莊小捷 余 雙 陳金平 馮繼紅（宜春市人民醫(yī)院腫瘤科，宜春 336000）

宮頸癌為全球女性第二常見(jiàn)的腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌［1］。最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，全世界每年有超過(guò)52.5萬(wàn)例新病例和26.5萬(wàn)例患者死亡，其中中國(guó)是宮頸癌的高發(fā)地區(qū)，一年中有超過(guò)13萬(wàn)例新增病例，我國(guó)宮頸癌患者的年齡主要集中在40～50歲［2-4］。近年來(lái)，從宮頸癌的發(fā)病率和病死率的趨勢(shì)來(lái)看，該疾病目前仍處于上升趨勢(shì)［5］。許多復(fù)雜因素與宮頸癌的生物學(xué)行為有關(guān)，并影響患者預(yù)后，導(dǎo)致部分患者療效不理想，復(fù)發(fā)率較高，五年生存率偏低［6-8］。

2007年，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所的一項(xiàng)研究表明，順鉑化療的同時(shí)進(jìn)行放療是晚期宮頸癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，死亡的風(fēng)險(xiǎn)率（hazard rate，HR）值可降低至0.52［9-10］。然而，盡管患者接受了同步放化療，仍有部分患者治療失敗，并且治療反應(yīng)和預(yù)后的差異可能與腫瘤異質(zhì)性及患者個(gè)體差異有關(guān)［11］。由于分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，腫瘤治療也進(jìn)入了分子基因水平，并且發(fā)現(xiàn)了許多與腫瘤相關(guān)的基因突變［12］。通過(guò)基因標(biāo)志物的檢測(cè)和針對(duì)這些標(biāo)志物的靶向治療，為癌癥的個(gè)性化診斷和治療奠定了基礎(chǔ)［13］。盡管關(guān)于宮頸癌生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)的研究越來(lái)越多，但大多數(shù)都是基于基因表達(dá)譜的分析，臨床上尚無(wú)理想的標(biāo)志物。因此，宮頸癌基因組學(xué)的研究仍是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。最新的研究發(fā)現(xiàn)，甲硫氨酸亞砜還原酶B3（methionine sulfoxide reductase-B3，MSRB3）基因缺乏會(huì)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，但其在宮頸癌中的作用機(jī)制尚未明確。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)下載并篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs） 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.cancer.gov/）中獲得宮頸癌基因組的mRNAseq表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床特征資料。使用R語(yǔ)言中的“l(fā)imma”軟件包分析轉(zhuǎn)化下載的標(biāo)準(zhǔn)化宮頸癌組織與正常組織數(shù)據(jù)的DEGs（定義為倍數(shù)變化＞4，Padj=0.001）。最后，從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了306個(gè)宮頸癌樣品和3個(gè)正常對(duì)照樣本的RNA序列數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)，并進(jìn)行基因差異分析。

1.2Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型篩選并分析預(yù)后相關(guān)基因Cox回歸模型是生存分析中的重要模型，可用于描述某些時(shí)候不變的多個(gè)特征對(duì)病死率的影響。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是基于多元Cox回歸分析的加權(quán)基因表達(dá)水平的總和，可用于計(jì)算每位患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。對(duì)每個(gè)基因分別進(jìn)行單變量分析，并根據(jù)P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選重要基因進(jìn)行進(jìn)一步分析，然后采用多元Cox回歸比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析通過(guò)單因素回歸分析篩選差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因。最后，根據(jù)基因的中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將宮頸癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，并使用R軟件包分析獲得基因風(fēng)險(xiǎn)熱圖。

1.3單基因表達(dá)數(shù)據(jù)的提取與分析 使用R語(yǔ)言的“l(fā)imma”軟件包對(duì)所選基因進(jìn)行差異分析，并將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。分析MSRB3在宮頸癌中的表達(dá)，并與正常組織進(jìn)行比較。宮頸癌患者的臨床特征可從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載，包括性別、生存時(shí)間、年齡、種族、等級(jí)分類和TNM分期。其中一些不可用，被認(rèn)為是缺失值。然后使用R語(yǔ)言中的“survive”軟件包進(jìn)行生存分析，結(jié)合Kolmogorov-Smirnov（KS）檢驗(yàn)分析得出MSRB3與宮頸癌的臨床相關(guān)性。最后，單因素分析和多因素分析再次驗(yàn)證MSRB3的臨床意義。

