張麗娜，熊舟翼，熊漢國(guó)*，夏長(zhǎng)興

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；2.武漢農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工中心，武漢 430200;3.湖北金碾王食品科技有限公司,武漢 430100)

生物活性脂質(zhì)，如類胡蘿卜素、脂肪酸和天然抗氧化劑，被廣泛用作各種食品的活性成分。β-胡蘿卜素(β-carotene, BC)是一種主要的類胡蘿卜素，在食品中作為天然著色劑和抗氧化劑發(fā)揮著重要作用[1]，特別是可以預(yù)防癌癥、心血管疾病、肌肉退行性改變、白內(nèi)障等一系列疾病[2]。然而，β-胡蘿卜素不溶于水，在室溫下因其結(jié)晶形式而弱溶于油，此外，β-胡蘿卜素對(duì)氧、熱和光敏感，進(jìn)一步限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[3]。為了解決這個(gè)問題，β-胡蘿卜素經(jīng)常被加入水包油乳液中，以改善其水分散性、化學(xué)穩(wěn)定性和生物利用度。

卵白蛋白(OVA)是蛋清中含量最豐富的蛋白質(zhì)，由385個(gè)氨基酸組成，其中一半以上是疏水性的且埋藏在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，在食品加工中用作乳化劑、發(fā)泡劑或膠凝劑[4]。然而，酸性或多離子體系等特殊的加工條件限制了OVA的乳化性能[5]。蛋白質(zhì)的磷酸化參與調(diào)控生物體內(nèi)的許多重要生命活動(dòng)。在食品領(lǐng)域，磷酸化是一種重要的蛋白質(zhì)修飾方法，通過磷酸化共價(jià)修飾，可以有效提高食品蛋白質(zhì)的功能活性[6]。蛋白質(zhì)磷酸化可以增加蛋白質(zhì)的負(fù)電荷基團(tuán)，降低蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，從而顯著改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。已有研究表明，蛋白質(zhì)的磷酸化修飾能有效改善發(fā)泡性能、乳化性能、溶解度[7]。磷酸化蛋白納米顆粒，如乳清蛋白[8]和蛋清蛋白[9]在顆粒穩(wěn)定性和藥物輸送特性方面表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能。基于此，我們推測(cè)磷酸化修飾是改善OVA納米乳液功能性質(zhì)的一種合理手段，P-OVA納米乳液是一種新型的食品級(jí)β-胡蘿卜素包埋系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮雞蛋：購(gòu)于武漢中百超市；聚乙二醇8000(PEG 8000)：默克化工技術(shù)(上海)有限公司；中鏈甘油三酸酯(MCT)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；β-胡蘿卜素(96%)：上海源葉生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)中使用的其他化學(xué)品均為分析純，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 設(shè)備與儀器

高速剪切分散均質(zhì)機(jī) 寧波新芝生物技術(shù)有限公司；AG-22331型臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司；NEXUS-470型傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)梅特勒-托利多公司；馬爾文電位粒徑測(cè)定儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；M-110L型高壓微射流儀 美國(guó)安捷倫科技公司；FV3000型激光共聚焦顯微鏡 日本Olympus公司；HR-3型多功能流變儀 美國(guó)TA公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 卵白蛋白的制備

參考Xiong等[10]的方法并進(jìn)行適當(dāng)簡(jiǎn)化。取新鮮雞蛋使用分蛋器將蛋清和蛋黃分離，并收集蛋清液。將蛋清液與兩倍體積的去離子水混合稀釋，并用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)蛋清稀釋液pH至7.5，在蛋清液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的PEG 8000，用磁力攪拌器在4 ℃攪拌2 h使其混合均勻，然后在低溫冷凍離心機(jī)中離心15 min(10 000 g，4 ℃)。離心后的上清液在4 ℃靜置12 h，直到溶液分層。將分層后的沉淀除去，將上清液再次離心15 min(10 000 g，4 ℃)。將離心后的上清液冷凍干燥48 h，將凍干粉末在-80 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 卵白蛋白的磷酸化

