張衡以挺

胰腺癌在發(fā)達(dá)國(guó)家的5年生存率＜5%，預(yù)后較差［1］。大量研究表明，姜黃素是一種高效的抗炎物質(zhì)，可改善糖尿病、肥胖癥等的預(yù)后［2］。姜黃素在糖尿病心肌病中有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［3］。細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是高度保守的細(xì)胞周期蛋白家族的一員，是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的重要調(diào)節(jié)因子，通過(guò)抑制細(xì)胞周期抑制劑來(lái)控制細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換表達(dá)式，與多種腫瘤存在密切的關(guān)系［4］。NF-κB信號(hào)通路被公認(rèn)為連接炎癥和癌癥的主要信號(hào)通路，靶向抑制NF-κB可能同時(shí)針對(duì)癌細(xì)胞和癌癥相關(guān)炎癥，可改善患者預(yù)后［5］。有研究表明，姜黃素在凝膠遷移率變化測(cè)定中降低胰腺癌細(xì)胞NF-kappaB與DNA結(jié)合的能力［6］。本文探討姜黃素對(duì)NF-κB通路和Cyclin D1通路的調(diào)控作用，及對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物及試劑 BxPC-3細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC）。BxPC-3細(xì)胞系在含有10%FBS（Gibco）、100μg/mL鏈霉素和100μg/mL青霉素的DMEM（Gibco）培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞系均在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。姜黃素（Curcumin）購(gòu)自MCE公司（美國(guó)），使用二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）溶解，CCK-8試劑盒購(gòu)自碧云天（中國(guó)）；RIPA裂解液購(gòu)自碧云天（中國(guó)）。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天（中國(guó)）；PVDF膜購(gòu)自Millipore公司（美國(guó)）；柱式Trizol總RNA抽提試劑盒購(gòu)自生工（中國(guó)）；PrimeScript? RT Master Mix購(gòu)自TAKARA公司（日本）；Cleaved Caspase3、Caspase3、Bax、Bcl2、NF-kappaB、p-NF-kappaB和Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody抗體購(gòu)自CST公司（美國(guó)）。實(shí)驗(yàn)時(shí)間 2021年10月至2021年11月。

1.2 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，每孔103個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。將10、20、30、40、50、60μmol/mL的姜黃素加入BxPC-3細(xì)胞處理48 h，將CCK-8試劑加入96孔板，CCK-8試劑：培養(yǎng)基體積比為1∶10。37℃培養(yǎng)1 h后，在460 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR 使用柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取BxPC-3細(xì)胞的總RNA。通過(guò)PrimeScript? RT Master Mix 逆轉(zhuǎn)錄已提取到的RNA為cDNA，后續(xù)通過(guò)Bio-Rad系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為10μL，包括5μL SYBR Green Mix，10μmol/mL正向和反向引物，各1μL，模板2μL和無(wú)核酶水1μL。反應(yīng)程序如下：95℃3 min，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)95℃ 10 s，60℃30 s。為了確定擴(kuò)增特異性，對(duì)每個(gè)引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。具體引物見(jiàn)表1。

表1 PCR使用的引物

1.4 Western Blot 使用預(yù)冷的PBS洗滌鐵壁細(xì)胞，使用RIPA裂解緩沖液在冰上裂解細(xì)胞15 min并用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞。在4℃，1,200 r/min離心15 min后，轉(zhuǎn)移細(xì)胞上清液至EP管，并用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)定量分析結(jié)果將蛋白調(diào)至相同濃度，加入5×上樣緩沖液混勻，100℃變性5 min。稍微冷卻并離心后，將蛋白質(zhì)進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳。電泳后，將SDS-PAGE凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，切割目標(biāo)蛋白條帶，用含5%脫脂奶粉（25 mM Tris、150 mM NaCl、0.05% Tween-20，pH 7.5）與一抗在4℃下孵育過(guò)夜。次日，TBST洗3次后，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，化學(xué)發(fā)光液顯色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad prism 8.3軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度姜黃素抑制BxPC-3細(xì)胞的增殖 40μg/mL姜黃素處理BxPC-3細(xì)胞48 h后細(xì)胞活力明顯低于20μg/mL處理48 h（P＜0.05）。隨著藥物濃度的增加，每個(gè)孵育時(shí)間組的細(xì)胞活力逐漸下降（P＜0.05）。姜黃素對(duì)BxPC-3細(xì)胞系的抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性趨勢(shì)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取40μg/mL處理48 h作為處理?xiàng)l件。見(jiàn)圖1。

