白少云，李夢婷，曹子琴，單 爽，吳佳寶，何 寧,,,(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑系，合肥 00；藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點實驗室；安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所；現(xiàn)代藥物制劑安徽省工程技術(shù)研究中心；通訊作者,E-mail:hening86@6.com)

在中國南宋時期的《履巉巖本草》中，收載了一種特征與斷血流原植物非常相似的草藥“草血竭”，在民間應(yīng)用廣泛，且具有止血功效[1]。斷血流是安徽省“十大皖藥”之一，早在1977年就開始收載于《中國藥典》，主要以風(fēng)輪菜、燈籠草為中藥斷血流的來源，具有收斂止血之功效，可用于尿血、崩漏、鼻衄、創(chuàng)傷出血、牙齦出血，可口服及外用適量敷于傷口[2]。斷血流主要以其莖葉干品入藥，皂苷類及黃酮類是其主要化學(xué)成分，其中斷血流皂苷A是主要止血成分[3]。在臨床上斷血流良好的止血療效得到了驗證且應(yīng)用廣泛，并且也有很多文獻(xiàn)報道了其止血的藥理研究[4-6]。文獻(xiàn)記載將蔭風(fēng)輪粉末撒在清潔的出血傷面后，稍加壓迫，用繃帶等包扎可立即止血[7]。目前臨床應(yīng)用的斷血流產(chǎn)品主要有斷血流片、斷血流膠囊、斷血流顆粒、斷血流口服液等，這些劑型大多是通過內(nèi)服而發(fā)揮止血功效，而未見市售的斷血流外用產(chǎn)品，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能與斷血流外用止血性能的評價和機(jī)制研究不充分有關(guān)。本研究主要通過在體和離體的方式對斷血流的外用止血性能進(jìn)行評價，探討斷血流提取物對皮膚創(chuàng)傷的止血作用，為研發(fā)斷血流外傷止血產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

HH0-501超熱恒溫水浴(金壇市晶玻實驗儀器廠)；TG16A-WS臺式高速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(步琦實驗室設(shè)備貿(mào)易(上海)有限公司)；電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；血球計數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司)；顯微鏡(上海明茲精密儀器有限公司)。斷血流藥材(亳州藥材市場，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)金傳山教授鑒定為唇形科風(fēng)輪菜的全草)；云南白藥粉末(云南白藥集團(tuán)股份有限公司)；無水乙醇(江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司)；檸檬酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；生理鹽水(安徽豐原藥業(yè)股份有限公司淮海藥廠)。

1.2 實驗動物

健康雄性成年SD大鼠，體質(zhì)量190～210 g(安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心)，動物倫理號：AHUCM-rats-2021097；健康雄性新西蘭大白兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg(安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心)，動物倫理號：AHUCM-rabbits-2021132。

1.3 實驗方法

1.3.1 斷血流提取物的制備 稱取一定量的斷血流藥材粗粉，加入75%的乙醇，用量是藥材的12倍，加熱回流提取兩次，每次2 h。將兩次提取液離心、過濾除去藥渣，將藥液濃縮成浸膏，即得斷血流浸膏[8]，浸膏干燥后粉碎即得斷血流提取物粉末。

1.3.2 實驗分組情況及處理 ①血小板黏附率實驗和血漿復(fù)鈣時間實驗的分組情況及處理：實驗分為3組，每組平行3次。生理鹽水組：0.9%氯化鈉溶液；斷血流提取物組：將斷血流提取物粉末配制成3.3 mg/ml的溶液，3 000 r/min離心取上清液，備用；云南白藥組：將云南白藥粉末配制成3.3 mg/ml的溶液，3 000 r/min離心取上清液，備用。②大鼠股靜脈止血實驗和兔耳動脈止血實驗的分組情況及處理：9只SD大鼠隨機(jī)分成3組，每組3只，分別為空白對照組、斷血流浸膏組、云南白藥粉末組，每只大鼠建立大鼠股靜脈出血模型。9只新西蘭兔隨機(jī)分成3組，每組3只，分別為空白對照組、斷血流浸膏組、云南白藥粉末組，每只新西蘭兔建立兔耳動脈出血模型。

