韓 迪，劉智慧，莊 妍，孟 峻(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教研室，呼和浩特 00050；山西省中醫(yī)院檢驗(yàn)科；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；通訊作者,E-mail:nmfrank@6.com)

真核生物的生長(zhǎng)與繁殖依賴于細(xì)胞周期，一次細(xì)胞周期完成可以驅(qū)使細(xì)胞分裂產(chǎn)生兩個(gè)新的子細(xì)胞，典型的細(xì)胞周期包括G1、S、G2和M期[1]。在整個(gè)細(xì)胞周期進(jìn)程中，不同時(shí)期細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能及其物質(zhì)的含量、定位會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的改變，從而產(chǎn)生相應(yīng)的特點(diǎn)，尤其是在G2/M轉(zhuǎn)化的過程中，為適應(yīng)不同的功能，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生明顯的特征改變。細(xì)胞發(fā)生G2/M轉(zhuǎn)變的最基本機(jī)制是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase，Cdk1)的激活，細(xì)胞周期蛋白B1/CDK1的磷酸化控制細(xì)胞發(fā)生核膜破裂、紡錘體形成和染色質(zhì)濃縮，這是G2期進(jìn)入M期的關(guān)鍵步驟[2]。Cdk1激酶的活性受3個(gè)因素調(diào)控：第一，Cdk1激酶激活的前提是需要與它的細(xì)胞周期蛋白伴侶A或B結(jié)合形成一個(gè)完整的構(gòu)型，即形成CyclinA/B-Cdk1，從而驅(qū)動(dòng)細(xì)胞開始進(jìn)入M期[3]。第二，細(xì)胞周期蛋白H與Cdk7共同介導(dǎo)的保守T環(huán)殘基磷酸化(例如人Cdk1中的Thr161)是激活Cdk1達(dá)到最大活性所必需的環(huán)節(jié)[4,5]。第三，CyclinB-Cdk1復(fù)合物受Cdc25磷酸酶的正向調(diào)節(jié)[6]，Cdc25C磷酸酶激活CyclinB-Cdk1對(duì)調(diào)節(jié)G2/M進(jìn)程具有重要意義[7]，但在CyclinB-Cdk1復(fù)合物首次形成后，Wee1/PKMYT1激酶能夠通過磷酸化Cdk1的14位蘇氨酸和15位酪氨酸抑制該復(fù)合物的活性[6]。

Wee1最初是從裂殖酵母中提取出來的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶[8]。目前通過研究發(fā)現(xiàn)Wee1蛋白激酶家族有3個(gè)重要成員，即Wee1、PKMYT1和Wee2，其中Wee1被認(rèn)為是G2檢查點(diǎn)激酶，PKMYT1激酶是膜相關(guān)酪氨酸和蘇氨酸特異性細(xì)胞分裂周期蛋白2(cell division control protein 2，Cdc2)抑制激酶，而Wee2是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂抑制激酶[9]。目前關(guān)于Wee2的研究已經(jīng)證實(shí)：Wee2主要參與調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞(卵母細(xì)胞和精子)減數(shù)分裂的恢復(fù)[10]，并且增加Wee2的活性會(huì)阻滯1-細(xì)胞期受精卵的發(fā)育[11]。但Wee1作為Wee1蛋白激酶家族的重要成員，目前關(guān)于Wee1的研究，僅有文獻(xiàn)報(bào)道Wee1在非洲爪蟾成熟的卵母細(xì)胞至原腸胚胚胎階段均有表達(dá)，并且Wee1會(huì)導(dǎo)致G2期時(shí)間延長(zhǎng)，延緩非洲爪蟾1-細(xì)胞期受精卵的分裂[12]。但在小鼠1-細(xì)胞期受精卵中Wee1 mRNA及其蛋白表達(dá)和定位的具體研究甚少。

研究細(xì)胞周期的進(jìn)展有助于了解細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育情況，在眾多的哺乳動(dòng)物中，小鼠受精卵是研究細(xì)胞周期較好的模型之一。故本研究采用qRT-PCR、Western blot以及間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)小鼠1-細(xì)胞期受精卵中Wee1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，并觀察不同時(shí)期Wee1蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的分布情況，探討小鼠受精卵從1-細(xì)胞期到分裂為2-細(xì)胞胚胎過程中是否伴隨Wee1的表達(dá)水平和定位改變，為之后進(jìn)一步研究Wee1蛋白激酶對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步豐富哺乳動(dòng)物早期胚胎有絲分裂分子調(diào)控機(jī)制研究的相關(guān)理論。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)昆明系小鼠【SYXK(蒙)2015-0001】，雌鼠：4～6周(體質(zhì)量20 g左右/只)；雄鼠：8周以上(體質(zhì)量>30 g/只)。

