董 巖 李 方 賈依娜爾 楊立新 權(quán)榮喜

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，烏魯木齊 830011）

膿毒癥指由感染因素導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），常見原因包括嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、再灌注損傷及外科大手術(shù)后的并發(fā)癥等［1］。嚴(yán)重膿毒癥患者可并發(fā)多器官功能損傷，而肺作為膿毒癥的主要受損器官，最常見并發(fā)癥為急性肺損傷（acute lung injury，ALI）［2］。ALI常見臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性低氧血癥和呼吸窘迫，若病情進(jìn)一步發(fā)展將導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）［3］。ALI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)爆發(fā)和失控是ALI發(fā)病的核心環(huán)節(jié)，而既往研究認(rèn)為ALI發(fā)生發(fā)展與Th1/Th2免疫失衡相關(guān)［4］。近年研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）與輔 助性T細(xì) 胞17（helper T 17 cell，Th17）及其細(xì)胞因子同樣在ALI發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［5-6］。Treg/Th17失衡學(xué)說(shuō)受到越來(lái)越多的學(xué)者重視，不僅是對(duì)Th1/Th2失衡機(jī)制的補(bǔ)充，更為ALI發(fā)生發(fā)展提供了更多免疫學(xué)依據(jù)。IL-18是由多種細(xì)胞（如單核細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等）產(chǎn)生的具有多項(xiàng)效應(yīng)的促炎因子，既往研究發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)T細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，在抗感染、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及慢性炎癥等疾病過(guò)程中發(fā)揮重要作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)，IL-18在膿毒癥重癥患者中的表達(dá)顯著增加，且與患者不良預(yù)后密切相關(guān)［8-9］。最近研究顯示，IL-18在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥小鼠模型中能夠通過(guò)調(diào)控Treg/Th17及炎癥因子表達(dá)影響成骨細(xì)胞分化［10］。而在膿毒癥中高表達(dá)的IL-18能否通過(guò)影響Treg/Th17平衡參與ALI發(fā)生發(fā)展尚無(wú)報(bào)道。本研究將采用IL-18基因敲除（IL-18-/-）小鼠以LPS誘導(dǎo)經(jīng)典膿毒癥模型，觀察IL-18對(duì)ALI的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠36只，6～8周齡，體質(zhì)量22～30 g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。IL-18基因敲除小鼠（IL-18-/-）由蘇州賽業(yè)生物公司訂制。均飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，自由飲食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境：22～26℃，40%～70%相對(duì)濕度，12 h/12 h晝夜交替。本研究所涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)要求，所有操作遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作管理規(guī)范。

1.1.2主要試劑 脂多糖（LPS，美國(guó)Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司）；佛波酯（PMA）/離子霉素混合物、布雷菲德菌素A（BFA，杭州聯(lián)科生物）；大鼠抗IL-18、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）單克隆抗體、GAPDH（美國(guó)Abcam公司）；辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記的二抗（廣州晶彩）；RORγδ、FoxP3（美國(guó)Santa Cruz公司）；Alexa Fluor 647標(biāo)記的兔抗大鼠抗體（美國(guó)Biolegend公司）；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Roche公司）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料、HE染色試劑盒、BCA蛋白試劑盒（江蘇碧云天生物公司）；FITC-CD4、APC-25、PE-Cy5.5-IL-17A、PE-FoxP3（美國(guó)BD公司）；PCR試劑盒（日本TaKaRa）；PCR引物由上海生工合成；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1膿毒癥動(dòng)物模型構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)小鼠分為4組：野生型小鼠對(duì)照組（WT組，n=6）、LPS處理的野生型小鼠組（WT LPS組，n=10）、IL-18基因敲除的小鼠對(duì)照組（IL-18-/-組，n=10）、LPS處理的IL-18基因敲除小鼠組（IL-18-/-LPS組、n=10）。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，術(shù)前12 h禁食不禁水，腹腔注射LPS（15 mg/kg）建立膿毒癥模型，對(duì)照組按同比例注射相應(yīng)體積生理鹽水。LPS處理小鼠后觀察小鼠72 h存活率并繪制生存曲線。造模72 h脫臼處死各組小鼠，收集肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、雙肺組織備用。