1.4基因集富集分析（GSEA）GSEA是一種基因探針富集測(cè)定法，基于對(duì)來(lái)自微陣列數(shù)據(jù)各種水平的基因探針進(jìn)行評(píng)估。GSEA基于MSRB3表達(dá)的相關(guān)性生成所有基因的有序列表，并進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析和GO生物功能富集分析。每次分析進(jìn)行1 000個(gè)基因組隨機(jī)替換，然后按P值大小選擇顯示前20個(gè)結(jié)果。最后使用R語(yǔ)言“ggplot2”軟件包對(duì)單獨(dú)選擇的KEGG/GO分析的10個(gè)結(jié)果進(jìn)行多GESA濃縮總結(jié)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有研究數(shù)據(jù)均使用R軟件包（版本3.6.1）和Perl腳本工具（版本5.30.0）進(jìn)行分析。平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差代表連續(xù)變量，頻率和百分比代表類別變量。通過(guò)KS檢驗(yàn)和Logistic回歸分析評(píng)估單基因表達(dá)與臨床特征的關(guān)系。使用Kaplan-Meier生存分析和單因素/多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸進(jìn)行預(yù)后基因驗(yàn)證分析。

2 結(jié)果

2.1DEGs的分析和預(yù)后基因的篩選 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載的306個(gè)宮頸癌組織和3個(gè)對(duì)照正常組織的臨床資料詳細(xì)特征主要包括生存時(shí)間、年齡、種族、等級(jí)分類和TNM分期等。使用R軟件分析共獲得654個(gè)DEGs，其中包括239個(gè)上調(diào)基因和415個(gè)下調(diào)基因（倍數(shù)變化＞4，Padj=0.001）。所有DEGs均由火山圖表示（圖1A）。應(yīng)用單因素生存分析法分析宮頸癌中654個(gè)DEGs，獲得與預(yù)后相關(guān)的基因（P＜0.05）。隨后，通過(guò)Logistic回歸和多元Cox分析最終篩選出5個(gè)預(yù)后相關(guān)基因。這5個(gè)基因分別為PPP1R14A、MSRB3、SELP、CENPM和ZIC2。根據(jù)患者的中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將患者分為高危組和低危組，并用高、低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分熱圖確定這5個(gè)基因特征的富集程度（圖1B），該結(jié)果表明，5個(gè)基因在宮頸癌組織和正常對(duì)照組織中顯示出極大的特異性。

圖1 差異表達(dá)分析和預(yù)后驗(yàn)證Fig.1 Differential expression analysis and prognosis verification

2.2MSRB3單基因差異表達(dá)分析 采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析了MSRB3在306例宮頸癌組織和3例正常組織中的表達(dá)。結(jié)果表明，MSRB3的表達(dá)在宮頸癌組織和正常組織間存在差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。比較腫瘤組織和正常組織中MSRB3的均值發(fā)現(xiàn)，癌組織中MSRB3的表達(dá)明顯低于正常組織（圖2）。差異表達(dá)分析初步表明MSRB3可能抑制宮頸癌的發(fā)生。

圖2 宮頸癌組織中MSRB3的表達(dá)明顯低于正常組織Fig.2 Expression of MSRB3 in cervical cancer tissue was significantly lower than that in normal tissue

2.3MSRB3臨床相關(guān)性分析 在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了309例宮頸癌樣本中MSRB3的表達(dá)數(shù)據(jù)。使用KS檢驗(yàn)和Logistic回歸分析研究了MSRB3與宮頸癌臨床特征間的關(guān)系。結(jié)果表明，MSRB3的表達(dá)增加與腫瘤分級(jí)（P=0.000）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.045）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.002）和年齡（P=0.000）密切相關(guān)。盡管與TNM分期的相關(guān)性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但由圖3可知，臨床分期越高，MSRB3的表達(dá)就越高。單因素Logistic回歸分析顯示，MSRB3基因與宮頸癌的臨床特征存在相關(guān)性，由表1可知，MSRB3基因與腫瘤分期、年齡、種族、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均具有相關(guān)性，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明，MSRB3基因在宮頸癌的晚期發(fā)揮促癌因子作用，其表達(dá)越高，宮頸癌就越容易向晚期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