1.2 主要試劑

孕馬血清促性腺激素，獸藥字：110914564，購自寧波三生公司；人絨毛膜促性腺激素，獸藥字：101631282，購自蘇州素仕公司；UNIRT-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒、BCA法微量蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒均購自上海生工公司；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；TransStart Tip Green RTPCR SuperMix試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE Gel Kit購自上海碧云天公司；Wee1蛋白抗體(ab203236)、β-連環(huán)蛋白抗體(ab6276)、山羊抗兔IgG二抗均購自美國(guó)Abcam公司；Triton X-100購自飛凈生物科技有限公司；Hoechst33258熒光染料、BSA均購自美國(guó)Sigma公司。

1.3 小鼠受精卵的采集與培養(yǎng)

取4～6周體質(zhì)量為20 g左右的雌性昆明系小鼠6～10只，中午12∶00-13∶00，腹腔注射孕馬血清促性腺激素10 IU/只。第2天中午12∶00-13∶00時(shí)腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)10 IU/只，并將注射HCG后的雌鼠與8周以上的雄鼠1 ∶1合籠過夜。次日清晨8∶00檢栓，處死有陰栓的雌鼠。剪開小鼠腹部，取出輸卵管，放入M2培養(yǎng)液清洗。在體視顯微鏡下撕開輸卵管壺腹部，用100 μl移液槍將自然流出的受精卵細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到0.3%透明質(zhì)酸酶溶液中，反復(fù)吹吸幾次，待去除卵丘細(xì)胞后，立即使用吸卵管將受精卵轉(zhuǎn)移到M2培養(yǎng)液中，用M2培養(yǎng)液清洗3～5次，去除殘留的透明質(zhì)酸酶、卵丘細(xì)胞和其他雜質(zhì)。將洗干凈的受精卵移入提前平衡好的M16培養(yǎng)液中，在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)期以備后期實(shí)驗(yàn)使用。HCG注射后11～13 h成熟的卵母細(xì)胞在輸卵管壺腹部完成受精并進(jìn)入有絲分裂細(xì)胞周期，在注射HCG后19 h收集G1期受精卵，在注射HCG后23 h收集S期受精卵，在注射HCG后27 h收集G2期受精卵，在注射HCG后29 h收集M期受精卵[13]。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)小鼠1-細(xì)胞期受精卵中Wee1 mRNA的表達(dá)水平

采用qRT-PCR分別檢測(cè)G1、S、G2、M期1-細(xì)胞期受精卵中Wee1 mRNA的表達(dá)水平。收集各期受精卵各100個(gè)分別放于4個(gè)1.5 ml EP管中，按照UNIRT-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說明書的步驟提取總RNA，并分別測(cè)定其在260 nm和280 nm處的吸光度，OD260/OD280值在1.8～2.0之間可用于反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物由上海生工公司合成(見表1)，反應(yīng)條件為：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，1個(gè)循環(huán)。用TransStart Tip Green RT-PCR SuperMix試劑盒擴(kuò)增Wee1目的基因，反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，45個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)。用β-actin作為內(nèi)參基因，使用CFX96熒光定量PCR儀檢測(cè)樣本Ct值，采用2-ΔΔCt計(jì)算Wee1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 Wee1和β-actin引物序列Table 1 Wee1 and β-actin primer sequences