1.2.2HE染色觀察小鼠肺組織病理變化 取各組小鼠肺組織固定于4%多聚甲醛溶液24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，HE染色，每只小鼠隨機(jī)選取3張切片，光鏡下觀察組織學(xué)變化。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)各組小鼠肺組織IL-18 mRNA表達(dá) 將小鼠肺組織置于液氮中研磨為組織勻漿，Trizol法提取組織總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照RT-PCR試劑說(shuō)明書及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的反應(yīng)時(shí)間與溫度進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性7 s→60℃退火30 s→72℃15 s，40個(gè)循環(huán)。RT-PCR引物序列為IL-18 F：5'-CCTTCATTGCCACGTACAGG-3'，IL-18 R：5'-GGGCTTGATGATGTGCTCTG-3'；β-actin F：5'-ATCACCATTGGAATGAGCG-3'，β-actin R：5'-TTGAAGGTAGTTCGTGGAT-3'。以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt分析IL-18基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.4免疫熒光組織化學(xué)染色檢測(cè)小鼠肺組織IL-18表達(dá)和定位 各組小鼠肺組織切片常規(guī)脫蠟水化后，采用檸檬酸緩沖液微波進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫，PBS漂洗，加入5%BSA室溫孵育20 min進(jìn)行封閉，滴加適當(dāng)稀釋后的兔抗IL-18多克隆抗體（1∶200）4℃孵育過(guò)夜，次日37℃復(fù)溫，PBS漂洗，加入Alexa Fluor 647標(biāo)記的山羊抗兔抗體（1∶800）室溫孵育30 min，PBS漂洗，加入5μg/ml DAPI染液室溫孵育30 min，PBS漂洗，加入防熒光淬滅劑，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5TUNEL試劑盒檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡 各組小鼠肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，按TUNEL試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡情況：各組小鼠肺組織切片中加入TUNEL反應(yīng)液及DAPI染液37℃孵育1 h，PBS洗滌3次，加入防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察。細(xì)胞凋亡率為高倍視野下每100個(gè)細(xì)胞中TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.6肺單個(gè)核細(xì)胞中Th17與Treg水平檢測(cè)10%水合氯醛（0.004 ml/g）麻醉小鼠后仰臥位固定，外科剪打開胸腔，暴露心臟，2 ml注射器針頭從左心室插入，同時(shí)剪破右心房，以1 ml/5 s進(jìn)行生理鹽水灌注，直至右心房流出清亮液體。取雙肺組織，生理鹽水漂洗，無(wú)菌外科剪將肺組織盡量剪碎，置于含0.5 g/LⅠ型膠原酶與DNaseⅠ的DMEM培養(yǎng)基中37℃水浴搖床消化90 min，200目濾網(wǎng)過(guò)濾2次，1 000 r/min離心5 min，取底層沉淀，DMEM重懸，輕輕置于40%與80%的Percoll不連續(xù)密度梯度液面，3 000 r/min離心20 min，取中層細(xì)胞，重懸于10 ml PBS，1 000 r/min離心5 min，洗滌2次，所得底層細(xì)胞沉淀即為肺單個(gè)核細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活力＞90%，調(diào)整細(xì)胞密度至2×106個(gè)/ml，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17與Treg占比：①Th17檢測(cè)：取約2×106個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，加入4μl PMA與離子霉素及BFA進(jìn)行體外刺激，37℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)5 h，培養(yǎng)終止后調(diào)整細(xì)胞至1×106個(gè)/ml，取100μl細(xì)胞懸液于流式管，加入2μl FITC-CD4，渦旋混勻，4℃避光孵育30 min，加入100 μl固定破膜液，4℃避光孵育15 min，3 ml PBS重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，洗滌細(xì)胞，棄上清，渦旋分散底層細(xì)胞沉淀，加入100μl固定破膜液及5 μl PE-Cy5.5-IL-17A，混勻，4℃避光孵育30 min，PBS再次離心洗滌細(xì)胞，加入500μl流式染色緩沖液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)Th17（CD4+IL-17A+）比例；②Treg檢測(cè)：取1×106個(gè)細(xì)胞至流式管，PBS按上述方法離心洗滌并重懸，加入5 μl FITC-CD4與APC-CD25，4℃避光孵育40 min，PBS再次離心洗滌細(xì)胞，棄上清，渦旋分散細(xì)胞，每管加入1 ml固定破膜液，混勻，4℃避光孵育20 min，PBS離心洗滌細(xì)胞，加入5 μl PE-FoxP3，渦旋混勻，4℃避光孵育30 min，PBS離心洗滌細(xì)胞，加入500μl流式緩沖液上機(jī)檢測(cè)Treg比例（CD4+CD25+FoxP3+）。