圖1 姜黃素對(duì)BxPC-3 細(xì)胞活性的影響

2.2 姜黃素對(duì)胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3凋亡的影響 為了確認(rèn)姜黃素對(duì)細(xì)胞胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3凋亡的影響，用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分析在姜黃素處理相同條件下細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的組成型表達(dá)水平及Caspase-3的激活。結(jié)果證實(shí)與對(duì)照組相比，用姜黃素處理BxPC-3細(xì)胞后，凋亡蛋白Bax的表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平下調(diào)，Bax/Bcl-2比值上升，剪切的Caspase-3增多（P＜0.05）。表明姜黃素可能通過(guò)增加Bax/Bcl-2比值誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，從而激活caspase-3。見(jiàn)圖2。

圖2 姜黃素對(duì)BxPC-3 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

2.3 姜黃素降低CyclinD1的表達(dá) 姜黃素處理可抑制其蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)水平，表明姜黃素通過(guò)CyclinD1停滯細(xì)胞周期。見(jiàn)圖3。

圖3 姜黃素對(duì)BxPC-3 細(xì)胞中CyclinD1表達(dá)量的影響

2.4 姜黃素下調(diào)NF-κB信號(hào)通路的激活 與對(duì)照組比較，姜黃素處理BxPC-3細(xì)胞系后，NF-κB的磷酸化水平降低（P＜0.05），表明姜黃素可能抑制NF-κB信號(hào)通路的活化。見(jiàn)圖4。

圖4 姜黃素對(duì)BxPC-3 細(xì)胞中NF-kappaB通路激活情況的影響

3 討論

姜黃，是姜科的草本植物。該植物產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，包括黃酮類、生物堿類、單寧類和酚酸類，其中活性疏水性多酚二亞甲基甲烷（姜黃素）尤為引人注目。姜黃素用于治療各種疾病，包括炎癥性疾病、肝病、代謝綜合征、神經(jīng)退行性疾病，最重要的是，用于治療多種癌癥。大量研究表明姜黃素在體外對(duì)多種惡性細(xì)胞系具有有效的抗腫瘤作用，并在裸鼠模型中具有化學(xué)預(yù)防作用，這一作用主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)［7］。MARQUARDT等［8］發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過(guò)阻斷NF-κB通路治療預(yù)后不良的肝癌患者。HAN等［9］發(fā)現(xiàn)姜黃素通過(guò)下調(diào)microRNA-27a抑制胸腺癌細(xì)胞的細(xì)胞活力、遷移和侵襲。本研究結(jié)果表明，不同濃度姜黃素對(duì)胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3的細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Bcl-2作為抗凋亡因子，Bax蛋白作為促凋亡蛋白，參與細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果表明姜黃素可通過(guò)減少抗凋亡因子Bcl-2，增加促凋亡蛋白Bax，減少Bcl-2/Bax比值誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡取決于起始Caspase（例如Caspase-8和-9）和Caspase（Caspase-3、-6和-7）［10］?；熕幬锿ǔＭㄟ^(guò)PARP-Caspase3通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［11］。本研究結(jié)果表明，姜黃素通過(guò)促進(jìn)Caspase3剪切，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。NF-kappaB通路在許多細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如細(xì)胞代謝、存活、分化、增殖、運(yùn)動(dòng)和血管生成［12］。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明NF-κB與腫瘤耐藥性相關(guān)，使NF-κB成為治療癌癥的新靶點(diǎn)［13］。NF-κB因子調(diào)節(jié)和控制各種蛋白質(zhì)的表達(dá)，包括細(xì)胞因子和干擾素。這些蛋白質(zhì)與炎癥和癌癥進(jìn)展密切相關(guān)。姜黃素對(duì)NF-κB依賴性途徑具有抑制作用，從而抑制腫瘤和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。大量研究表明，NF-κB信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲有關(guān)［14］。本研究結(jié)果表明，姜黃素處理BxPC-3細(xì)胞系后，NF-κB的磷酸化水平降低，表明姜黃素抑制NF-kappaB信號(hào)通路的活化，且與其誘導(dǎo)凋亡相關(guān)。在人類癌癥中，細(xì)胞周期蛋白D1比細(xì)胞周期蛋白D2或D3更頻繁失調(diào)，因此，已被更廣泛地表征。CyclinD1的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致CDK活性失調(diào)、細(xì)胞在有絲分裂信號(hào)受限的條件下快速生長(zhǎng)、繞過(guò)關(guān)鍵細(xì)胞檢查點(diǎn)，并最終導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)。CyclinD1是已知的參與細(xì)胞周期停滯的關(guān)鍵分子，是增殖細(xì)胞G1期細(xì)胞周期調(diào)節(jié)所必需的［15］。本研究結(jié)果表明，姜黃素通過(guò)抑制細(xì)胞CyclinD1的表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。

綜上所述，姜黃素能抑制胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞周期停滯，其作用機(jī)制與下調(diào)CyclinD1、抑制NF-κB活化有關(guān)。