1.5 Western blot檢測(cè)小鼠1-細(xì)胞期受精卵G1、S、G2、M期Wee1蛋白的表達(dá)水平

為研究Wee1蛋白的表達(dá)水平伴隨小鼠1-細(xì)胞期受精卵發(fā)育不同時(shí)期的變化，采用Western blot檢測(cè)各時(shí)期Wee1蛋白的表達(dá)水平。取4個(gè)時(shí)期受精卵各200個(gè)分別放于4個(gè)1.5 ml EP管中，經(jīng)3～4次凍融循環(huán)后，分別加入蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液(1 ∶100)充分裂解受精卵，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，上清為受精卵總蛋白。用BCA法測(cè)定各時(shí)期受精卵蛋白濃度。用10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)膜至0.45 μm硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別與0.5%脫脂奶粉稀釋的Wee1蛋白抗體(1 ∶1 000)和β-連環(huán)蛋白抗體(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，洗膜，與稀釋后的山羊抗兔IgG二抗(1 ∶1 000)室溫避光孵育1 h，TBST溶液洗滌3次后掃膜，測(cè)定Wee1蛋白和內(nèi)參β-actin蛋白的灰度值。用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以Wee1/β-actin表示W(wǎng)ee1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 間接免疫熒光觀察Wee1蛋白在小鼠1-細(xì)胞期受精卵發(fā)育各期的定位

利用間接免疫熒光技術(shù)觀察不同時(shí)期Wee1蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的定位情況。分別收集G1，S，G2，M期受精卵各200個(gè)，用PBS(含1%聚乙烯醇)浸洗，之后用4%POM固定液室溫固定1 h，PBST清洗后用0.1% Triton X-100通透10 min，在含5%BSA的PBS中封閉40 min。將處理完的受精卵轉(zhuǎn)入封閉液稀釋的Wee1蛋白抗體(1 ∶1 000)中4 ℃孵育過夜，洗去一抗之后放入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1 ∶100)室溫避光孵育1 h，洗去二抗加入Hoechst33258熒光染料(濃度為25 μg/ml)染色10 min，分別在530 nm、488 nm、260 nm波長(zhǎng)處激發(fā)標(biāo)本，在激光共聚焦顯微鏡下觀察核酸的染色情況以及Wee1蛋白在小鼠1-細(xì)胞期受精卵發(fā)育的各個(gè)時(shí)期的定位情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠1-細(xì)胞期受精卵G1、S、G2、M期Wee1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量及變化

Wee1 mRNA在小鼠1-細(xì)胞期受精卵發(fā)育過程的4個(gè)時(shí)期(G1、S、G2、M)均有不同程度的表達(dá)(見圖1)，相對(duì)表達(dá)量依次為1.107±0.004，1.343±0.007，1.597±0.008，1.177±0.006，可以明顯看出從G1至G2期Wee1 mRNA的表達(dá)量逐漸增加，在G2期Wee1 mRNA表達(dá)量達(dá)到最高，而當(dāng)小鼠1-細(xì)胞期受精卵進(jìn)入M期之后Wee1 mRNA表達(dá)量較G2期顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

與G2期比較，**P<0.01圖1 Wee1 mRNA在小鼠1-細(xì)胞期受精卵發(fā)育過程中相對(duì)表達(dá)量Figure 1 Relative expression of Wee1 mRNA in each stage of mouse one-cell stage zygote

2.2 小鼠1-細(xì)胞期受精卵G1、S、G2、M期Wee1蛋白的表達(dá)結(jié)果

小鼠1-細(xì)胞期受精卵的發(fā)育全程伴隨Wee1蛋白表達(dá)含量的變化。通過對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行灰度值分析發(fā)現(xiàn)：Wee1蛋白的表達(dá)量從G1期到G2期呈增加的趨勢(shì)，但當(dāng)受精卵進(jìn)入M期時(shí)Wee1蛋白表達(dá)量較G2期明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖2)。這與1-細(xì)胞期受精卵分裂過程中Wee1 mRNA表達(dá)水平的變化保持一致。

與G2期比較，*P<0.05，**P<0.01圖2 小鼠1-細(xì)胞期受精卵發(fā)育各期Wee1蛋白表達(dá)水平Figure 2 The expression level of Wee1 protein in each stage of mouse one-cell stage zygote

2.3 Wee1蛋白在小鼠1-細(xì)胞期受精卵發(fā)育各期的定位變化

間接免疫熒光結(jié)果顯示：小鼠1-細(xì)胞期受精卵G2/M的轉(zhuǎn)換過程伴隨著Wee1蛋白的核漿穿梭。通過觀察從卵母細(xì)胞受精到受精卵完成第一次分裂之前各個(gè)時(shí)期的紅色熒光信號(hào)可以發(fā)現(xiàn)：在G1期和S期，Wee1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，而在G2早期可以看到部分Wee1蛋白開始入核，到M期細(xì)胞核內(nèi)Wee1蛋白顯著增加(見圖3)。