1.2.7BALF抽取 小鼠處死后進(jìn)行氣管插管，0.8 ml預(yù)冷生理鹽水灌洗雙肺，停留5～8 s并輕輕按摩雙肺組織，緩慢回抽BALF，重復(fù)3次。將收集的BALF于4℃、3 000 r/min離心20 min，收集上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8ELISA檢測(cè)BALF中TNF-α、IL-17A、TGF-1β、IL-10表 達(dá) 按 照TNF-α、IL-17A、TGF-1β、IL-10 ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)各組小鼠BALF中上述細(xì)胞因子表達(dá)。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.9Western blot檢測(cè)IL-18、STAT3、p-STAT3及RORγt和FoxP3蛋白水平 取各組小鼠肺組織置于液氮中研磨成粉狀，加入400 μl含蛋白酶抑制劑（PMSF）的RIPA裂 解 液 冰 上 消 化30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，上清即為肺組織總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，按1∶4向上清中加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水加熱變性10 min。取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入IL-18（1∶500）、STAT3（1∶800）、p-STAT3（1∶800）、RORγt（1∶500）、FoxP3（1∶500）、β-actin（1∶2 000）一抗4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST清洗3次，5 min/次，以HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST清洗3次，5 min/次，均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀曝光拍照，Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行多組間分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IL-18缺陷對(duì)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥肺損傷的影響 觀察各組小鼠72 h生存率，結(jié)果顯示，與WT組小鼠相比，WT LPS組與IL-18-/-LPS組小鼠存活率顯著降低（P＜0.05），IL-18-/-組小鼠無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與WT LPS組相比，與IL-18-/-LPS組小鼠存活率顯著升高（P＜0.05，圖1）。各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果顯示，WT組與IL-18-/-組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡上皮細(xì)胞及肺泡間隔形態(tài)正常，泡腔清晰，無(wú)滲出，肺間質(zhì)無(wú)出血、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，WT LPS組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔塌陷或融合，大小不等，肺泡間隔明顯增厚，肺間質(zhì)可見充血、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；IL-18-/-LPS組小鼠肺損傷較WT LPS組小鼠減輕，僅少數(shù)肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺間質(zhì)滲出及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少（圖2）。

圖1 各組小鼠生存曲線Fig.1 Survival curve of mice in each group

圖2 HE染色觀察各組小鼠肺組織損傷Fig.2 Lung tissue injury of mice in each group observed by HE staining

2.2各組小鼠肺組織IL-18表達(dá)及定位RT-PCR及Western blot檢測(cè)各組小鼠IL-18 mRNA及蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與WT組相比，WT LPS組小鼠IL-18 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著增加，而IL-18-/-組與IL-18-/-LPS組顯著降低（P＜0.01，圖3）；免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果同樣表明，WT LPS組小鼠IL-18熒光強(qiáng)度較WT組小鼠顯著增強(qiáng)（P＜0.01），而IL-18-/-組與IL-18-/-LPS組小鼠無(wú)明顯IL-18熒光表達(dá)（圖4）。

