劉宏偉，熊 洪，陳瑞琦，朱 奕，左 玲(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，湛江 5400；廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科；通訊作者,E-mail:doctorzuoling@63.com)

膀胱癌是世界上第十大常見的癌癥，是男性第四常見的癌癥。據(jù)估計，在全世界范圍內(nèi)，每年大約有50萬新增病例和20萬死亡病例，男性的發(fā)病率約是女性的4倍[1,2]。大約70%～75%的膀胱癌患者是非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)，而其余25%～30%患者則是肌層浸潤性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer, MIBC)[3,4]?？ń槊缡侵委熤懈呶７羌咏櫺园螂装┖驮话┑挠行幬?，但總體不良反應(yīng)率高達(dá)71.8%[5]。MIBC患者行膀胱根治性切除術(shù)后仍有近50%的患者進(jìn)展為轉(zhuǎn)移性膀胱癌[6]。自20世紀(jì)80年代開始，以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案是轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案[6]，但有部分患者因毒副作用難以耐受。因此尋找新的抑制膀胱癌的藥物具有重要的臨床意義。

川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是從植物川芎(Ligusticum)的根莖提取的有效成分，化學(xué)名為2,3,5,6,-四甲基吡嗪，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗凝血、抗氧化、抗腫瘤等作用[7]。有研究表明，TMP可以通過mTOR信號通路抑制前列腺癌細(xì)胞增殖[8]，還可以通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[9]，然而TMP對膀胱癌是否有抑癌作用尚不清楚。本研究擬探討TMP對膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞增殖、遷移、周期的作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

TMP(貨號：100022)購自江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；人永生化尿路上皮細(xì)胞SV-HUC-1和人膀胱癌細(xì)胞株UM-UC-3細(xì)胞均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。F-12K、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。AKT單克隆抗體(貨號：60203-2-Ig)、p-AKT(Ser473)單克隆抗體(貨號：66444-1-Ig)、mTOR單克隆抗體(貨號：66888-1-Ig)、p-mTOR(Ser2448)單克隆抗體(貨號:67778-1-Ig)、β-actin單克隆抗體(貨號：66009-1-Ig)、Cyclin D1多克隆抗體(貨號：26939-1-AP)、CDK4多克隆抗體(貨號：11026-1-AP)購自美國Proteintech公司；PI/RNase染色液購自天津三箭生物技術(shù)股份有限公司；Multiscan MK3型號酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific)；Tanon5200型號全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；BD FACSCantoTM Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物制備

UM-UC-3和SV-HUC-1細(xì)胞分別用含10%濃度的胎牛血清、1%濃度的青霉素/鏈霉素溶液的DMEM和F-12K細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。TMP用DMSO溶解配制成20 mg/L的儲存液,避光儲存于-20 ℃冰箱中，實(shí)驗(yàn)時用DMEM培養(yǎng)基稀釋成需要的濃度。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測TMP對UM-UC-3細(xì)胞增殖能力的影響

將UM-UC-3細(xì)胞用胰酶消化離心后，按照1×103個/孔鋪到96孔板中，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，向?qū)?yīng)實(shí)驗(yàn)孔中分別加入不同濃度(0，200，400，800 mg/L)的TMP，同時設(shè)置空白對照組(不含細(xì)胞，只加培養(yǎng)基)，每個孔100 μl，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別孵育24 h后棄培養(yǎng)基，然后將10 μl CCK-8試劑加入到100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液中，放培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育。2 h后使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的OD值。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測TMP對正常尿路上皮SV-HUC-1細(xì)胞活力的影響

將SV-HUC-1細(xì)胞用胰酶消化離心后，按照1×103個/孔鋪到96孔板中，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，向?qū)?yīng)實(shí)驗(yàn)孔中分別加入不同濃度(0，200，400，800 mg/L)的TMP，同時設(shè)置空白對照組(不含細(xì)胞，只加培養(yǎng)基)，每個孔100 μl，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別孵育24 h后棄培養(yǎng)基，然后將10 μl CCK-8試劑加入到100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液中，放培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育。2 h后使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的OD值。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測TMP對UM-UC-3細(xì)胞遷移能力的影響

取對數(shù)生長期UM-UC-3細(xì)胞，以3×105個/孔的密度接種于6孔板中并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁長滿后用200 μl移液槍頭尖端垂直于培養(yǎng)板底劃痕，棄去培養(yǎng)基并用PBS清洗細(xì)胞碎片。依據(jù)TMP不同濃度分為2組：0 mg/L組和400 mg/L組。用0 mg/L和400 mg/L的TMP培養(yǎng)基2 ml孵育細(xì)胞24 h，每個濃度3個復(fù)孔。分別在劃痕后0 h和24 h在倒置顯微鏡下拍攝3個視野，計算同一視野劃痕向內(nèi)遷移的距離。劃痕愈合率=(劃痕后0 h寬度-劃痕后24 h寬度)/劃痕后0 h寬度×100%。

