王曉輝，劉小玲，胡 軍，王 樂，蔣 鋒(陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，西安 710068；通訊作者,E-mail:docjiangfeng@163.com)

非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)血管破裂導(dǎo)致的腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)占急性腦血管病的20%～30%，ICH后幾乎立即出現(xiàn)血腫周圍水腫(perihematomal edema，PHE)，并且血腫會導(dǎo)致腦組織受壓，從而引發(fā)機(jī)械損傷和繼發(fā)性腦損傷，以及炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元死亡和神經(jīng)功能缺損[1]。在ICH發(fā)病率逐年上升的同時，約20%的ICH患者接受手術(shù)治療后仍遭受不同程度的神經(jīng)功能障礙[2]。

微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性長度為18～23個核苷酸的小型非編碼RNA，通過與靶mRNA的3′-UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)靶mRNA表達(dá)[3]。血清miRNA水平失調(diào)與癌癥、心血管疾病、缺血性中風(fēng)和ICH等腦損傷緊密關(guān)聯(lián)[4-6]。因此，血清miRNA被認(rèn)為是可靠的疾病診斷生物標(biāo)記[7,8]。

miRNA陣列分析研究顯示miR-27a-3p在ICH患者血清中表達(dá)下調(diào)[9]，并在動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血患者腦脊液中也檢測到miR-27a-3p表達(dá)水平降低，而血管痙攣患者miR-27a-3p表達(dá)水平降低尤為明顯[10]。但目前尚不清楚miR-27a-3p能否減輕ICH引起的腦損傷和神經(jīng)炎癥反應(yīng)。本研究通過構(gòu)建腦出血大鼠模型，轉(zhuǎn)染miR-27a-3p進(jìn)而研究miR-27a-3p在大鼠ICH引起的腦損傷中的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

成年雄性Sprague-Dawley大鼠購于邯鄲康業(yè)制藥有限公司(許可證：SYXK(冀)2017-004)，體質(zhì)量250～280 g。pcDNA3.1-EGFR重組質(zhì)粒委托上海吉瑪基因合成。原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Roche公司，瑞士)，BCA分析試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo Scientific公司，美國)，Hairpin-itTMmiR-21/mRNA RT-PCR定量試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。水合氯醛(Sigma公司，美國)，二氨基聯(lián)苯胺(Sigma，美國)，裂解緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，LipofectamineTM3000試劑(ThermoFisher公司，美國)，TRIzol試劑(Invitrogen公司，美國)。DAPI(北京索萊寶科技有限公司)，MPO抗體、一抗Occludin和一抗Claudin-5(武漢博士德生物工程有限公司)，OX-42抗體、Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，一抗EGFR和β-actin(Santa Cruz公司，美國)。PVDF膜(Millipore公司，美國)，奧林巴斯IX81顯微鏡(OLYMPUS，日本)。

1.2 ICH大鼠模型構(gòu)建

ICH模型建模方法如下：大鼠經(jīng)35 mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉后，取尾動脈不抗凝血50 μl，通過腦立體定向技術(shù)注入大鼠腦內(nèi)右側(cè)尾殼核，術(shù)畢后用醫(yī)用骨蠟封閉針孔，造模完成。40只建模的大鼠共有36只建模成功，成功率為90%。將36只建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、miR-27a-3p干預(yù)組(miR-27a-3p組)和miR-27a-3p+pcDNA3.1-EGFR干預(yù)組(pcEGFR組)，每組12只。另取12只大鼠作為假手術(shù)組，假手術(shù)組大鼠只進(jìn)針不注血。在誘導(dǎo)ICH模型成功后15 min，將miR-27a-3p或重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFR(10 μmol/L)加到LipofectamineTM3000中，通過立體定向技術(shù)1 μl/min連續(xù)注射，構(gòu)建miR-27a-3p干預(yù)組和miR-27a-3p+pcDNA3.1-EGFR干預(yù)組(pcEGFR)。假手術(shù)組和模型組大鼠腦內(nèi)同時注射等量轉(zhuǎn)染試劑。術(shù)后縫合創(chuàng)口皮膚，讓大鼠恢復(fù)并自由進(jìn)食24 h。本研究經(jīng)陜西省人民醫(yī)院倫理委員會審批通過(審批號：SXDL-S20210318-02)。