將4%(質(zhì)量與體積比)的STPP溶解在OVA溶液(20 mg/mL)中，溶液用1 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0，然后將溶液在50 ℃恒溫加熱2 h。反應(yīng)混合物保持在4 ℃透析48 h，以2 L去離子水為底物，每4 h更換一次。然后冷凍干燥，將P-OVA干粉于-80 ℃保存，待進(jìn)一步分析。

1.3.3 熱處理磷酸化卵白蛋白

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的P-OVA凍干粉末溶解于去離子水中，溶液用1 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，將溶液在低溫冷凍離心機(jī)中離心30 min(8 000 g，4 ℃)。將離心后的上清液過濾，除去任何痕量的不溶物，隨后將蛋白溶液采用65 ℃水浴加熱0，6，12，18，24 h，然后在流動(dòng)自來水中冷卻并放在4 ℃的冰箱中。將不同時(shí)間熱處理后的樣品分別標(biāo)記為P-0、P-6、P-12、P-18和P-24。

1.3.4β-胡蘿卜素乳液的制備

稱取一定量的β-胡蘿卜素溶于中鏈甘油三酯(MCT)中，將其配制成濃度為0.1%(質(zhì)量比)的β-胡蘿卜素溶液作為油相，P-OVA自組裝聚集體樣品冷卻作為水相，控制油和水的體積比為1∶9，使用高速分散器在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下均質(zhì)3 min，此時(shí)得β-胡蘿卜素粗乳液。然后將粗乳液用高壓微射流儀在9 kpsi的壓力下均質(zhì)處理3次。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

參考文獻(xiàn)[11]的方法并稍加修改。安裝夾心式垂直式電泳槽，制備5%濃縮膠和12%分離膠。樣品處理：將待測(cè)樣品用去離子水溶解成濃度為5 mg/mL的溶液，取10 μL樣液和上樣緩沖液混合于200 μL離心管中，在沸水中加熱5 min，待冷卻時(shí)點(diǎn)樣用。凝膠電泳于恒壓模式下進(jìn)行，濃縮期間電壓設(shè)置為80 V，達(dá)到分離膠后，電壓調(diào)至120 V。電泳結(jié)束后，將膠放入固定液(50%乙醇和10%冰醋酸)固定30 min，取出放入染色液中(0.25%考馬斯亮藍(lán))染色1 h后用脫色液(甲醇、冰乙酸、去離子水的體積比為2∶2∶9)脫色，更換脫色液直至條帶清晰、背景色完全褪去，最后使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.3.6 磷酸化卵白蛋白紅外光譜

參考文獻(xiàn)[12]的方法并稍加修改。用紅外光譜儀采集OVA和P-OVA的FT-IR光譜，每個(gè)樣品的紅外光譜圖在波長(zhǎng)400～4 000 cm-1范圍內(nèi)由64次掃描疊加而成，儀器分辨率為4 cm-1，樣品與溴化鉀(KBr)的質(zhì)量比為1∶100，并以KBr為背景對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行背景掃描。

1.3.7 粒徑和粒徑分布圖的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[13]的方法并稍加修改。使用馬爾文納米激光粒度分析儀(Malvern,UK)分別測(cè)量O/W Pickering 乳液的平均粒徑、粒徑分布圖以及多分散指數(shù)(PDI)。使用的MCT和水的折射率分別為1.440和1.333。首先，將乳液稀釋至濃度為0.5 mol/L，然后將溫度設(shè)為25 ℃，循環(huán)10次，每個(gè)樣品獨(dú)立測(cè)量3次。

1.3.8 Zeta電位的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[13]的方法并稍加修改。使用馬爾文納米激光粒度分析儀(Malvern,UK)分析Zeta電位，首先，將乳液稀釋成0.5 mol/L，然后將溫度設(shè)為25 ℃，循環(huán)10次，每個(gè)樣品獨(dú)立測(cè)量3次。

1.3.9β-胡蘿卜素乳液流變性質(zhì)的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]的方法并稍加修改。選用40 mm的圓形鋁平行板進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試前將樣品乳液置于Peltier板上，測(cè)量條件設(shè)置：間隙設(shè)置為1 000 μm，應(yīng)變?yōu)?%，頻率設(shè)置為0.1～100 Hz，最后記錄樣品的儲(chǔ)能模量(G′)和耗能模量(G″)隨頻率變化的曲線。在剪切速率為0.1～100 s-1的條件下，測(cè)定Pickering乳液的黏度隨剪切速率變化的曲線。每個(gè)樣品獨(dú)立測(cè)量3次。