藍(lán)色信號(hào)：DNA，紅色信號(hào)：Wee1圖3 Wee1在小鼠1-細(xì)胞期受精卵發(fā)育的不同時(shí)期的定位 (×400)Figure 3 The localization of Wee1 in different stages of mouse one-cell stage zygote (×400)

3 討論

在裂殖酵母中，Cdc2基因可以調(diào)節(jié)裂殖酵母細(xì)胞G1/S進(jìn)展和G2/M轉(zhuǎn)變[14]。從酵母到人類，Cdc2是保守的，在哺乳動(dòng)物中Cdc2同系物也能與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合，后來這些與細(xì)胞周期蛋白相關(guān)的激酶被命名為“細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶”或Cdk[15]。Cdk1激酶的激活是由其14位蘇氨酸和15位酪氨酸去磷酸化介導(dǎo)的，活化的Cdk1復(fù)合物可以驅(qū)動(dòng)有絲分裂[16]。在細(xì)胞分裂間期，Wee1可以通過磷酸化Cdk1的15位酪氨酸來抑制Cdk1活性，從而阻止細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂，進(jìn)而延緩細(xì)胞周期進(jìn)程[17]。

已有研究證明：在粟酒裂殖酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程中，Wee1以促細(xì)胞分裂因子(mitosis promoting factor, MPF)依賴的方式聚集在紡錘體極體(spindlepoleboby, SPB)的表面，并可以通過改變SPB亞細(xì)胞定位調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂[18]。目前有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠1-細(xì)胞期受精卵發(fā)育的過程中伴隨著Wee1B蛋白的核漿轉(zhuǎn)位[19]。但是尚不明確Wee1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期不同時(shí)期的表達(dá)含量是否存在變化，也不能確定Wee1蛋白激酶是否通過改變其亞細(xì)胞定位對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂過程產(chǎn)生一定影響。

小鼠受精卵是研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期天然的細(xì)胞模型，研究早期胚胎發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制，有助于克服胚胎早期發(fā)育障礙，為不孕不育癥的治療提供新思路。探究小鼠受精卵發(fā)育過程中特定基因的表達(dá)和定位規(guī)律，可以應(yīng)用于人類輔助生殖，通過對(duì)特定基因的干預(yù)，縮短受精卵在體外培育的時(shí)間，盡早將胚胎植入子宮從而降低外界因素對(duì)受精卵發(fā)育產(chǎn)生的不良影響，使胚胎得到更好的發(fā)育。

在本研究中，我們通過qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)小鼠1-細(xì)胞期受精卵發(fā)育全過程各個(gè)時(shí)期(主要是G1、S、G2、M期)Wee1 mRNA和Wee1蛋白的表達(dá)，并且通過間接免疫熒光技術(shù)觀察Wee1蛋白的亞細(xì)胞定位。我們發(fā)現(xiàn)小鼠1-細(xì)胞期受精卵G2/M轉(zhuǎn)換過程伴隨Wee1 mRNA和蛋白的下調(diào)。在小鼠1-細(xì)胞期受精卵發(fā)生有絲分裂的過程中存在Wee1蛋白激酶亞細(xì)胞的重新定位。這提示我們Wee1蛋白激酶可能參與調(diào)控小鼠早期胚胎的發(fā)育，本課題組今后將通過顯微注射構(gòu)建的Wee1表達(dá)載體(野生型、突變型)，具體研究Wee1對(duì)小鼠1-細(xì)胞期受精卵卵裂率的影響；并通過Western blot技術(shù)檢測(cè)Wee1的磷酸化/去磷酸化與小鼠1-細(xì)胞期受精卵G2/M轉(zhuǎn)換(Cdc2-Tyr15脫磷酸化)發(fā)生的順序，進(jìn)一步證實(shí)Wee1是否通過磷酸化/去磷酸化在哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮作用。據(jù)報(bào)道，在爪蟾中14-3-3蛋白與Wee1蛋白激酶的結(jié)合與解離可以控制Wee1蛋白激酶在不同時(shí)期發(fā)生核漿轉(zhuǎn)位[20]。這說明Wee1蛋白激酶也可能通過與其他調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的分子(如Cdc25B、Cdc14A、PKA、14-3-3ε蛋白)共同作用，參與調(diào)節(jié)小鼠1-細(xì)胞期受精卵的發(fā)育，這也將是本課題組今后研究的方向之一。