林瑩 戴晨逸 蘇婷卉 應(yīng)航 徐飛

噪聲暴露是聽力下降和聽覺外周受損的最常見原因之一[1]，有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)強噪聲短暫暴露引起暫時性閾移的發(fā)育早期動物，雖然其成年后的聽閾正常，但在強度感知和時域處理等閾上聽覺處理方面表現(xiàn)異常[2]。這提示聽覺中樞的發(fā)育成熟是一個可塑性過程，在很大程度上依賴于外周為其提供的輸入性刺激，強噪聲暴露可能作為異常輸入導(dǎo)致了聽覺中樞的可塑性改變。這種影響不僅限于高強度噪聲，孫偉等[3]發(fā)現(xiàn)對發(fā)育期大鼠進行70 dB SPL噪聲長時暴露，會導(dǎo)致其聽覺皮層發(fā)育遲緩，并引起其成年后的時域處理敏銳度低下。

近幾年，陸續(xù)有學(xué)者開展長時低、中等強度噪聲暴露對幼年動物的危害研究，發(fā)現(xiàn)上述中等強度噪聲暴露會使內(nèi)側(cè)膝狀體和下丘等中樞部位出現(xiàn)適應(yīng)性變化[4,5]，但目前尚缺乏這類噪聲在幼年期長時暴露對中樞影響的研究。由于聽覺中樞各級水平之間存在多重聯(lián)系，具有明顯的整體性，因此本研究采用聽性腦干反應(yīng)(ABR)和聽覺驚跳反射(ascoutic startle reflex，ASR)這兩項分別反映聽覺整體功能的電生理與反射性行為測試來探究聽覺中樞反應(yīng)與響度感知表現(xiàn)之間的關(guān)系；并通過噪聲間隙聽性腦干反應(yīng)(GIN-ABR)測試評估動物聽覺時域處理能力，進一步探討幼年期長時、非損傷性噪聲暴露對聽覺中樞功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選取健康幼年(3周齡)雄性白色紅目豚鼠10只，體重150～180 g，無外耳、中耳疾病，耳廓反射正常，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心提供，隨機分成對照組和實驗組，每組5只。

1.2噪聲暴露方法 對照組在正常安靜環(huán)境(<30 dB SPL)下飼養(yǎng)至7周齡，實驗組給予85 dB SPL白噪聲(20 Hz～20 kHz)暴露，每日12小時，連續(xù)暴露4周，暴露時間為晚上9點至第2天上午9點，暴露期間豚鼠可在籠中自由活動。揚聲器置于鼠籠正上方，一個籠子有4格，每次可對 4只豚鼠進行暴露。聲強校準(zhǔn)借助AWA6228+型多功能聲級計進行，鼠籠內(nèi)各部位聲強變化不超過1 dB。暴露后豚鼠置于正常安靜環(huán)境下喂養(yǎng)至相應(yīng)時間點。

1.3聽功能測試 實驗組在噪聲暴露結(jié)束當(dāng)日和結(jié)束后2周進行測試;對照組于7周齡進行1次測試。

1.3.1聽覺電生理測試 測試在隔聲屏蔽箱中進行，采用TDT System 3和BioSigRZ測聽軟件進行閉合聲場給聲、記錄，測試前對豚鼠使用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，待麻醉狀態(tài)穩(wěn)定后進行測試，測試過程中維持動物體溫(37℃)。

通過DPOAE測試評估外毛細胞功能，測試頻率為6、8、12、16 kHz，兩個刺激原始音頻率關(guān)系為f2/f1=1.2，固定強度關(guān)系為L1=L2=65 dB SPL，記錄DPOAE幅值，2f1-f2幅值高于本底噪聲6 dB時即為引出DPOAE。

通過ABR測試評估聽覺中樞(聽神經(jīng)到丘腦水平聽覺神經(jīng)系統(tǒng))的聽反應(yīng)[6]，記錄電極置于豚鼠兩側(cè)耳廓前緣連線中點皮下，參考、接地電極置于測試耳、非測試耳耳后皮下，極間電阻小于1 kΩ。刺激聲為6、8、12、16 kHz短純音(時程10 ms，上升/下降時間0.5 ms)，刺激速率為11.1次/秒，掃描時間10 ms，疊加512次，帶通濾波500～3 000 Hz，50 Hz陷波防止交流電干擾，以能分辨出可重復(fù)的ABR波Ⅲ的最低刺激聲強度為閾值，并記錄刺激聲強度為80 dB SPL時ABR波Ⅰ潛伏期、幅值及波Ⅳ的幅值。