圖3 各組小鼠肺組織IL-18 mRNA及蛋白表達(dá)Fig.3 mRNA and protein expressions of IL-18 in lung tissues of mice in each group

圖4 免疫熒光檢測(cè)各組小鼠肺組織IL-18表達(dá)（×200）Fig.4 Expression of IL-18 in lung tissues of mice in each group detected by immunofluorescence（×200）

2.3IL-18缺陷抑制LPS誘導(dǎo)的膿毒癥肺組織細(xì)胞凋亡TUNEL染色檢測(cè)各組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，與WT組相比，WT LPS組與IL-18-/-LPS組小鼠凋亡細(xì)胞顯著增加（P＜0.05），IL-18-/-組小鼠無(wú)明顯變化；而與WT LPS組相比，IL-18-/-LPS組小鼠凋亡細(xì)胞顯著減少（P＜0.05，圖5）。

圖5 TUNEL染色檢測(cè)各組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡Fig.5 TUNEL staining to detect apoptotic cells in lung tissues of mice in each group

2.4IL-18缺陷對(duì)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥肺組織Treg/Th17的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠肺組織單個(gè)核細(xì)胞Treg與Th17占CD4+T細(xì)胞比例的變化，結(jié)果顯示：與WT組相比，WT LPS組與IL-18-/-LPS組小鼠Treg與Th17占比均明顯升高（P＜0.05），但WT LPS組Treg/Th17明顯降低（P＜0.05），而IL-18-/-LPS組該比值顯著升高（P＜0.05）；與WT LPS組相比，IL-18-/-LPS組小鼠Treg占比及Treg/Th17均顯著提高（P＜0.05），Th17占比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖6、表1）。

表1 各組小鼠肺組織Treg、Th17占比及Treg/Th17變化（±s）Tab.1 Changes of Treg，Th17 percentages and Treg/Th17 in lung tissue of mice in each group（±s）

表1 各組小鼠肺組織Treg、Th17占比及Treg/Th17變化（±s）Tab.1 Changes of Treg，Th17 percentages and Treg/Th17 in lung tissue of mice in each group（±s）

Note：Compared with WT group，1）P＜0.05；compared with WT LPS group，2）P＜0.05.

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圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠Treg、Th17比例變化Fig.6 Treg and Th17 percentages changes of mice in each group detected by flow cytometry

2.5IL-18缺陷對(duì)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥肺組織炎癥因子表達(dá)的影響ELISA檢測(cè)各組小鼠BALF中炎癥因子TNF-α、IL-17A、TGF-1β、IL-10表達(dá)，結(jié)果顯示，與WT組小鼠相比，WT LPS組與IL-18-/-LPS組小鼠BALF中促炎因子TNF-α、IL-17A、TGF-1β、IL-10表達(dá)均顯著升高（P＜0.05），IL-18-/-組小鼠無(wú)明顯變化；而與WT LPS組相比，IL-18-/-LPS組小鼠肺組織中抑炎因子TGF-1β、IL-10表達(dá)顯著增加（P＜0.05），而促炎因子TNF-α、IL-17A表達(dá)顯著減少（P＜0.05，表2）。

表2 各組細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-17A、TGF-1β、IL-10表達(dá)（±s，pg/ml）Tab.2 TNF-α，IL-17A，TGF-1β and IL-10 expressions of cells in each group（±s，pg/ml）

表2 各組細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-17A、TGF-1β、IL-10表達(dá)（±s，pg/ml）Tab.2 TNF-α，IL-17A，TGF-1β and IL-10 expressions of cells in each group（±s，pg/ml）

Note：Compared with WT group，1）P＜0.05；compared with WT LPS group，2）P＜0.05.