1.3.10β-胡蘿卜素乳液穩(wěn)定性的測(cè)定

鹽離子穩(wěn)定性：分別取8 mLβ-胡蘿卜素乳液于透明試管中旋蓋密封，向每個(gè)試管中添加相同體積不同濃度的氯化鈉溶液，鹽離子濃度范圍控制在0～100 mmol/L；溫度穩(wěn)定性：分別取8 mLβ-胡蘿卜素乳液于透明試管中旋蓋密封，置于水浴鍋中在不同溫度(25～85 ℃)下加熱20 min，加熱完成后取出，立即用自來水冷卻，然后使用馬爾文納米激光粒度分析儀分別測(cè)量β-胡蘿卜素乳液的粒徑變化，將溫度設(shè)為25 ℃，循環(huán)10次，每個(gè)樣品獨(dú)立測(cè)量3次。

乳液中β-胡蘿卜素保留率的測(cè)定：分別取1 mL冷卻后的β-胡蘿卜素乳液于試管中，加入1 mL去離子水，隨后分別加入1 mL無水乙醇和3 mL正己烷，混合均勻，靜置20 min分層，使用注射器取出有機(jī)層。繼續(xù)用正己烷進(jìn)行相同操作萃取剩余樣品直至有機(jī)層沒有顏色，合并有機(jī)相并定容，在450 nm處測(cè)其吸光值。β-胡蘿卜素的含量通過其有機(jī)相的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取0.01 gβ-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷定容至100 mL容量瓶中為1號(hào)樣液。取1號(hào)樣液1 mL，用正己烷定容至10 mL容量瓶中為2號(hào)樣液。在2號(hào)樣液中分別取0.5，1，2，3，4，5，6 mL置于容量瓶中，繼續(xù)定容至10 mL。將正己烷作為空白對(duì)照，使用紫外可見分光光度計(jì)在450 nm處測(cè)定吸光度，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。乳液樣品的β-胡蘿卜素保留率按照下式計(jì)算：

1.3.11β-胡蘿卜素乳液消化特性的測(cè)定[15]

1.3.11.1 模擬胃液

將2 g氯化鈉、3.2 g胃蛋白酶和7 mL濃度為37%的濃鹽酸溶解在1 L去離子中，將pH調(diào)至1.2即得模擬胃液。將樣品和模擬胃液按照體積比1∶1混合，用1 mol/L NaOH將混合物的pH調(diào)至2.5，置于37 ℃搖床中振蕩1 h，磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為100 r/min。

1.3.11.2 模擬小腸消化液

取30 mL胃消化液用1 mol/L HCl或NaOH將pH調(diào)至7，添加3.5 mL膽鹽溶液(5 mg/mL)、1.5 mL CaCl2溶液(5 mmol/L CaCl2,150 mmol/L NaCl)，調(diào)節(jié)混合溶液的pH為7.0，再添加 2.5 mL的胰脂肪懸浮物(1.6 mg/mL)，最終體積為37.5 mL，再將pH調(diào)節(jié)為7。使用pH-stat儀器將0.25 mol/L的NaOH溶液逐滴加入到消化體系中，使pH維持在7.0左右，持續(xù)2 h。

1.3.11.3β-胡蘿卜素乳液的微觀結(jié)構(gòu)和粒徑

參考文獻(xiàn)[16]的方法并稍加修改。使用激光共聚焦顯微鏡觀察模擬消化過程中納米乳液的微觀結(jié)構(gòu)。取30 μL乳液用10 μL尼羅紅溶液(0.01%溶于無水乙醇)染色，避光反應(yīng)15 min后取樣觀察。尼羅紅的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜分別為488 nm和520 nm。