通過GIN-ABR測試評估時域處理能力[7]，電極放置同ABR測試，刺激聲為80 dB SPL寬帶噪聲(WBN)和無聲間隙(Gap)組成的脈沖串，兩個WBN(NB1、NB2)間嵌入一個Gap，共7種脈沖串(Gap為0、1、2、4、8、16、32 ms)，WBN持續(xù)時間為25 ms，上升、下降時間為0.5 ms，刺激速率為3.3次/秒，記錄疊加200次，掃描時間為200 ms，記錄由NB2觸發(fā)的ABR波Ⅰ、波Ⅳ幅值。

1.3.2聽覺行為測試 通過ASR測試評估動物的響度感知，ASR指動物對突然的高強度聲刺激產(chǎn)生的防御性行為反射(面、頸部和肢體骨骼肌的運動)[8]，可通過重力傳感器記錄反射運動強度來評估。采用行為測試系統(tǒng)Panlab和軟件Packwin2.0進行測試。測試方法：開始前豚鼠在測試箱中安靜習(xí)服3分鐘，測試共5種路徑，分別為不含驚跳刺激聲的基線路徑和4種強度(70、80、90、100 dB SPL)的驚跳刺激(白噪聲，時程40 ms)試驗路徑(圖1)，每種路徑重復(fù)10次(共50次)，以偽隨機順序出現(xiàn)，相鄰兩次刺激之間的間隔在7～15 s之間隨機變化，以防動物對刺激產(chǎn)生適應(yīng)。每種路徑10次驚跳反射的平均值，即為對應(yīng)強度下的ASR幅值(儀器默認(rèn)單位為%)。

圖1 ASR測試信號模式圖

2 結(jié)果

2.1DPOAE測試結(jié)果 如表1所示，噪聲暴露結(jié)束當(dāng)日，實驗組豚鼠6、8 kHz的DPOAE幅值與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，12 kHz的DPOAE幅值小于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.068)，16 kHz的DPOAE幅值顯著低于對照組(P<0.01)，于暴露結(jié)束后2周恢復(fù)至與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

2.2ABR測試結(jié)果 噪聲暴露結(jié)束當(dāng)日，實驗組豚鼠在6、8 kHz的ABR閾值與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，12(P<0.05)、16 kHz(P<0.01)的ABR閾值顯著高于對照組，但于暴露結(jié)束后2周恢復(fù)，與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(表2)。暴露結(jié)束當(dāng)日實驗組豚鼠各頻率80 dB SPL刺激聲的ABR波Ⅰ潛伏期、幅值與對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表3、4)；暴露結(jié)束當(dāng)日，實驗組豚鼠在6(P<0.05)、8 kHz(P<0.01)(強度為80 dB SPL)的ABR波Ⅳ幅值顯著降低，暴露結(jié)束后2周仍與對照組存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(表5)。

2.3GIN-ABR測試結(jié)果 兩組在Gap為0、1 ms脈沖串刺激下均未引出ABR波形。噪聲暴露結(jié)束當(dāng)日與對照組的比較，t2值為實驗組暴露結(jié)束后2周與對照組的比較; *P<0.05，**P<0.01; 余表相同當(dāng)日，實驗組豚鼠在8、32 ms間隙的GIN-ABR波Ⅰ幅值顯著降低(P<0.05)，暴露結(jié)束后2周恢復(fù)，與對照組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表6)；暴露結(jié)束當(dāng)日，實驗組豚鼠各間隙的GIN-ABR波Ⅳ幅值均顯著降低(2 ms，P<0.05；4、8、16、32 ms,P<0.01)，暴露結(jié)束后2周，4 ms間隙的波Ⅳ幅值仍顯著小于對照組(P<0.05)(表7)。

表1 各組各頻率DPOAE幅值

表2 各組各頻率tb-ABR閾值

表3 各組各頻率tb-ABR波Ⅰ潛伏期

表4 各組各頻率tb-ABR波Ⅰ幅值

表5 各組各頻率tb-ABR波Ⅳ幅值

表6 各組各時程間隙GIN-ABR波Ⅰ幅值

表7 各組各時程間隙GIN-ABR波Ⅳ幅值

2.4聽覺行為測試結(jié)果 表8為ASR測試結(jié)果，噪聲暴露結(jié)束當(dāng)日，實驗組豚鼠在各強度刺激聲的驚跳程度和對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；暴露結(jié)束后2周，實驗組豚鼠的驚跳程度與對照組相比仍無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但對于100 dB SPL刺激聲，實驗組豚鼠的驚跳反射有減弱趨勢。