1.3 免疫熒光染色檢測MPO陽性細(xì)胞數(shù)量變化

在大鼠ICH造模成功后72 h，對4組大鼠采用戊巴比妥鈉麻醉處理，然后斷頭處死，立即將大鼠腦組織取出并分成5個部分超低溫冷凍備用。取假手術(shù)組、模型組和miR-27a-3p組大鼠部分腦組織經(jīng)4%多聚甲醛固定液于4 ℃下持續(xù)固定24～48 h，再進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，在切片機(jī)上連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm。將切片在60 ℃下預(yù)熱30 min，經(jīng)二甲苯脫蠟，然后以濃度遞減乙醇重新水化。將切片用山羊血清4 ℃封閉過夜。切片于過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)抗體(1 ∶200稀釋)在4 ℃緩慢搖動孵育過夜。將切片用免疫染色洗滌液沖洗3次。再將切片與Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶300稀釋)在黑暗中緩慢搖動孵育1 h。最后，用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色。使用奧林巴斯IX81顯微鏡觀察拍照，并對MPO陽性細(xì)胞進(jìn)行定量分析。

1.4 TUNEL分析細(xì)胞凋亡

使用原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒分析假手術(shù)組、模型組和miR-27a-3p組大鼠腦血腫周圍區(qū)域的細(xì)胞凋亡情況。腦組織切片與Triton X-100溫育去除石蠟化，并用3%過氧化氫淬滅內(nèi)源性過氧化物酶。根據(jù)試劑盒使用說明，將切片與TUNEL反應(yīng)混合液孵育，標(biāo)記凋亡細(xì)胞中斷裂的DNA鏈。用PBS洗滌3次，滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色。熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡細(xì)胞(激發(fā)光波長為450～500 nm，檢測波長為515～565 nm，400倍光鏡)，隨機(jī)觀察并計數(shù)血腫周圍3個不重復(fù)視野內(nèi)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目，計算平均值。

1.5 免疫組織化學(xué)分析小膠質(zhì)細(xì)胞活化水平變化

取假手術(shù)組、模型組和miR-27a-3p組大鼠的腦組織切片經(jīng)PBS漂洗后，與3 g/L的Triton X-100孵育脫蠟，用PBS洗滌3次。切片與小鼠抗OX-42抗體(1 ∶3 000稀釋)孵育過夜，PBS洗滌3次。將切片與生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1 ∶500稀釋)孵育4 h，PBS洗滌3次。再將切片與生物素-卵白素-HRP復(fù)合物(1 ∶500稀釋)浸泡4 h，PBS洗滌3次。用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸鎳銨法染色，用蒸餾水沖洗3次。使用奧林巴斯IX81顯微鏡觀察并采集圖像，選擇血腫周圍3個不重復(fù)視野，OX-42產(chǎn)物呈藍(lán)色判定為陽性。

1.6 Western blotting分析Occludin、Claudin-5和EGFR蛋白表達(dá)水平

取假手術(shù)組、模型組和miR-27a-3p組大鼠的腦組織與裂解緩沖液混合后在冰上裂解處理。裂解混合物以10 000g，4 ℃離心10 min，使用BCA分析試劑盒測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后與抗Occludin(1 ∶400稀釋)、抗Claudin-5(1 ∶1 000稀釋)、抗EGFR(1 ∶400稀釋)和β-actin(1 ∶1 000稀釋)在4 ℃孵育過夜。膜用0.15%Tween 20-TBS洗滌4次，然后將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000稀釋)在37 ℃下孵育45 min。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，使用Media Cybernetics Gel-Pro Analyzer軟件(Rockville)通過光密度測定法確定蛋白條帶強(qiáng)度。

1.7 qRT-PCR檢測基因表達(dá)水平

采集假手術(shù)組、模型組、miR-27a-3p組和pcEGFR組各6只大鼠的眼眶靜脈叢血0.5 ml，在4 ℃下以2 000 r/min離心10 min后獲得血清；取假手術(shù)組、模型組、miR-27a-3p組和pcEGFR組大鼠的腦組織。使用TRIzol試劑抽提大鼠腦組織和血清的總RNA，使用Hairpin-itTMmiR-21/mRNA RT-PCR定量試劑盒進(jìn)行cDNA擴(kuò)增和qRT-PCR檢測，使用7500HT PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR操作，設(shè)計相關(guān)引物序列(見表1)。所有PCR反應(yīng)均按照標(biāo)準(zhǔn)PCR條件進(jìn)行：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。以U6或β-actin為作內(nèi)部參考基因。使用Opticon Monitor分析軟件(MJ Research)計算循環(huán)閾值(Ct值)，通過相對定量(2-ΔΔCt)計算表達(dá)的倍數(shù)變化。

表1 qRT-PCR檢測相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer sequences of related genes for qRT PCR