1.3.11.4 體外消化過程中β-胡蘿卜素的緩釋特性研究

參考文獻(xiàn)[17]的方法并稍加修改。具體過程：每隔20 min取1 mL乳液，依次加入1 mL去離子水、1 mL無水乙醇、3 mL正己烷振蕩混合均勻，靜置20 min分層，取出有機(jī)層，再用正己烷萃取剩余樣品直到有機(jī)層沒有顏色，合并有機(jī)相并定容，在450 nm處測(cè)定其吸光值。β-胡蘿卜素的含量通過其有機(jī)相的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得，β-胡蘿卜素消化過程中的轉(zhuǎn)化率是指消化后水相膠束的含量與消化前樣品中含量的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵白蛋白電泳圖

卵白蛋白電泳圖譜見圖1。

圖1 卵白蛋白凝膠電泳圖譜Fig.1 Gel electrophoretogram of ovalbumin

由圖1可知，上清液的SDS-PAGE電泳圖譜僅有1條清晰條帶，無明顯雜蛋白，且對(duì)應(yīng)分子量在45 kDa左右，其主要成分對(duì)應(yīng)為卵白蛋白。

2.2 磷酸化卵白蛋白紅外光譜

卵白蛋白和磷酸化卵白蛋白的FT-IR結(jié)構(gòu)表征見圖2。

圖2 卵白蛋白和磷酸化卵白蛋白FT-IR結(jié)構(gòu)表征Fig.2 FT-IR structural characterization of ovalbumin and phosphorylated ovalbumin

2.3 粒徑和粒徑分布圖

P-OVA自組裝聚集體穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液的平均粒徑和粒徑分布圖見圖3。

圖3 熱處理時(shí)間對(duì)β-胡蘿卜素乳液的平均粒徑(a)和粒徑分布(b)的影響Fig.3 Effect of heat treatment time on the average particle size (a) and particle size distribution (b) of β-carotene emulsion

由圖3中a可知，由P-0穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液的平均粒徑為310.9 nm，自組裝聚集體穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液的平均粒徑有所增加(平均粒徑相差57 nm)，這可能是因?yàn)闊崽幚頃?huì)誘導(dǎo)O/W界面吸附的蛋白質(zhì)展開，油滴通過疏水相互作用進(jìn)一步聚集，導(dǎo)致液滴尺寸增大[19]。但是乳液整體平均粒徑小于400 nm，這是因?yàn)楦邏何⑸淞骶|(zhì)機(jī)提供更有效的液滴破碎(空化、剪切力和慣性力)和更高的能量密度，繼續(xù)加熱，β-胡蘿卜素乳液的粒徑變化不大，可能是由于高壓微射流的處理比乳化劑影響更大[20]。PDI通常用來評(píng)價(jià)樣品溶液的平均均勻性，經(jīng)過熱誘導(dǎo)后P-OVA自組裝聚集體制備的β-胡蘿卜素乳液的PDI有所下降，表明其乳液比較均一。由圖3中b可知，P-0穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液的粒徑分布范圍比較寬，而P-OVA自組裝聚集體乳液的粒徑分布圖是單峰且分布較窄，表明其分布均勻性增強(qiáng)，這可能是較大的Zeta電位引起的，靜電斥力阻止了液滴之間的聚集，增加了β-胡蘿卜素乳液的物理穩(wěn)定性。

2.4 Zeta電位

不同加熱時(shí)間自組裝聚集體穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液Zeta電位見圖4。

圖4 熱處理時(shí)間對(duì)β-胡蘿卜素乳液Zeta電位的影響Fig.4 Effect of heat treatment time on Zeta potential of β-carotene emulsion

由圖4可知，由未加熱樣品P-0穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液的電位絕對(duì)值為26.7 mV，隨著加熱時(shí)間的增加，乳液Zeta電位絕對(duì)值顯著增大，熱誘導(dǎo)12 h時(shí)，乳液電位絕對(duì)值達(dá)到最大，為31.42 mV，表明熱處理后自組裝聚集體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，乳液蛋白分子表面電荷有所增加。研究闡明了Zeta電位絕對(duì)值的增加是顆粒的聚集所致[21]。具有較高Zeta電位的P-OVA自組裝聚集體表明蛋白粒子之間靜電排斥力較大，增加了β-胡蘿卜素乳液的穩(wěn)定性從而抗聚集。

