陳文輝，于龍，劉文韜，翟文龍

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽胰外科，河南 鄭州 450052)

膽囊癌(gallbladder cancer，GBC)是常見的膽道惡性腫瘤，在同期膽道疾病中，GBC的發(fā)病率達(dá)0.4%～3.8%，在整個(gè)消化系統(tǒng)惡性腫瘤中居第六位，且逐年上升，由于GBC發(fā)病隱匿，多數(shù)確診時(shí)已屬中晚期，導(dǎo)致GBC患者病死率高，生存質(zhì)量極差[1-3]。研究證實(shí)，在膽道系統(tǒng)惡性腫瘤各種發(fā)病因素中，微生物因素被認(rèn)為是重要的因素之一[4]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)有數(shù)萬億的微生物寄居在人類胃腸道，其主要致癌機(jī)制包括介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、改變免疫應(yīng)答、產(chǎn)生致癌代謝物和DNA損傷[5-6]。腸道菌群在肝外膽管惡性腫瘤中的作用已經(jīng)得到廣泛關(guān)注[7]。腸道菌群在胃腸道腫瘤中所起作用已有文獻(xiàn)證實(shí)，在肝、胰腺等其他消化系統(tǒng)腫瘤中可能的作用也陸續(xù)有研究報(bào)道[8-9]。目前，關(guān)于GBC發(fā)病過程中腸道菌群變化特點(diǎn)和潛在機(jī)制的研究在國內(nèi)外鮮有報(bào)道。因此本研究采用高通量測序技術(shù)，探討GBC患者腸道菌群分布規(guī)律及變化特點(diǎn)，并通過PICRUSt2預(yù)測菌群功能差異，旨在闡述GBC人群中腸道菌群特點(diǎn)及其與GBC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為探索腸道菌群在GBC中的具體機(jī)制及疾病的潛在治療方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣本收集選取2020年9月至2021年9月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科就診的14例GBC患者為研究對(duì)象(Group_1：N1001～N1014)，診斷符合2020年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)肝膽腫瘤臨床實(shí)踐指南(Ⅴ1版)[10]，其中男8例，女6例，年齡為(53.20±10.58)歲；并招募9例健康志愿者作為健康對(duì)照組(Con：B16S26～B16S34)，兩組患者性別、年齡相匹配。用一次性無菌收集勺收集清晨糞便至無菌糞便收集器中，置于冰盒送往實(shí)驗(yàn)室，分裝后立即置于-80 ℃冰箱中進(jìn)行凍存待檢，凍存時(shí)間少于1個(gè)月。納入標(biāo)準(zhǔn)：GBC組病理診斷為原發(fā)性膽囊惡性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：1個(gè)月前使用抗生素或益生菌治療史；放化療、靶向免疫治療史；膽道系統(tǒng)手術(shù)史；其他腫瘤史。本研究通過鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2018-KY-83)，在研究開始前均簽署知情同意書。

1.2 16S核糖體RNA(16S rRNA)基因測序使用基因提取試劑盒提取樣本基因組DNA，使用瓊脂糖凝膠電泳及NanoDrop2000分光光度計(jì)檢測DNA濃度。為了確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性，根據(jù)選擇的測序區(qū)域，使用帶barcode的特異引物，Takara公司的Tks Gflex DNA Polymerase，以基因組DNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增。挑選16S V3～V4區(qū)(引物343F和798R)作為細(xì)菌多樣性鑒定對(duì)應(yīng)區(qū)域。采用電泳檢測法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，后經(jīng)純化、二輪PCR、再檢測、再純化，最后用Qubit定量法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量。等量混樣后，上機(jī)測序。

1.3 微生物分析1個(gè)可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)指相似度大于或等于97%的參數(shù)序列。使用QIIME軟件包挑選出各個(gè)OTU的代表序列，并將所有代表序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)注釋。使用R軟件評(píng)估不同樣本之間的相似性，并根據(jù)OUT信息進(jìn)行聚類分析和主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)，繪制PCoA圖。利用TAYC系數(shù)計(jì)算每個(gè)樣本進(jìn)化微生物群落之間的距離，表示為兩組之間不顯著的聚類樹。算術(shù)平均法用于描述多個(gè)樣本之間的差異(即1-相似度)。采用線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)效應(yīng)大小(LDA effect size，LEfSe)方法篩選特異性菌群(默認(rèn)線性判別值為4)。利用R語言進(jìn)行關(guān)聯(lián)與模型預(yù)測分析?；赑ICRUSt2進(jìn)行差異菌群的京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)[11]代謝途徑功能預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 樣本OTUs統(tǒng)計(jì)及分布通過花瓣圖可知，14個(gè)GBC組糞便樣本與9個(gè)健康對(duì)照組糞便樣本共有39個(gè)OTUs，分組后，韋恩圖分析可見，在GBC組和健康對(duì)照組中有2 320個(gè)相同OTUs，除此之外，823個(gè)OTUs和1 550個(gè)OTUs分別為GBC組和健康對(duì)照組各自特有的。見圖1。