1.3.3 斷血流提取物的血小板黏附效果評價 新西蘭兔心臟取血，加入3.8%檸檬酸鈉(9 ∶1)，得到抗凝兔血，以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清液，即得血小板血漿。分別在裝有0.1 ml生理鹽水、3.3 mg/ml云南白藥、3.3 mg/ml斷血流提取物的離心管中，加入0.1 ml血小板溶液，然后在每個離心管中放入一個直徑為3.0 mm的小玻璃球，微型渦旋混合儀振蕩10 min。用移液槍吸取適量滴于血球計數(shù)板上，在顯微鏡下計數(shù)。每組測定3次取平均值。按公式(1)計算血小板的黏附率。

(1)

式中：PAdR為血小板黏附率(%)，N0為黏附前血小板數(shù)，Nf為黏附后血小板數(shù)。

1.3.4 斷血流提取物的血漿復(fù)鈣時間效果評價 新西蘭兔心臟取血，加入3.8%檸檬酸鈉(9 ∶1)，得到抗凝兔血，以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清液，即得血漿。準(zhǔn)備37 ℃預(yù)熱的離心管9只，分為3組，每組3只。分別向離心管中加入0.1 ml生理鹽水、0.1 ml 3.3 mg/ml云南白藥、0.1 ml 3.3 mg/ml斷血流提取物，再加入0.1 ml血漿，0.1 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.277 5%的CaCl2溶液，混勻后繼續(xù)放置在37 ℃恒溫水浴中，開始計時。30 s后，每10 s緩慢傾斜離心管，直至纖維蛋白形成、液面不動所需的時間即為血漿復(fù)鈣時間。

1.3.5 斷血流提取物的大鼠股靜脈止血評價 健康雄性大鼠9只，體質(zhì)量190～210 g，隨機(jī)分為3組，分別為空白對照組、斷血流浸膏組、云南白藥粉末組。大鼠提前禁食，配制0.3%戊巴比妥鈉備用，采用腹腔注射麻醉大鼠(1 ml/100 g)后，將大鼠仰位固定于實驗臺上，左側(cè)腹部和大腿根部之間(即腹股溝)去毛，面積6 cm×5 cm左右。用碘伏對其消毒后，解剖大鼠大腿根部，并暴露股靜脈，用注射器針頭刺穿股靜脈，使血液涌出，建立大鼠股靜脈出血模型[9]。每組分別涂覆0.1 g斷血流浸膏、0.1 g云南白藥粉末，空白組傷口不用藥物，再用無菌紗布覆蓋，壓上質(zhì)量為50 g的砝碼，開始計時。30 s后翻開紗布觀察創(chuàng)面的出血情況，之后每隔10 s翻開紗布觀察創(chuàng)面1次，記錄血液不再滲出的時間，即為止血時間。將各組紗布分別稱重，記錄出血量。

1.3.6 斷血流提取物的兔耳動脈止血評價 將9只健康新西蘭兔隨機(jī)分成3組，每組3只，分別為空白對照組、斷血流浸膏組、云南白藥粉末組。用30%烏拉坦耳緣靜脈注射麻醉(5 ml/kg)后，采用左側(cè)臥位的方式固定在實驗臺上面。對左耳背面皮膚進(jìn)行脫毛處理，暴露血管，使用碘伏消毒，之后用手術(shù)刀橫向割斷耳動脈，血液流出，建立兔耳動脈出血模型[10]。皮膚出血模型建立成功后，每組分別立即涂覆0.1 g斷血流浸膏和0.1 g云南白藥粉末，空白組傷口不用藥物，用無菌紗布覆蓋，壓上質(zhì)量為20 g的砝碼，開始計時。30 s后察看傷口的出血情況，之后每隔10 s翻開紗布察看創(chuàng)面1次，記錄血液不再滲出時間即出血時間。將各組紗布分別稱重，記錄出血量。

2 結(jié)果

2.1 血小板黏附效果評價

血小板黏附實驗結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比較，云南白藥組和斷血流提取物組血小板黏附率顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而斷血流提取物組與云南白藥組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表1)。表明云南白藥和斷血流提取物可以促進(jìn)血小板黏附，從而促進(jìn)凝血。