2.5 β-胡蘿卜素乳液的流變學(xué)行為

熱處理不同時(shí)間自組裝聚集體穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液的動(dòng)態(tài)頻率掃描和穩(wěn)態(tài)剪切圖見圖5。

圖5 熱處理時(shí)間對(duì)β-胡蘿卜素乳液的儲(chǔ)能模量(G′)(a)、耗能模量(G″) (b)以及表觀黏度(c)的影響Fig.5 Effect of heat treatment time on storage modulus (G') (a), loss modulus (G") (b) and apparent viscosity (c) of β-carotene emulsion

由圖5中a和b可知，在0.1～100 Hz的整個(gè)頻率范圍內(nèi)，隨著頻率的增加，所有β-胡蘿卜素乳液的儲(chǔ)能模量(G′)和耗能模量(G″)也隨之增加，表明乳液具有很強(qiáng)的頻率依賴性；同時(shí)任一振幅下，G′均大于G″，表明乳液均具有類似凝膠的特性，且在增加的應(yīng)變振幅下沒有發(fā)生結(jié)構(gòu)性破壞，形成具有穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的蛋白乳液。由圖5中c可知，所有乳液的黏度都隨著剪切速率的增加(0.1～100 s-1)而持續(xù)下降，表明乳液具有典型的假塑性行為。此外，由熱誘導(dǎo)P-OVA自組裝聚集體穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液的表觀黏度高于樣品P-0穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液，這一結(jié)果表明熱誘導(dǎo)P-OVA自組裝聚集體構(gòu)建的β-胡蘿卜素乳液通過形成納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)提高了體系的黏度，然而長(zhǎng)時(shí)間的加熱(18～24 h)會(huì)破壞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致表觀黏度降低。Dickinson[22]指出增加乳液的黏度有利于提高其穩(wěn)定性，因此，與樣品P-0穩(wěn)定的乳液相比，P-OVA自組裝聚集體穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液更穩(wěn)定。

2.6 β-胡蘿卜素乳液的穩(wěn)定性

2.6.1 鹽離子穩(wěn)定性

鹽離子濃度對(duì)不同熱誘導(dǎo)時(shí)間的P-OVA自組裝聚集體穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液平均粒徑的影響見圖6中a，不同離子強(qiáng)度對(duì)β-胡蘿卜素保留率的影響見圖6中b。

圖6 鹽離子濃度對(duì)β-胡蘿卜素乳液平均粒徑(a)和β-胡蘿卜素保留率(b)的影響Fig.6 Effect of salt ion concentration on the average particle size of β-carotene emulsion(a) and β-carotene retention rate (b)

由圖6中a可知，當(dāng)NaCl濃度從0 mmol/L增加到100 mmol/L時(shí)，P-OVA納米乳液的平均粒徑從303.7 nm顯著增加到735.4 nm(P<0.05)，這可能是因?yàn)辂}離子的加入屏蔽了顆粒間的靜電斥力，從而增大了乳液的液滴尺寸，進(jìn)而降低了乳液的穩(wěn)定性[23]。然而，與未加熱樣品P-0穩(wěn)定的乳液相比，P-OVA自組裝聚集體穩(wěn)定的β-胡蘿卜素Pickering乳液粒徑變化較小，表明在相同條件下具有更好的抗高離子強(qiáng)度能力，這可能是因?yàn)闊嵴T導(dǎo)形成的P-OVA自組裝聚集體具有較強(qiáng)的表面疏水性，改善了脂質(zhì)表面P-OVA自組裝顆粒在油/水界面的吸附，形成的物理屏障提高了乳化劑的穩(wěn)定性。

由圖6中b可知，當(dāng)鹽離子濃度為0 mmol/L時(shí)，未加熱樣品P-0穩(wěn)定的乳液對(duì)β-胡蘿卜素的保留率為65.33%，而自組裝聚集體穩(wěn)定的乳液對(duì)β-胡蘿卜素的保留率高達(dá)86.73%，相比于P-0提高了11.40%。此外，乳液對(duì)β-胡蘿卜素的保留率隨著鹽離子濃度的升高發(fā)生不同程度的下降，表明β-胡蘿卜素的降解受鹽離子的影響很大。當(dāng)離子濃度為100 mmol/L時(shí)，P-OVA穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液的保留率顯著下降至43.56%，而熱處理12 h對(duì)照組的β-胡蘿卜素的保留率高達(dá)72.86%，說明由自組裝聚集體穩(wěn)定的乳液中β-胡蘿卜素降解速率慢，表明由自組裝聚集體穩(wěn)定的乳液對(duì)β-胡蘿卜素有較強(qiáng)的保護(hù)作用。