表8 各組各強度驚跳刺激聲ASR幅值

3 討論

聽敏度通常借助DPOAE、ABR等電生理測試進行評估，相較于可損傷耳蝸毛細胞導(dǎo)致永久性聽力損失的高強度噪聲暴露，較低劑量的噪聲暴露僅引起暫時性閾移(無毛細胞丟失)[9]，因此,在聽敏度評估時極具隱匿性。本實驗中，暴露結(jié)束后2周，實驗組12、16 kHz的DPOAE幅值及ABR閾值顯著恢復(fù)，很好地驗證了非損傷性噪聲暴露的后果——暫時性閾移，說明85 dB SPL白噪聲暴露對該頻段外毛細胞功能的損害是可恢復(fù)的。有研究表明可引起暫時性閾移的中等強度噪聲暴露雖不會損傷外毛細胞，但是會導(dǎo)致耳蝸內(nèi)毛細胞帶狀突觸的不可逆減少，并伴有波Ⅰ振幅下降[10]。本研究實驗組的暫時性閾移僅發(fā)生在12、16 kHz，可能與耳蝸的聲音傳遞部位編碼機制有關(guān),即：雖然白噪聲(20 Hz～20 kHz)會造成基底膜各部位的振動，但由于行波在基底膜上的傳播都經(jīng)過耳蝸底部，這里是耳蝸內(nèi)液體脈沖波的集中作用點，承受著較大而頻繁的聲負荷，因此,蝸底(感受高頻區(qū))比蝸頂(感受低頻區(qū))更易受到聲創(chuàng)傷。文中實驗組各頻段(強度為80 dB SPL)的ABR波Ⅰ幅值僅略低于對照組，且波Ⅰ潛伏期與對照組無顯著差異，表明外周聽功能未受到顯著傷害，但也不排除暴露頻寬外頻段的ABR波Ⅰ幅值降低的可能[11]。

關(guān)于長時中等強度噪聲暴露對聽覺中樞的可塑性影響，在明確沒有聽力損失的基礎(chǔ)上，需要對聽覺中樞功能進行評估。ABR能反映聽覺上行傳導(dǎo)通路不同水平神經(jīng)元的同步放電，是衡量整體聽覺中樞系統(tǒng)不同水平輸入輸出增益變化的重要工具。在嚙齒動物模型中，ABR波Ⅳ等同于人類的波Ⅴ，通常認(rèn)為波Ⅳ來源于外側(cè)丘系/下丘附近。本實驗中，實驗組6、8 kHz的DPOAE幅值、ABR閾值及波Ⅰ幅值與對照組間無統(tǒng)計學(xué)差異，表明噪聲暴露未損害實驗組動物該頻段的外周聽覺功能，而實驗組在6、8 kHz(強度為80 dB SPL)的ABR波Ⅳ幅值顯著降低，與Sheppard等[12]的發(fā)現(xiàn)一致，該現(xiàn)象被稱為負向中樞增益，指在中、低強度噪聲暴露未改變外周聽覺功能的前提下，外側(cè)丘系/下丘的聽反應(yīng)活動在特定頻率出現(xiàn)減弱。這與高強度噪聲暴露的中樞可塑性后果相悖，如100 dB SPL噪聲暴露會起引動物外周聽覺的損傷，從而聽覺中樞會因外周輸入的減少而代償性增強神經(jīng)活動，即中樞代償增益彌補外周損失以恢復(fù)部分聽功能[13,14]，可見，無論噪聲暴露是否引起損傷都會導(dǎo)致一定的中樞可塑性后果。本實驗中的較低強度噪聲刺激的持續(xù)輸入導(dǎo)致動物聽覺中樞對噪聲環(huán)境產(chǎn)生了適應(yīng)，這種可塑性變化可能與治療聽覺過敏的低級聲療法有關(guān)。