1.8 miR-27a-3p與EGFR的靶向關(guān)系分析

采用Target Scan Human和miRDB在線預(yù)測miR-27a-3p與EGFR的靶向關(guān)系。

1.9 腦含水量測定

取假手術(shù)組、模型組、miR-27a-3p組和pcEGFR組這4組大鼠的腦組織，使用干重法測定各組大鼠腦水分含量。取各組部分備用組織樣品放置在鋁箔片上分析天平稱量獲得濕重，然后在電烤箱中于100 ℃干燥24 h，再稱量得到干重。使用以下公式計算腦含水量：(濕重-干重)/濕重×100%。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，使用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用Pearson相關(guān)性分析進(jìn)行miR-27a-3p表達(dá)水平和EGFR蛋白表達(dá)水平之間的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 造模大鼠血清以及血腫周圍組織的miR-27a-3p水平變化

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠的血清中miR-27a-3p表達(dá)水平降低(P<0.01)，血腫周圍組織中miR-27a-3p表達(dá)水平降低(P<0.01，見圖1)。

與假手術(shù)組比較，**P<0.01圖1 ICH模型組和假手術(shù)組大鼠的血清和血腫周圍組織的miR-27a-3p表達(dá)水平檢測Figure 1 The miR-27a-3p expression in the serum and the edema around the hematoma in ICH rats and sham rats

2.2 miR-27a-3p干預(yù)對大鼠緊密連接蛋白表達(dá)的影響

咬合蛋白(Occludin)和閉合蛋白(Claudin)的Western blotting分析結(jié)果表明，模型組大鼠的Occludin和Claudin-5蛋白表達(dá)水平均低于假手術(shù)組(P<0.001)，而miR-27a-3p組大鼠Occludin和Claudin-5蛋白表達(dá)水平則顯著高于模型組(P<0.05，見圖2)。

與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05圖2 Western blotting檢測miR-27a-3p對大鼠腦組織中緊密連接蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effects of miR-27a-3p on expression of tight junction proteins in rat brain tissue by Western blotting

2.3 miR-27a-3p干預(yù)對大鼠血腫周圍區(qū)域神經(jīng)元凋亡的影響

大鼠腦組織切片原位細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織切片幾乎沒有TUNEL陽性凋亡神經(jīng)元，模型組大鼠TUNEL陽性凋亡神經(jīng)元數(shù)量顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；與模型組比較，miR-27a-3p組大鼠TUNEL陽性凋亡神經(jīng)元數(shù)量顯著降低(P<0.05，見圖3)。

紅色為神經(jīng)元細(xì)胞，綠色為凋亡神經(jīng)元細(xì)胞；與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05圖3 大鼠腦組織中神經(jīng)元NEUN染色和凋亡細(xì)胞TUNEL染色Figure 3 NEUN staining and TUNEL staining of apoptotic cells in rat brain tissue

2.4 miR-27a-3p干預(yù)對大鼠血腫周圍區(qū)域白細(xì)胞浸潤的影響

MPO免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的MPO陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，miR-27a-3p組大鼠的MPO陽性細(xì)胞數(shù)量降低(P<0.05，見圖4)。血腫周圍區(qū)域OX-42陽性小膠質(zhì)細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果表明，模型組大鼠血腫周圍區(qū)域OX-42陽性細(xì)胞數(shù)量顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)，而miR-27a-3p組大鼠OX42陽性細(xì)胞數(shù)量低于模型組(P<0.05，見圖4)。

與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05圖4 miR-27a-3p干預(yù)對大鼠腦血腫周圍區(qū)域白細(xì)胞浸潤和小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響Figure 4 Effect of miR-27a-3p interference on leukocyte infiltration and microglial activation in the pericerebral hematoma of rats

2.5 EGFR是miR-27a-3p的直接效應(yīng)靶標(biāo)

使用Target Scan Human和miRDB在線預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-27a-3p靶向EGFR的3′-UTR(見圖5A)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在36個ICH大鼠模型中，72 h時血清miR-27a-3p水平和EGFR蛋白表達(dá)水平之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.371，P=0.011，見圖5B)。

圖5 EGFR與miR-27a-3p的靶標(biāo)關(guān)系分析Figure 5 Analysis of target relationship between EGFR and miR-27a-3p

EGFR過表達(dá)實驗進(jìn)一步驗證了EGFR與miR-27a-3p間的相關(guān)性。qRT-PCR結(jié)果顯示，模型組大鼠EGFR的mRNA表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，miR-27a-3p組大鼠EGFR的mRNA表達(dá)水平相較于模型組顯著下降(P<0.05)，而pcEGFR組大鼠EGFR的mRNA表達(dá)水平明顯高于miR-27a-3p組(P<0.05，見圖6)。同時，大鼠腦含水量變化趨勢與qRT-PCR檢測結(jié)果一致(見圖6)。

與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與miR-27a-3p組比較，&P<0.05圖6 miR-27a-3p對大鼠EGFR和腦含水量的影響Figure 6 Effect of miR-27a-3p on EGFR and brain water content in rats