2.6.2 溫度穩(wěn)定性

溫度變化對(duì)β-胡蘿卜素乳液平均粒徑和β-胡蘿卜素保留率的影響見圖7。

圖7 不同溫度對(duì)β-胡蘿卜素乳液平均粒徑(a)和β-胡蘿卜素保留率(b)的影響Fig.7 Effect of different temperatures on the average particle size of β-carotene emulsion (a) and β-carotene retention rate (b)

由圖7中a可知，隨著溫度從25 ℃增加到85 ℃，由未加熱樣品P-0穩(wěn)定的乳液的平均粒徑從307.47 nm增加到378.27 nm，熱處理后的液滴粒徑增大，這可能是因?yàn)殪o電排斥減弱，P-OVA在熱誘導(dǎo)過程中發(fā)生熱聚集，且吸附在油/水界面上的蛋白膜被破壞，導(dǎo)致乳液的穩(wěn)定性降低，從而增加了乳液的平均粒徑。經(jīng)高溫?zé)崽幚?0 min后，P-OVA、P-OVA自組裝聚集體共軛穩(wěn)定的乳液的液滴粒徑分別增加了23.03%(0 h)、5.16%(6 h)、1.21%(12 h)、1.71%(18 h)和1.74%(24 h)，說明以P-OVA自組裝聚集體為乳化劑制備的乳液比以P-OVA為乳化劑制備的乳液具有更高的熱穩(wěn)定性，這可能是熱處理使P-OVA自組裝聚集體的疏水基團(tuán)暴露在外，增加的表面疏水性改善了界面蛋白在油/水界面的吸附，提高了乳化劑的界面強(qiáng)度。

由圖7中b可知，隨著溫度的增加，P-OVA乳液對(duì)β-胡蘿卜素的保留率從65.33%下降至42.87%，這可能是因?yàn)闊崽幚砑铀倭巳橐旱牟祭蔬\(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致乳液液滴相互碰撞，另一方面，熱處理后蛋白質(zhì)分子也會(huì)析出，從而使油/水界面膜變薄，不利于β-胡蘿卜素保持穩(wěn)定[24]。而P-OVA自組裝聚集體乳液中β-胡蘿卜素的保留率穩(wěn)定在65%以上，說明由自組裝聚集體穩(wěn)定的乳液中β-胡蘿卜素降解速率慢，對(duì)β-胡蘿卜素有較強(qiáng)的保護(hù)作用。

2.7 β-胡蘿卜素乳液的消化特性

2.7.1β-胡蘿卜素乳液的消化微觀結(jié)構(gòu)

模擬消化過程中β-胡蘿卜素乳液的原始階段、胃階段、腸階段的微觀結(jié)構(gòu)見圖8中a。在原始階段過程中，乳液液滴分布較為均勻，乳液中沒有出現(xiàn)絮凝或團(tuán)聚現(xiàn)象。在模擬胃液過程中，由不同乳化劑穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液出現(xiàn)部分粒徑較大的油滴，可能是不同熱誘導(dǎo)時(shí)間的P-OVA自組裝聚集體在胃蛋白酶的水解作用下，乳液結(jié)構(gòu)遭到破壞導(dǎo)致油滴聚集[25]。在模擬腸液過程中，在由自組裝聚集體穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液中幾乎觀察不到油滴，這可能是因?yàn)橹久笇⒂椭鉃橛坞x脂肪酸和單甘油酯。值得注意的是，由P-0穩(wěn)定的乳液還存在著少量的液滴，Hur等[26]研究發(fā)現(xiàn)乳化劑在模擬腸液消化后，部分或全部會(huì)被酶水解，被膽鹽、磷脂或者游離脂肪酸取代。