聽覺驚跳反射通路由聽神經(jīng)、耳蝸腹側(cè)核、外側(cè)丘系、腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核和脊髓運動神經(jīng)元等組成[15]，有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)強噪聲短時暴露的幼年大鼠成年后聽覺反應(yīng)正常，但對高強度白噪聲的ASR幅度顯著降低，因未成熟的聽覺系統(tǒng)通常表現(xiàn)出較低的興奮性，提示了噪聲誘發(fā)的聽覺發(fā)育不良后果[16]。本實驗中，實驗組噪聲暴露結(jié)束當(dāng)日的聽覺驚跳程度與對照組無差異，暴露結(jié)束后2周ABR反應(yīng)閾恢復(fù)，同時其對100 dB SPL刺激聲的驚跳程度有減弱趨勢，表明85 dB SPL白噪聲暴露對發(fā)育期聽覺中樞的影響是一個漸進過程，可能提示了中等強度噪聲長期暴露對中樞可塑性的影響。Rybalko等[17]發(fā)現(xiàn)經(jīng)噪聲暴露處理的幼年動物聽覺驚跳程度異常增加，雖然驚跳程度的變化具有年齡依賴性和頻率依賴性，但其成年后的驚跳程度顯著低于對照組，表明噪聲暴露導(dǎo)致的發(fā)育障礙包括了復(fù)雜的適應(yīng)性和代償性變化，與成年動物的暴露后果不同。

Amanipour等[7]曾將GIN-ABR測試應(yīng)用于強噪聲暴露動物的聽覺評估中，發(fā)現(xiàn)噪聲暴露會損害動物的時域處理能力。GIN-ABR刺激聲由兩個WBN(NB1、NB2)間嵌入一個無聲間隙(Gap)組成，每次給聲聽覺系統(tǒng)需要從NB1恢復(fù)以便有效地處理NB2，因此NB2觸發(fā)的ABR波形分化可反映聽覺腦干處理無聲間隙的能力。本研究發(fā)現(xiàn)Gap的時程越長，總體上NB2觸發(fā)的ABR波幅越高，能引出NB2完整ABR波形的間隙均大于2 ms。動物因聽覺中樞退化引起的聽覺時域處理異?？赏ㄟ^NB2波Ⅰ、Ⅳ幅值來評估，本研究分析了NB2觸發(fā)的ABR波Ⅰ、Ⅳ幅值，暴露結(jié)束后2周，實驗組在各頻段反應(yīng)閾恢復(fù)的基礎(chǔ)上，4 ms間隙的ABR波Ⅳ幅值并未恢復(fù)，ABR反應(yīng)幅值降低正是腦干神經(jīng)回路興奮性降低的表現(xiàn)，推測是噪聲暴露干擾了中樞的自然可塑性發(fā)育過程。Williamson等[18]曾提出，機體老化帶來的聽覺時間編碼困難，除了耳蝸、蝸神經(jīng)損傷等外周處理問題外，還與聽覺中樞的神經(jīng)缺陷有關(guān)，因此,推測中等強度噪聲暴露對聽覺中樞的影響與機體老化機制類似，但因為幼年個體的聽覺中樞仍處于發(fā)育階段，導(dǎo)致聽覺中樞的神經(jīng)編碼能力發(fā)生了復(fù)雜的漸進性變化。這也提示閾上聽功能測試更有助于發(fā)現(xiàn)噪聲暴露的隱匿性危害。可見,閾上聽功能測試對噪聲性隱匿性聽力損失的評估至關(guān)重要，希望將來可以結(jié)合形態(tài)學(xué)分析和更多行為學(xué)分析，來探究中、低強度噪聲暴露對聽覺通路的系統(tǒng)性影響。

綜上所述，本研究中實驗組幼年豚鼠的高頻聽力產(chǎn)生暫時性閾移(于暴露結(jié)束后2周恢復(fù))，但ABR的波I幅值未發(fā)生顯著變化，根據(jù)Kujawa等[11]的研究，這不符合突觸損傷的隱性聽力損失表現(xiàn)，因此推測本研究實驗組動物的耳蝸毛細胞及其突觸形態(tài)可能無顯著改變，并在此基礎(chǔ)上對聽覺中樞的可塑性變化展開探究。當(dāng)然，也不完全排除ABR波I振幅與毛細胞突觸損失不一致的結(jié)果。希望今后能專門針對這一問題進行研究，為綜合評估中、低強度噪聲暴露對聽覺中樞可塑性的隱匿影響提供參考。