A為花瓣圖；B為韋恩圖。圖1 OTUs分布圖

2.2 GBC組與健康對(duì)照組α多樣性為了分析生物環(huán)境內(nèi)物種的多樣性程度，采用Chao1指數(shù)、Shannona指數(shù)、goods_coverage指數(shù)、observed_species指數(shù)、simpson指數(shù)5個(gè)α多樣性指數(shù)。Chao1指數(shù)越大、Shannona指數(shù)越高表明微生物豐富度越大、多樣性越高；goods_coverage指數(shù)能較為真實(shí)地反映樣品的測序深度；observed_species指數(shù)大小能夠很好指示測序數(shù)據(jù)量的合理性；simpson指數(shù)用來表征群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度，5個(gè)α多樣性指標(biāo)在兩組樣本間均為GBC組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組細(xì)菌間多樣性比較

2.3 GBC組與健康對(duì)照組患者β多樣性采用非加權(quán)和加權(quán)Unifra的2種PCoA法分析GBC組與健康對(duì)照組的微生物群落結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)兩組的腸道細(xì)菌群落存在顯著差異，各自分布在相對(duì)獨(dú)立區(qū)域。見圖2。

A為非加權(quán)PCoA圖；B為加權(quán)PCoA圖。圖2 β多樣性分析PCoA圖

2.4 不同水平腸道微生物區(qū)系的豐度和結(jié)構(gòu)變化在所有樣本檢出的菌門中，前4位優(yōu)勢菌門分別為Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria，GBC組和健康對(duì)照組相同。與健康對(duì)照組相比，GBC組Proteobacteria相對(duì)豐度增高(t=4.265，P<0.001)，Bacteroidetes相對(duì)豐度減少(t=6.533，P<0.001)。較健康對(duì)照組，GBC組Firmicutes相對(duì)豐度有增加的趨勢，Actinobacteria相對(duì)豐度有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.359、1.000，P>0.05)。GBC組與健康對(duì)照組相比，在門水平上，7個(gè)菌門差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，分別為Bacteroidetes、Proteobacteria、Entotheonellaeota、Acidobacteria、Patescibacteria、Dependentiae、Deferribacteres(t分別為6.533、4.265、3.133、3.031、2.465、2.352、2.191，P<0.05)。GBC組和健康對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的細(xì)菌在屬水平上共有140種，其中前10菌屬分別為Escherichia-Shigella、Bacteroides、Prevotella_9、Prevotella_2、Parabacteroides、Parasutterella、Alistipes、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lachnospira(P<0.05)。見圖3。

A為門水平相對(duì)豐度分布圖；B為門水平前4位菌門直方圖；C為屬水平前10位菌屬分布箱式圖；D為屬水平前15位差異菌群分布熱圖；***表示P<0.001。圖3 門、屬水平菌群分布圖

2.5 LefSe分析篩選差異菌屬LefSe分析揭示兩組或以上生物群落差異物種的組成差異。物種注釋分支例圖展示GBC組和健康對(duì)照組在不同分類水平上的最大不同。根據(jù)LEfSe分析結(jié)果，在GBC組中，Enterobacteriales、Proteobacteria、Klebsiella、Lactobacillales豐度高于健康對(duì)照組；Roseburia、Prevotella_2、Prevotella_9、Bacteroidaceae豐度低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LDA=4，P<0.05)。見圖4。

A為差異物種注釋分支例圖；B為差異物種score圖。圖4 LefSe分析圖

2.6 關(guān)聯(lián)和模型預(yù)測分析以豐度前30的屬為對(duì)象，利用R包繪制相關(guān)性heatmap圖，進(jìn)行Indicator分析和隨機(jī)森林圖繪制，結(jié)果如下。見圖5。

A為相關(guān)性heatmap圖，紅色為正相關(guān)，藍(lán)色為負(fù)相關(guān)；B為Indicator指示性物種范例圖；C為重要物種點(diǎn)圖，Mean Decrease Gini值越大表示該變量的重要性越大。圖5 關(guān)聯(lián)和模型預(yù)測分析圖

2.7 基于16S的KEGG功能預(yù)測利用PICRUSt2預(yù)測GBC組與健康對(duì)照組之間的KEGG通路，選取差異最顯著的前30條代謝通路：糖胺聚糖降解、溶酶體表達(dá)、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路等代謝通路表達(dá)減弱(P<0.05)；次生代謝產(chǎn)物的生物合成與降解、不飽和脂肪的生物合成、電子轉(zhuǎn)移載體等代謝通路表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。見圖6。