表1 MSRB3表達(dá)與臨床特征相關(guān)（KS檢驗(yàn)和Logistic回歸）Tab.1 MSRB3 expression associated with clinical characteristics（KS test and Logistic regression）

圖3 MSRB3差異表達(dá)的臨床相關(guān)性分析Fig.3 Clinical correlation analysis of differential expression of MSRB3

2.4MSRB3作為預(yù)測(cè)宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立因素Kaplan-Meier生存分析表明，MSRB3低表達(dá)的宮頸癌患者預(yù)后優(yōu)于MSRB3高表達(dá)患者（P=0.002，圖4）。單因素變量分析和多因素變量分析顯示，MSRB3與宮頸癌總體生存率顯著相關(guān)。此外，MSRB3基因可能是宮頸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，宮頸癌分級(jí)、N分型、年齡及MSRB3表達(dá)與宮頸癌預(yù)后相關(guān)。多因素Cox回歸分析表明，盡管其他協(xié)變量對(duì)其進(jìn)行了調(diào)整，MSRB3仍然是宮頸癌的獨(dú)立預(yù)后因素（表2）。

表2 單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析對(duì)總生存率的影響Tab.2 Univariate and multivariable Cox proportionalhazards regression analysis on overall survival

圖4 MSRB3的生存分析Fig.4 Survival analysis of MSRB3

2.5GSEA分析MSRB3的生物學(xué)功能和相關(guān)信號(hào)通路 功能基因集采用KEGG和分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)（MSigDB）中的GO基因集，然后使用GSEA軟件進(jìn)行基因集富集分析，MSigDB集富集（c2.cp.v7.0）存在明顯差異（FDR＜0.05，NOMP＜0.05）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)富集分?jǐn)?shù)（NES）選擇P值最具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號(hào)通路和相關(guān)生物學(xué)功能。分別選擇MSRB3低表達(dá)組和高表達(dá)組的結(jié)果，并將其整合到多GSEA富集圖中。KEGG結(jié)果表明，MSRB3主要富集于MAPK、TGF-β和WNT等信號(hào)通路（圖5A）；GO結(jié)果表明，MSRB3的生物學(xué)功能主要富集于血管生成、細(xì)胞-基質(zhì)連接及上皮細(xì)胞增殖等生物功能（圖5B）。

圖5 MSRB3 GSEA結(jié)果Fig.5 GSEA results of MSRB3

3 討論

宮頸癌是全球女性第二大最常見(jiàn)的婦科腫瘤。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，中國(guó)女性患者數(shù)量高居全球女性患者首位［14］。宮頸癌的主要治療方法是手術(shù)治療聯(lián)合放化療［15］。隨著治療手段的進(jìn)展，新輔助化療也是晚期宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一種治療方法，目前的化療藥物主要是鉑類藥物［16］。另外，基因治療也是研究熱點(diǎn)之一。ALK、ROS1、c-met、PI3K和mTOR等大量靶向藥物的出現(xiàn)為癌癥患者帶來(lái)了新希望［17］。但目前尚無(wú)針對(duì)宮頸癌，特別是晚期和復(fù)發(fā)性宮頸癌的化療相關(guān)靶基因的研究。鑒于目前晚期宮頸癌患者的低生存率和全球癌癥負(fù)擔(dān)，本研究通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)初步探索與宮頸癌臨床預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物。