2.7.2β-胡蘿卜素乳液平均粒徑

模擬消化過程中5種β-胡蘿卜素乳液的平均粒徑見圖8中b。5種β-胡蘿卜素乳液的平均粒徑在消化過程中整體呈先增大后減小的趨勢(shì)。Sun等[24]利用葡聚糖修飾卵清蛋白穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液發(fā)現(xiàn)在模擬胃消化過程中相對(duì)分子質(zhì)量為40～50 kDa的碎片消失，推測(cè)可能是乳化劑在胃蛋白酶水解過程中遭到破壞，減小了蛋白質(zhì)層的厚度，從而引起了液滴的聚集，這一結(jié)果與激光共聚焦檢測(cè)的微觀結(jié)構(gòu)觀察相似。隨后乳液在模擬小腸消化過程中，5種乳液的平均粒徑有所減小，這可能是油滴被胰脂肪酶水解導(dǎo)致平均粒徑減小。

圖8 模擬消化過程中β-胡蘿卜素乳液微觀結(jié)構(gòu)圖(a)和平均粒徑(b)Fig.8 Microstructure diagram (a) and average particle size (b) of β-carotene emulsion during simulated digestion

2.7.3β-胡蘿卜素乳液緩釋特性

不同熱誘導(dǎo)時(shí)間的自組裝聚集體穩(wěn)定的乳液在模擬消化過程中β-胡蘿卜素動(dòng)力學(xué)緩釋曲線見圖9。

圖9 不同熱處理時(shí)間的磷酸化卵白蛋白自組裝聚集體穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液緩釋圖Fig.9 Slow-release graph of β-carotene emulsion stabilized by phosphorylated ovalbumin self-assembled aggregates with different heat treatment time

由圖9可知，在連續(xù)SGF和SIF條件下，所有組都表現(xiàn)出相似的動(dòng)力學(xué)釋放曲線，在SGF條件下快速釋放，然后在隨后的SIF條件下緩慢釋放，隨后在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡值，該結(jié)果表明β-胡蘿卜素在消化過程中是持續(xù)釋放而不是瞬間釋放的。值得注意的是，由未熱處理的P-OVA穩(wěn)定的乳液的β-胡蘿卜素在整個(gè)消化過程中表現(xiàn)出較高的釋放量，這歸因于乳液在腸胃消化過程中油滴相互聚集，出現(xiàn)破乳現(xiàn)象，導(dǎo)致β-胡蘿卜素暴露在水相中。與未熱處理的P-0穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液相比，在嚴(yán)酷的消化條件下，熱誘導(dǎo)P-OVA自組裝聚集體穩(wěn)定的乳液β-胡蘿卜素的釋放明顯較慢。表明以脂溶性功能因子β-胡蘿卜素為代表，構(gòu)建P-OVA自組裝Pickering乳液遞送體系，在功能因子穩(wěn)定遞送和控制釋放上具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

通過利用不同加熱時(shí)間的P-OVA自組裝穩(wěn)定的Pickering乳液包埋熱敏性功能因子β-胡蘿卜素，研究了該新型Pickering乳液在功能因子遞送體系中的包埋及緩釋機(jī)制。結(jié)果表明，與P-0穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液相比，P-OVA自組裝聚集體乳液具有更大的粒徑，更小的PDI值，更高的Zeta電位絕對(duì)值。流變學(xué)分析表明P-OVA自組裝聚集體穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液的表觀黏度增加，凝膠網(wǎng)絡(luò)增強(qiáng)，有利于提高β-胡蘿卜素乳液體系的穩(wěn)定性。而且，P-OVA自組裝聚集體穩(wěn)定的β-胡蘿卜素乳液的粒徑受溫度和鹽離子因素的影響較小，且提高了β-胡蘿卜素的保留率。此外，自組裝聚集體在油/水界面上形成了一層物理層，對(duì)油相提供保護(hù)，所制備的Pickering乳液具有較好的抗消化性能，并且提高了β-胡蘿卜素的生物利用度，為解決乳液遞送體系結(jié)構(gòu)的功能化設(shè)計(jì)及如何穩(wěn)定遞送脂溶、熱敏性食品功能因子的關(guān)鍵科學(xué)問題提供了理論支撐與應(yīng)用參考。