3 討論

腦出血(ICH)作為中老年人和高血壓病人這一群體的多發(fā)疾病，其發(fā)病突然，早期的死亡率很高，嚴(yán)重危害人類的身心健康康。ICH發(fā)生后出現(xiàn)的血腫會進(jìn)一步導(dǎo)致腦組織受壓，發(fā)生繼發(fā)性腦損傷，從而引發(fā)炎癥、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)損傷等一系列的生理變化。臨床上針對患者腦出血早期的診斷，對于患者病情程度的判斷和治療方案的制定十分重要。目前，血清miRNA已被認(rèn)為是可靠的腦部疾病診斷生物標(biāo)記，已有研究報道m(xù)iR-27a-3p在ICH患者血清中表達(dá)發(fā)生下調(diào)[9]。

在本研究結(jié)果中，miR-27a-3p在ICH模型大鼠的血清和血腫周圍組織中的表達(dá)均發(fā)生明顯下調(diào)，這與已報道的臨床中miR-27a-3p的數(shù)據(jù)結(jié)果一致[11]。miR-27a-3p干預(yù)可顯著緩解ICH誘導(dǎo)的腦水腫、神經(jīng)元凋亡，并抑制白細(xì)胞浸潤到ICH大鼠血腫周圍區(qū)域。這表明miR-27a-3p在維持ICH后大腦穩(wěn)態(tài)方面至關(guān)重要。

咬合蛋白(Occludin)和閉合蛋白(Claudin)是內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接復(fù)合物的主要構(gòu)成組分[12]，對維持血管和血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的正常生理功能尤為重要[13,14]。本研究中免疫熒光和Western blotting實驗結(jié)果顯示，ICH模型大鼠腦組織中Occludin和Claudin-5蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)，而miR-27a-3p的干預(yù)能夠顯著上調(diào)Occludin和Claudin-5蛋白的表達(dá)水平。這表明，miR-27a-3p可能通過上調(diào)緊密連接復(fù)合物表達(dá)水平，減輕ICH后期腦損傷程度。

細(xì)胞凋亡是ICH血腫周圍區(qū)域細(xì)胞死亡的主要形式[15-17]，抑制ICH誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡能夠顯著改善神經(jīng)功能障礙[18]。在本研究實驗結(jié)果中，miR-27a-3p干預(yù)可以顯著降低血腫周圍區(qū)域神經(jīng)元的凋亡率。這可能歸因于血腫周圍區(qū)域水腫和炎癥的減少[19]。

MPO蛋白水平及活性變化是多形核白細(xì)胞的特異性功能標(biāo)志和激活狀態(tài)標(biāo)志[20]，并參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的多個生理過程[21,22]，而炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦損傷的主要因素[23,24]。本研究實驗結(jié)果顯示，miR-27a-3p顯著減少了ICH模型大鼠血腫周圍區(qū)域中MPO陽性細(xì)胞數(shù)量。結(jié)合miR-27a-3p在維持血管和血腦屏障功能方面的作用，表明miR-27a-3p可降低白細(xì)胞浸潤，從而減少血腫周圍的炎癥損傷。

小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在清除死亡神經(jīng)細(xì)胞和恢復(fù)神經(jīng)功能方面發(fā)揮著重要作用[25,26]。然而，小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化會加劇ICH誘導(dǎo)的腦損傷[27]。抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化已顯示可減輕ICH引起的腦損傷[28]。本研究實驗結(jié)果顯示，miR-27a-3p能顯著降低OX-42陽性細(xì)胞激活為小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量。這表明miR-27a-3p可能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

隨著腦出血時間延長,血腫周圍腦組織EGFR表達(dá)逐漸上調(diào)[29]。而miR-7通過抑制EGFR/STAT3信號通路拮抗星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，能夠減輕大鼠腦出血后腦損傷[30]。本研究結(jié)果也表明，miR-27a-3p可能靶向EGFR的3′-UTR；而miR-27a-3p干預(yù)能夠顯著降低血腫周圍區(qū)域EGFR表達(dá)水平。

綜上，miR-27a-3p干預(yù)可顯著減輕ICH誘導(dǎo)的腦水腫，白細(xì)胞浸潤和神經(jīng)元凋亡，以減輕ICH神經(jīng)功能損傷。miR-27a-3p的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過調(diào)節(jié)緊密連接復(fù)合物和EGFR的表達(dá)來維持血腦屏障正常生理功能。miR-27a-3p有望作為一個新的藥理學(xué)靶點，通過刺激內(nèi)源性miR-27a-3p表達(dá)，或外源性輸入其激動劑，作為促進(jìn)腦出血后神經(jīng)功能恢復(fù)的新型治療策略。這也是我們下一步以動物為模型，展開miR-27a-3p相關(guān)藥理治療研究的重點方向。