在本研究中，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)提供了宮頸癌基因組測(cè)序信息和相應(yīng)的臨床信息，并使用R語(yǔ)言分析獲得了宮頸癌中差異表達(dá)的基因。通過(guò)單因素生存分析法分析宮頸癌樣本中654個(gè)DEGs，獲得與預(yù)后相關(guān)的基因。并通過(guò)多變量Cox分析獲得了5個(gè)基因用于預(yù)測(cè)宮頸癌預(yù)后，包括PPP1R14A、MSRB3、SELP、CENPM和ZIC2。通過(guò)查閱文獻(xiàn)和單基因數(shù)據(jù)分析獲得與宮頸癌預(yù)后相關(guān)的特異基因MSRB3。結(jié)果表明，與正常組織相比，宮頸癌組織中MSRB3基因表達(dá)降低。多變量分析表明，MSRB3的高表達(dá)與晚期臨床病理特征如腫瘤分級(jí)、臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，且MSRB3表達(dá)越高，患者預(yù)后越差。本研究首先揭示了MSRB3基因可能是一把雙刃劍，在宮頸癌的早期階段發(fā)揮抑癌作用，但又可預(yù)測(cè)晚期宮頸癌患者的預(yù)后狀態(tài)。除MSRB3外，單因素Cox分析還顯示年齡、分級(jí)和臨床分期也是影響宮頸癌總生存率的因素。進(jìn)一步多變量Cox回歸分析表明，MSRB3和腫瘤分級(jí)是宮頸癌總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。綜上所述，MSRB3基因是宮頸癌患者總生存率的獨(dú)立影響因素，可作為宮頸癌潛在的預(yù)后分子標(biāo)志物。

MSRB家族被認(rèn)為是清除細(xì)胞活性氧的重要抗氧化酶，而人類MSRB3基因位于8號(hào)染色體上，編碼位于線粒體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)［18］。作為MSRB家族的重要成員，MSRB3可抑制癌基因誘導(dǎo)的DNA損傷，表明MSRB3可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)。然而，只有少數(shù)研究報(bào)道了MSRB3對(duì)癌細(xì)胞的作用［19］。MOREL等［20］證明了MSRB3的表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。KWAK等［21］報(bào)道MSRB3的缺乏可導(dǎo)致乳腺癌、肺癌和肝癌細(xì)胞凋亡。MA等［22］表明胃癌組織中MSRB3表達(dá)升高與胃癌患者預(yù)后不良有關(guān)。2016年，KWAK等［23］首次證明了MSRB3下調(diào)可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，而導(dǎo)致MSRB3誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的途徑之一是內(nèi)源性線粒體凋亡的激活。2017年，KWAK等［24］的另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，MSRB3缺陷通過(guò)p53獨(dú)立和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。截至目前，MSRB3影響腫瘤發(fā)展和預(yù)后的機(jī)制尚不明確。

隨著高通量技術(shù)的飛速發(fā)展，生物信息學(xué)提供了一種強(qiáng)大的手段來(lái)篩選分子生物標(biāo)志物或癌癥預(yù)后靶向基因［25］。與其他研究相比，該研究的優(yōu)勢(shì)在于使用大型數(shù)據(jù)庫(kù)，完整的臨床數(shù)據(jù)和良好的樣品質(zhì)量控制，為宮頸癌的未來(lái)研究提供了新的思路和目標(biāo)。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了306例宮頸癌患者和3例正常對(duì)照樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSRB3在晚期宮頸癌中的表達(dá)與臨床病理特征密切相關(guān)，且較高水平的MSRB3通常與患者的不良生存率直接相關(guān)。此外，結(jié)合MSRB3在宮頸癌中的表達(dá)低于正常對(duì)照組織，課題組發(fā)現(xiàn)，MSRB3可能在宮頸癌的發(fā)展中發(fā)揮雙重作用，其取決于癌癥的發(fā)展階段，在癌癥的早期階段發(fā)揮抑癌作用，但在癌癥的晚期階段卻促進(jìn)腫瘤發(fā)展，即表達(dá)水平越高，預(yù)后越差。這項(xiàng)研究的局限性在于，從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的基因水平數(shù)據(jù)可能無(wú)法完全代表MSRB3在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)。為了使這項(xiàng)研究在臨床上更有意義，上述所有結(jié)果均需要在臨床上進(jìn)一步驗(yàn)證。