/ADM細(xì)胞中LncRNA XIST水平（±s，n=6）Tab.2 LncRNA XIST levels in K562 and K562/ADM cells（±s，n=6）

表2 K562和K562/ADM細(xì)胞中LncRNA XIST水平（±s，n=6）Tab.2 LncRNA XIST levels in K562 and K562/ADM cells（±s，n=6）

Note：Compared with K562 cells，1）P＜0.05.

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2.2各組細(xì)胞存活率 與對照組相比，阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05），LncRNA XIST inhibitor組、阿柔比星+Lnc-RNA XIST inhibitor陰性對照組細(xì)胞存活率無明顯改變（P＞0.05）；與LncRNA XIST inhibitor組相比，阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組細(xì)胞存活率（±s，n=6）Tab.3 Cell survival rate of each group（±s，n=6）

表3 各組細(xì)胞存活率（±s，n=6）Tab.3 Cell survival rate of each group（±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Lnc-RNA XIST inhibitor group，2）P＜0.05.

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2.3各組細(xì)胞凋亡率 與對照組相比，阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），LncRNA XIST inhibitor組、阿柔比星+Lnc-RNA XIST inhibitor陰性對照組細(xì)胞凋亡率無明顯改變（P＞0.05）；與LncRNA XIST inhibitor組相比，阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），見圖1、表4。

表4 各組細(xì)胞凋亡率（±s，n=6）Tab.4 Apoptosis rate of each group（±s，n=6）

表4 各組細(xì)胞凋亡率（±s，n=6）Tab.4 Apoptosis rate of each group（±s，n=6）

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圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況Fig.1 Apoptosis was detected by flow cytometry

2.4各組細(xì)胞LncRNA XIST、miR-200b及ZEB1、MDR1 mRNA表達(dá)水平 與對照組、阿柔比星+Lnc-RNA XIST inhibitor陰性對照組分別相比，阿柔比

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Lnc-RNA XIST inhibitor group，2）P＜0.05.星+LncRNA XIST inhibitor組、LncRNA XIST inhibitor組LncRNA XIST、ZEB1及MDR1 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），miR-200b表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor陰性對照組細(xì)胞各指標(biāo)無明顯改變（P＞0.05），見表5。

表5 各組細(xì)胞LncRNA XIST、miR-200b及ZEB1、MDR1 mRNA表達(dá)水平（±s，n=6）Tab.5 Expression levels of LncRNA XIST，miR-200b，ZEB1 and MDR1 mRNA in cells of each group（±s，n=6）

表5 各組細(xì)胞LncRNA XIST、miR-200b及ZEB1、MDR1 mRNA表達(dá)水平（±s，n=6）Tab.5 Expression levels of LncRNA XIST，miR-200b，ZEB1 and MDR1 mRNA in cells of each group（±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Ararubicin+LncRNA XIST inhibitor negative control group，2）P＜0.05.

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2.5各組細(xì)胞ZEB1及P-gp蛋白表達(dá)水平 與對照組、阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor陰性對照組分別相比，阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor組、Lnc-RNA XIST inhibitor組細(xì)胞ZEB1、P-gp蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），阿柔比星+LncRNA XIST inhibitor陰性對照組細(xì)胞ZEB1、P-gp蛋白表達(dá)水平無明顯改變（P＞0.05），見圖2、表6。

圖2 各組細(xì)胞ZEB1、P-gp蛋白相對表達(dá)的比較（±s，n=6）Fig.2 Comparison of relative expression of ZEB1 and Pgp proteins in cells of each group（xˉ±s，n=6）

表6 各組細(xì)胞ZEB1、P-gp蛋白相對表達(dá)的比較（xˉ±s，n=6）Tab.6 Comparison of relative expression of ZEB1 and P-gp proteins in cells of each group（xˉ±s，n=6）

3 討論

AML可引發(fā)造血細(xì)胞發(fā)育停滯，喪失正常造血功能，并惡性增殖，造成嚴(yán)重貧血，極大威脅兒童的生命安全，目前化療是其主要治療方式，但因耐藥性的存在，其療效有限，預(yù)后較差，亟需尋找減輕AML耐藥性，提高療效的方法［12-13］。本實(shí)驗(yàn)以阿柔比星濃度遞增法誘導(dǎo)建立人AML阿柔比星耐藥細(xì)胞株K562/ADM，顯示K562細(xì)胞在5 μg/ml的阿柔比星中生長良好，無明顯凋亡產(chǎn)生，表明阿柔比星耐藥細(xì)胞株K562/ADM構(gòu)建成功。

LncRNA XIST在多種腫瘤組織中異常過表達(dá)，包括非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、AML等，具有致癌作用，有助于癌細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生，敲除LncRNA XIST基因，可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡，抑制增殖，提高對順鉑的化療敏感性，顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移侵襲活 性，誘導(dǎo)其凋亡［10，14-16］。miR-200b-3p是Lnc-RNA XIST的直接作用靶點(diǎn)，體內(nèi)外沉默肝癌組織中LncRNA XIST，可顯著上調(diào)miR-200b-3p表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞增殖，且研究表明，miR-200b具有抑癌作用，在AML患者中表達(dá)顯著降低，與白細(xì)胞明顯升高及預(yù)后差有關(guān)［6，9，17］；ZEB1有助于癌細(xì)胞化療耐藥性的發(fā)生，是miR-200b的下游因子，可被其負(fù)調(diào)控［18-20］，因而推測LncRNA XIST可能通過調(diào)控miR-200b/ZEB1軸影響兒童AML的阿柔比星耐藥性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LncRNA XIST在K562/ADM細(xì)胞中表達(dá)相比K562細(xì)胞明顯升高，以LncRNA XIST inhibitor敲低K562/ADM細(xì)胞中LncRNA XIST表達(dá)，可明顯下調(diào)ZEB1及MDR1 mRNA表達(dá)、ZEB1及P-gp蛋白表達(dá)、耐藥基因MDR1 mRNA表達(dá)水平及耐藥蛋白P-gp表達(dá)水平，上調(diào)miR-200b表達(dá)，并可明顯降低在阿柔比星處理基礎(chǔ)上細(xì)胞存活率，并提高其凋亡率，表明LncRNA XIST參與介導(dǎo)AML耐藥性的產(chǎn)生過程，下調(diào)LncRNA XIST表達(dá)，可上調(diào)miR-200b表達(dá)，下調(diào)ZEB1及耐藥基因的表達(dá)，顯著增強(qiáng)K562/ADM細(xì)胞對阿柔比星的化療敏感性，降低阿柔比星處理時(shí)AML耐藥細(xì)胞K562/ADM活力，促使其凋亡，減輕其耐藥性，增強(qiáng)化療藥物阿柔比星對K562/ADM的殺傷能力。

綜上所述，LncRNA XIST促使人AML細(xì)胞阿柔比星耐藥性產(chǎn)生，敲低其表達(dá)，可促使miR-200b表達(dá)，降低ZEB1及耐藥基因的表達(dá)，減弱AML細(xì)胞的耐藥性，增強(qiáng)阿柔比星對其的殺傷作用，從而減弱AML細(xì)胞活力，促使凋亡產(chǎn)生，表明LncRNA XIST是減輕AML化療耐藥性的一個作用靶點(diǎn)，調(diào)控miR-200b/ZEB1信號可能是其發(fā)揮作用的分子機(jī)制，但本實(shí)驗(yàn)還未通過過表達(dá)及敲除miR-200b基因進(jìn)行對照驗(yàn)證，還需后續(xù)更深入的研究。