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2.6IL-18缺陷通過(guò)STAT3途徑改變LPS誘導(dǎo)的膿毒癥肺組織Treg與Th17占比Western blot結(jié)果顯示，與WT組小鼠相比，WT LPS組與IL-18-/-LPS組小鼠肺組織RORγt、FoxP3表達(dá)均降低，而p-STAT3表達(dá)顯著增加，IL-18-/-組小鼠無(wú)明顯變化；與WT LPS組小鼠相比，IL-18-/-LPS組小鼠肺組織FoxP3表達(dá)顯著增加，p-STAT3表達(dá)顯著降低，而RORγt、STAT3無(wú)明顯變化，IL-18-/-LPS組小鼠可能通過(guò)抑制STAT3磷酸化上調(diào)Treg比例（圖7）。

圖7 Western blot檢測(cè)各組小鼠肺組織FoxP3、RORγt及STAT3蛋白表達(dá)Fig.7 Western blot to detect protein expressions of FoxP3，RORγt and STAT3 in lung tissue of mice in each group

3 討論

ALI是膿毒癥最常見嚴(yán)重并發(fā)癥，重癥患者可發(fā)展為ARDS。盡管人們對(duì)膿毒癥介導(dǎo)的ALI研究眾多，但其發(fā)病率仍居高不下，病死率可達(dá)20%以上［2-3］。因此，積極探索膿毒癥導(dǎo)致ALI的相關(guān)機(jī)制，對(duì)疾病早期診斷、治療及預(yù)后評(píng)估具有重要臨床價(jià)值。既往研究證實(shí)，Th1/Th2亞群免疫失衡在膿毒癥相關(guān)ALI的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染等應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體Th1/Th2平衡被打破，引發(fā)異常免疫應(yīng)答，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)感染的清除能力下降［11-12］。盡管膿毒癥介導(dǎo)的ALI損傷機(jī)制與Th1/Th2免疫失衡有關(guān)，但針對(duì)該平衡所采取的干預(yù)措施效果卻無(wú)法令人滿意［13］。

Treg是20世紀(jì)發(fā)現(xiàn)的存在于機(jī)體CD4+T細(xì)胞中的一個(gè)重要亞群，在健康人群中占CD4+T細(xì)胞的5%～10%，其中FoxP3是人和動(dòng)物體內(nèi)Treg分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子［14-16］。隨著對(duì)Treg功能研究深入，研究者發(fā)現(xiàn)Treg能夠通過(guò)表達(dá)TGF-β、IL-10等抑炎細(xì)胞因子參與免疫應(yīng)答負(fù)性調(diào)節(jié)：如在腫瘤中，Treg能夠通過(guò)分泌相關(guān)細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制作用從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸［17-18］；器官移植中，過(guò)繼回輸Treg能通過(guò)降低免疫排斥反應(yīng)有效保護(hù)移植器官功能，延長(zhǎng)其存活時(shí)間［19］。而Th17是T細(xì)胞的另一亞群，能夠在IL-6、IL-17A（或IL-17）、RORγt等細(xì)胞因子誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄，并通過(guò)分泌IL-17A、IL-6及TNF-α等發(fā)揮促炎作用［20］。體內(nèi)Treg/Th17失衡在多種疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，如在幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎中，Treg/Th17平衡向Th17偏移，導(dǎo)致患兒體內(nèi)促炎因子IL-6、IL-1β表達(dá)增加，促進(jìn)疾病進(jìn)展［21］。炎癥性腸病中，姜黃素能夠通過(guò)IL-6/STAT3信號(hào)通路調(diào)控Treg/Th17平衡治療潰瘍性結(jié)腸炎［22］。提示Treg/Th17作為CD4+T細(xì)胞的重要組成，對(duì)機(jī)體免疫功能的正常維持同樣發(fā)揮不可忽視的作用。