圖6 KEGG差異結(jié)果聚類heatmap圖

3 討論

腸道微生物區(qū)系參與物質(zhì)和能量的新陳代謝，促進(jìn)免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟，形成黏膜屏障，避免病原體攻擊[12]。通常，腸道微生態(tài)的平衡需要腸道菌群和宿主共同維持[13]。多種慢性疾病如結(jié)腸炎、結(jié)腸癌、膽結(jié)石[14]以及肥胖和糖尿病等代謝性疾病都是由于這種平衡被打破導(dǎo)致的[15]。有研究證實(shí)，其他消化道腫瘤如胃癌、肝癌等及神經(jīng)精神疾病均伴隨腸道菌群失調(diào)[8,16-17]，說明腸道菌群可能還有更多未知作用需要探索。就肝外膽道系統(tǒng)而言，國內(nèi)外研究相對(duì)匱乏。李濤等[7]通過收集肝外膽管癌、膽管結(jié)石和正常人群糞便標(biāo)本證實(shí)3組腸道菌群存在差異，由此推斷腸道菌群失調(diào)在疾病發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用?；谝陨涎芯浚狙芯坑接慓BC患者腸道菌群是否存在一定聯(lián)系。

本研究結(jié)果顯示，在α多樣性分析中，與健康對(duì)照組相比，GBC患者腸道菌群的Chao1指數(shù)和Shannon多樣性均降低。Sarhadi等[18]在關(guān)于胃癌的一項(xiàng)研究中取得了類似的結(jié)果。本研究結(jié)果與Wheatley等[19]發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端膽管癌患者腸道菌群多樣性高于正常健康人不同，后續(xù)需要更深入研究。就α多樣性而言，與Chao1指數(shù)相比，Shannon多樣性在描述微生物群落豐富度和均勻性方面更有優(yōu)勢。因此，腸道菌群Shannon多樣性下降可能標(biāo)志著GBC患者疾病狀態(tài)。GBC患者腸道菌群與正常健康組相比存在一定差異，在人體四大菌門中，Proteobacteria在GBC組中較健康對(duì)照組相對(duì)豐度增加。Proteobacteria中多種條件致病菌能產(chǎn)生脂多糖，脂多糖是一種內(nèi)毒素，是引起炎癥反應(yīng)的重要物質(zhì)。研究表明，長時(shí)間暴露于脂多糖的大鼠可導(dǎo)致肝快速損傷[20]。根據(jù)LefSe所示，Enterobacteriales、Proteobacteria、Klebsiella、Lactobacillales在GBC組中相對(duì)豐度增加。Escherichia-Shigella在GBC患者腸道菌群中富集，Bacteroides、Parasutterella等在GBC患者腸道菌群中的豐度有所降低。Escherichia-Shigella是腸桿菌主要菌屬之一，是人體重要致病菌之一，正常情況下在腸道內(nèi)與其他細(xì)菌處于平衡狀態(tài)。Escherichia-Shigella在人體內(nèi)主要有兩方面重要作用，其一，Escherichia-Shigella在誘發(fā)腸道炎癥方面扮演重要角色；其二，在炎癥環(huán)境中，Escherichia-Shigella可通過分泌腸桿素獲得更強(qiáng)的生存優(yōu)勢，加劇腸道微生態(tài)的紊亂[21]。根據(jù)Proteobacteria和Escherichia-Shigella研究結(jié)果，推測炎癥反應(yīng)在GBC疾病演變中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道，腸桿菌科的富集程度可能與某些腫瘤分期有關(guān)，如胃癌，且腸桿菌科在胃癌患者腸道中富集意味著患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)更高[22]。Bacteroides和Parabacteroides均為益生菌。Bacteroides可產(chǎn)生維生素K并具有抗炎能力[23]；而Parabacteroides除營養(yǎng)、免疫增強(qiáng)等作用之外，還有一定的抗腫瘤作用[24]。二者豐度降低可能在GBC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮一定作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在相關(guān)性和功能預(yù)測分析模型中，Escherichia-Shigella可定義為在GBC一定區(qū)域范圍內(nèi)能對(duì)生長環(huán)境產(chǎn)生較大影響的菌屬，Parasutterella作為區(qū)分GBC組和健康對(duì)照組間差異的關(guān)鍵性物種，其促進(jìn)MCA-205肉瘤的作用在體外試驗(yàn)中已有報(bào)道[25]，是否在GBC發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用和能否作為GBC新的早期診斷標(biāo)志菌群尚未可知。KEGG功能預(yù)測展示出差異菌群在代謝途徑上的潛在作用，但其具體作用機(jī)制仍未可知，需要進(jìn)一步更深層次的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群在GBC患者和健康人群的變化特點(diǎn)，表明腸道微生物在GBC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)生連續(xù)性變化，但本研究存在一定局限性，如樣本量較小、單中心研究等。未來需要大樣本量、多中心、多組學(xué)進(jìn)一步探討GBC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制與腸道菌群變化的內(nèi)在聯(lián)系，不僅有利于加深對(duì)GBC發(fā)病機(jī)制的理解，還有助于探尋GBC早期診斷標(biāo)志物和探索開發(fā)新型微生物療法。