1.6 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測TMP對UM-UC-3細(xì)胞遷移能力的影響

將對數(shù)生長的UM-UC-3細(xì)胞，胰酶消化離心后重懸細(xì)胞，以1.5×105個/孔的密度種植于6孔板，24 h后吸掉原有培養(yǎng)基，依據(jù)TMP不同濃度分為2組：0 mg/L組和400 mg/L組。藥物處理后24 h，胰酶消化細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計數(shù)。在Transwell下室內(nèi)加入600 μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，在上室內(nèi)加入200 μl無血清培養(yǎng)基(6×104個細(xì)胞)，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后用4%多聚甲醛液固定Transwell小室30 min，然后置于0.1%結(jié)晶紫中染色30 min，將小室內(nèi)上表面的細(xì)胞擦除，晾干后在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取3個視野拍照，統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測TMP對AKT/mTOR信號通路和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響

分別以0 mg/L和400 mg/L的TMP處理細(xì)胞24 h后加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)，冰上放置30 min，提取細(xì)胞總蛋白。用BCA法測定蛋白濃度，采用SDS-PAGE凝膠電泳，每孔加入30 μg蛋白，濃縮膠設(shè)定80 V，分離膠設(shè)定100 V，電泳2 h，然后恒流電轉(zhuǎn)，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜。然后用5%脫脂奶粉溶液在室溫封閉1 h，在4 ℃冰箱內(nèi)孵育一抗AKT(1 ∶5 000)、p-AKT(1 ∶5 000)、mTOR(1 ∶5 000)、p-mTOR(1 ∶5 000)、Cyclin D1(1 ∶1 000)、CDK4(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶10 000)過夜，TBST洗滌3次，室溫孵育二抗1 h，TBST洗滌3次，化學(xué)發(fā)光法曝光，拍照。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測TMP對UM-UC-3細(xì)胞周期的影響

取對數(shù)生長期UM-UC-3細(xì)胞，接種于6孔板中并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。24 h后棄培養(yǎng)基，以0 mg/L和400 mg/L的TMP處理細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞至1.5 ml EP管中并調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106。在室溫下用70%乙醇固定1 h，用預(yù)冷的PBS洗滌兩次，然后用0.5 ml PI/RNase染色液重懸細(xì)胞，輕輕混勻后在室溫下避光靜置30 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

每個實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,Graphpad Prism7.0軟件和SPSS20.0分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組的均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組的均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMP對UM-UC-3細(xì)胞增殖的影響

當(dāng)TMP濃度為0 mg/L時，其作用于UM-UC-3細(xì)胞24，48，72 h，細(xì)胞增殖未見明顯抑制。不同濃度(200，400，800 mg/L)TMP處理細(xì)胞24，48，72 h后增殖抑制率逐漸增加；在相同濃度下不同時間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在相同時間點(diǎn)不同濃度的細(xì)胞增殖抑制率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。提示TMP對膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞的增殖抑制作用呈劑量依賴性和時間依賴性。400 mg/L的TMP對細(xì)胞增殖具有良好的抑制作用，且對細(xì)胞無明顯致死作用，故選擇400 mg/L作為后續(xù)研究的濃度。

表1 不同濃度TMP作用不同時間對UM-UC-3細(xì)胞增殖抑制率的比較Table 1 Comparison of the inhibitory rate of different concentrations of TMP on the proliferation of UM-UC-3 cells at different time

2.2 TMP對SV-HUC-1細(xì)胞活力的影響

與0 mg/L濃度相比，不同濃度(200，400，800 mg/L)TMP處理24 h后，SV-HUC-1細(xì)胞活力均降低(見圖1)。隨著給藥濃度增大，細(xì)胞活力逐漸下降，但不同濃度(200，400，800 mg/L)TMP處理組細(xì)胞的活力均大于80%，說明TMP對正常尿路上皮細(xì)胞SV-HUC-1的細(xì)胞毒性在可接受范圍之內(nèi)。

圖1 TMP對SV-HUC-1細(xì)胞活力的影響Figure 1 Effect of TMP on SV-HUC-1 cell viability

2.3 TMP對UM-UC-3細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示UM-UC-3細(xì)胞劃痕24 h，400 mg/L TMP組細(xì)胞劃痕的愈合率低于0 mg/L TMP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖2A)；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明400 mg/L TMP組細(xì)胞遷移能力低于0 mg/L TMP，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖2B)。提示TMP可抑制UM-UC-3細(xì)胞的遷移能力。

與0 mg/L組比較，**P<0.01圖2 川芎嗪作用24 h對UM-UC-3細(xì)胞遷移的影響 (×200)Figure 2 Effect of TMP on migration of UM-UC-3 cells after treatment for 24 h (×200)

2.4 TMP對UM-UC-3細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測表明，分別用0 mg/L和400 mg/L TMP處理UM-UC-3細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)400 mg/L TMP組處于G0/G1期的細(xì)胞比例高于0 mg/L TMP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖3)。