IL-18作為一種重要的促炎因子，能夠被肝、腎、骨骼肌等器官及組織的多種細(xì)胞（如內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等）轉(zhuǎn)錄并表達(dá)，并在抗感染、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及慢性炎癥等疾病過(guò)程中發(fā)揮多項(xiàng)生物學(xué)功能［7］。同時(shí)，研究顯示IL-18作為炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)上游的重要促炎因子，能夠誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-13等早期炎癥因子表達(dá)，其中TNF-α作為最主要的促炎因子，是內(nèi)毒素?fù)p傷效應(yīng)的關(guān)鍵遞質(zhì)之一；其次，IL-18還能夠通過(guò)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步誘導(dǎo)下游多種趨化因子（如單核細(xì)胞趨化因子、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白等）分泌，并促使其趨化至感染部位，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)［23］。已有研究提示IL-18可調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡，如在陰道念珠菌病中，陰道液中IL-18低表達(dá)者更易感染念珠菌，可能與上調(diào)Treg表達(dá)從而導(dǎo)致Treg/Th17免疫失衡有關(guān)［10］；小鼠骨質(zhì)疏松癥模型中也證實(shí)IL-18通過(guò)上調(diào)Th17表達(dá)，導(dǎo)致Treg/Th17失衡，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，導(dǎo)致骨質(zhì)流失［11］。不過(guò)關(guān)于IL-18在膿毒癥中影響Treg/Th17平衡的作用鮮有報(bào)道。

研究顯示，小鼠腹腔注射一定劑量（10～20 mg/kg）LPS，6～72 h內(nèi) 能 較 好 地 動(dòng) 態(tài) 展 示ALI演 變 規(guī)律［24-25］。為探究IL-18在ALI發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究通過(guò)敲除IL-18基因表達(dá)（IL-18-/-）小鼠腹腔注射15 mg/kg LPS誘導(dǎo)經(jīng)典小鼠膿毒癥模型，發(fā)現(xiàn)WT LPS組小鼠72 h生存率較對(duì)照組顯著降低，且肺組織HE染色顯示肺組織結(jié)構(gòu)損害嚴(yán)重，凋亡細(xì)胞顯著增加，而IL-18-/-組小鼠72 h內(nèi)生存率、肺組織病理?yè)p傷及細(xì)胞凋亡均明顯改善。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織Treg和Th17占比及相關(guān)炎癥因子表達(dá)均較野生對(duì)照組小鼠明顯提高，而IL-18-/-LPS組小鼠肺組織Treg占比和Treg/Th17較WT LPS組小鼠顯著提高，Treg相關(guān)細(xì)胞因子TGF-1β、IL-10表達(dá)也明顯升高，而Th17占比無(wú)明顯改變，其相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-17A表達(dá)均顯著減少。表明LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織中呈過(guò)度炎癥反應(yīng)，Treg相關(guān)負(fù)向免疫調(diào)控被抑制，而敲除IL-18基因后，促進(jìn)Treg表達(dá)，小鼠體內(nèi)Treg免疫應(yīng)答抑制因IL-18敲除被部分抵消，體內(nèi)過(guò)度炎癥反應(yīng)被抑制。RORγt是Th17分化過(guò)程中特征性轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)主要受STAT3調(diào)節(jié)，而STAT3磷酸化可促進(jìn)RORγt轉(zhuǎn)錄及表達(dá)［26］。此外，STAT3同樣通過(guò)多種途徑削弱Treg的免疫抑制作用，并抑制其分化與增殖［27］。本研究采用Western blot檢測(cè)肺組織Treg與Th17重 要 轉(zhuǎn) 錄 因 子RORγt、FoxP3蛋 白 表 達(dá) 及STAT3磷酸化水平，結(jié)果顯示，IL-18-/-組小鼠FoxP3表達(dá)顯著增加，STAT3磷酸化水平明顯降低，而RORγt蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，提示敲除IL-18可能通過(guò)降低STAT3磷酸化水平促進(jìn)FoxP3蛋白表達(dá)，從而上調(diào)Treg比例。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)IL-18基因缺失能通過(guò)降低STAT3磷酸化水平上調(diào)FoxP3表達(dá)，從而促進(jìn)Treg及其相關(guān)炎癥因子表達(dá)，改善LPS導(dǎo)致的ALI。本研究補(bǔ)充了IL-18在膿毒癥作用中的具體作用及機(jī)制，有望為IL-18成為膿毒癥ALI治療過(guò)程的新靶點(diǎn)提供依據(jù)。