表1 斷血流提取物對血小板黏附率的影響Table 1 Effect of the extract of Chinese Clinopodium herb on platelet adhesion

2.2 血漿復(fù)鈣時間效果評價

血漿復(fù)鈣時間的測定結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比較，云南白藥組和斷血流提取物組血漿復(fù)鈣時間明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而斷血流提取物組與云南白藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

表2 斷血流提取物對血漿復(fù)鈣時間的影響Table 2 Effect of the extract of Chinese Clinopodium herb on plasma calcium rehydration

2.3 大鼠股靜脈止血評價

在斷血流提取物對大鼠股靜脈損傷出血模型止血時間的影響方面，斷血流浸膏組、云南白藥粉末組與空白組相比較，出血量明顯減少、止血時間明顯縮短(P<0.05)；而斷血流浸膏組與云南白藥粉末組相比較，出血量和止血時間相當(dāng)(P>0.05，見表3)。表明斷血流浸膏可以顯著縮短止血時間、減少出血量。

表3 斷血流提取物對大鼠股靜脈出血模型止血時間及出血量的影響Table 3 Effect of extract from Chinese Clinopodium herb on hemostasis time and bleeding volume of rats with femoral vein bleeding

2.4 兔耳動脈止血評價

斷血流提取物對新西蘭兔耳動脈出血的止血效果顯示，斷血流浸膏組、云南白藥粉末組與空白對照組相比較，止血時間明顯縮短，并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而斷血流浸膏組與云南白藥粉末組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表4)。

表4 斷血流提取物對兔耳動脈出血模型止血時間及出血量的影響Table 4 Effect of extract of Chinese Clinopodium herb on hemostasis time and bleeding volume in rabbit ear artery bleeding

3 討論

血小板是血液有效成分的一種，主要功能是止血和促凝血。血小板黏附率高表明止血效果好。血漿復(fù)鈣時間(RT)是判斷測定內(nèi)源凝血系統(tǒng)缺陷的一種實驗檢查，血漿復(fù)鈣時間縮短表明具有良好的止血效果。因此本實驗選用血小板黏附率和血漿復(fù)鈣時間兩種離體指標(biāo)[11]評價體外止血效果。結(jié)果表明斷血流提取物能夠明顯促進(jìn)血小板黏附、縮短血漿復(fù)鈣時間，從而起到凝血止血效果。采用大鼠股靜脈出血和兔耳動脈出血實驗測定止血時間和出血量，考察斷血流提取物的體內(nèi)止血效果，結(jié)果表明斷血流提取物可以縮短出血時間，減少出血量，具有優(yōu)異的止血性能。

本實驗在SD大鼠股靜脈出血模型的造模過程中，直接剪斷股靜脈出血量過于兇猛，止血困難，故最后采用注射器針頭刺破股靜脈的方法來造股靜脈出血模型。在新西蘭兔耳動脈出血實驗中，前期使用手術(shù)刀橫斷耳靜脈來造模，但是出血量較少，各組所用材料均能迅速止血，而兔耳的背部分布著一根動脈，該動脈與成年人的手臂上的主動脈大小相當(dāng)，因此，用它作為生物材料的止血性能測試具有很好的模型作用[12]。故最后采取手術(shù)刀橫向割斷兔耳中央動脈的方式來建立模型。而在選擇陽性參照物時，鑒于云南白藥是當(dāng)前常用的止血藥[13]，因此本實驗最終將云南白藥作為陽性對照組。為了與云南白藥粉末形成對照，曾嘗試將斷血流提取物粉末敷在傷口上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)掀開紗布觀察傷口時會粘連傷口，造成二次出血，影響止血時間和出血量的測定，因此制備斷血流浸膏作為實驗組。

綜上所述，斷血流提取物具有優(yōu)異的止血作用，可以促進(jìn)血小板黏附，縮短血漿復(fù)鈣時間，縮短出血時間，減少出血量，為斷血流開發(fā)成外用止血制劑提供了有利的理論依據(jù)。