與0 mg/L組比較，*P<0.05，**P<0.01圖3 川芎嗪作用24 h對UM-UC-3細(xì)胞周期的影響Figure 3 Effect of TMP on cell cycle of UM-UC-3 cells after treatment for 24 h

2.5 TMP對UM-UC-3細(xì)胞Cyclin D1及CDK4蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與0 mg/L TMP組相比，400 mg/L TMP組Cyclin D1和CDK4蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖4)。

與0 mg/L組比較，**P<0.01圖4 川芎嗪作用24 h對UM-UC-3細(xì)胞Cyclin D1和CDK4蛋白的影響Figure 4 Effect of TMP on the expression of Cyclin D1 and CDK4 in UM-UC-3 cells after treatment for 24 h

2.6 TMP對AKT/mTOR信號通路的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0 mg/L TMP組相比，400 mg/L TMP組的AKT和mTOR的蛋白表達(dá)未見明顯變化，但p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖5)，提示TMP可以抑制AKT和mTOR的磷酸化水平。

與0 mg/L組比較，*P<0.05，**P<0.01圖5 川芎嗪對UM-UC-3細(xì)胞AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的影響Figure 5 Effect of TMP on the expression of AKT/mTOR signaling pathway-related proteins in UM-UC-3 cells

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全球最普遍的腫瘤之一[10]。雖然手術(shù)切除是早期膀胱癌的主要治愈療法，但對肌層浸潤性膀胱癌或轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者需要應(yīng)用以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療[6]。近年來，很多植物都被證明含有抗癌成分，長春新堿、紫杉醇、托泊替康等植物化合物已經(jīng)被應(yīng)用到癌癥的臨床治療中。TMP是一種常見于中草藥根或莖中的生物堿單體，其在中藥中應(yīng)用已有較長的歷史。近來，已有研究表明其對肺癌[11]、乳腺癌[12]、肝癌[13]等癌癥具有一定的抗癌作用。目前，TMP對膀胱癌細(xì)胞的抗腫瘤作用還有待進(jìn)一步的探討。

本研究首先檢測了不同濃度TMP對膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞增殖的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，TMP以劑量和時間依賴性的方式顯著抑制UM-UC-3細(xì)胞增殖；劃痕實(shí)驗(yàn)表明，用400 mg/L的TMP處理UM-UC-3細(xì)胞，細(xì)胞劃痕愈合率顯著低于0 mg/L組；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)也證實(shí)用400 mg/L的TMP處理的UM-UC-3細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)低于0 mg/L組，說明TMP也可以抑制膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞的遷移能力。癌細(xì)胞中的細(xì)胞周期停滯通常與抑制細(xì)胞增殖有關(guān)。與正常細(xì)胞相比，不受控制的增殖是腫瘤細(xì)胞最顯著的生物學(xué)特征之一[14]。Bian等[15]研究發(fā)現(xiàn)TMP可以誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。我們進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了TMP對細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示，TMP誘導(dǎo)UM-UC-3細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，表明TMP通過誘導(dǎo)G0/G1細(xì)胞周期停滯來抑制UM-UC-3細(xì)胞的增殖。Cyclin D1和CDK4是細(xì)胞周期進(jìn)程中重要的調(diào)控因子，Cyclin D1和CDK4可以促進(jìn)G1/S期的細(xì)胞周期進(jìn)程[16,17]。本研究進(jìn)一步檢測TMP對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1和CDK4表達(dá)的影響，結(jié)果提示TMP抑制了Cyclin D1和CDK4的蛋白表達(dá)。AKT信號通路已被證明在惡性腫瘤的增殖和遷移過程中發(fā)揮著重要的作用[18]。AKT信號通路的激活可以導(dǎo)致GSK-3降低，促進(jìn)Cyclin D1的表達(dá)，在細(xì)胞周期進(jìn)程中起著重要作用[19]。龐皓玥等[20]研究發(fā)現(xiàn)TMP聯(lián)合順鉑處理人肺癌A549細(xì)胞后，PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞的增殖和侵襲能力受到抑制。本研究進(jìn)一步探討了TMP對UM-UC-3細(xì)胞AKT/mTOR信號通路的影響，Western blot結(jié)果顯示，TMP抑制了細(xì)胞中p-AKT和p-mTOR的蛋白表達(dá)，但對AKT和mTOR的蛋白表達(dá)無明顯影響。以上結(jié)果表明，TMP可以通過影響AKT/mTOR信號通路的表達(dá)，抑制下游信號蛋白Cyclin D1和CDK4，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，從而抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移。

綜上所述，本研究表明TMP可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移，并且誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。此外，TMP可以通過AKT/mTOR信號通路影響下游分子Cyclin D1和CDK4發(fā)揮抑癌作用。TMP作為傳統(tǒng)中藥川芎的提取物，有望成為膀胱癌的一種潛在治療藥物。