袁先鈴，張洲銪，袁玉梅，汪創(chuàng)，王俊丁，雷鳴

(1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000;2.四川省遠(yuǎn)達(dá)集團(tuán)富順縣美樂(lè)食品有限公司，四川 自貢 643200)

富順香辣醬是以干辣椒和花椒為主要原輔料的一種半固態(tài)復(fù)合調(diào)味料，屬于非發(fā)酵類辣椒醬，于2010年被列入國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品。香辣醬除了具有紅油鮮亮、醬體醇厚、濃郁鮮香、營(yíng)養(yǎng)豐富的特點(diǎn)外，還具有促進(jìn)食欲、改善消化的保健功效[1]。

辣椒屬熱帶漿果類蔬菜，如今中國(guó)已是辣椒生產(chǎn)和消費(fèi)的大國(guó)[2]。新鮮辣椒經(jīng)過(guò)自然晾曬或人工烘烤脫水得到干辣椒，干辣椒作為我國(guó)傳統(tǒng)的調(diào)味佳品[3]，被廣泛應(yīng)用于調(diào)味的食品添加劑和食品配料[4]，賀稚非等[5]研究發(fā)現(xiàn)鮮辣椒表面的微生物以細(xì)菌最多，而酵母菌和霉菌較少；張曉玲[6]的研究表明，在重慶市售的10種干辣椒樣品中分離得到13種細(xì)菌?；ń贩植荚谥袊?guó)大部分地區(qū)，是川菜烹飪中必不可少的調(diào)味料，董丹等[7]研究發(fā)現(xiàn)市售花椒粉中菌落總數(shù)達(dá)到5.4×105CFU/g，而大腸菌群數(shù)則達(dá)到2.1×105MPN/100 g。八角是中國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源性的香料[8]，因其含有反式茴香腦等多種有效抑菌成分，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等常見致病菌具有較高抑菌活性[9]。2012年湖南省質(zhì)監(jiān)局抽查發(fā)現(xiàn)永豐辣醬有限公司生產(chǎn)的永豐辣醬菌落指數(shù)超標(biāo)23.5倍[10]。

目前關(guān)于香辣醬的研究主要集中于發(fā)酵辣椒醬的生產(chǎn)工藝、貨架期、農(nóng)藥殘留以及微生物分析方面[11-16]，對(duì)于非發(fā)酵辣椒醬的研究主要集中于生產(chǎn)工藝方面[17-19]，微生物分析方面的研究相對(duì)較少。由于原輔料本身帶有大量的微生物，導(dǎo)致香辣醬產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，因此針對(duì)香辣醬主要原輔料中的食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)，確定具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)的食源性致病細(xì)菌，并進(jìn)行分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

香辣醬及其原輔料干辣椒、花椒、八角：由四川省遠(yuǎn)達(dá)集團(tuán)富順縣美樂(lè)食品有限公司提供。

1.2 試劑

氧化鈉(分析純)：天津市福晨化學(xué)試劑有限公司；結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(VRBGA)、緩沖蛋白胨水(BPW)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)、改良胰蛋白胨大豆肉湯、哥倫比亞CNA血瓊脂、哥倫比亞血瓊脂、李氏增菌肉湯、PALCAM瓊脂、李斯特氏菌顯色平板、四硫磺酸鈉煌綠增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、亞硫酸鉍瓊脂(BS)、氯化鈉堿性蛋白胨水、硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖(TCBS)瓊脂：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

YXQ-75SII 立式壓力蒸汽滅菌器、SW-CJ-2FD 凈化工作臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PH100-2A41L-EP 生物顯微鏡 深圳市潤(rùn)興光學(xué)儀器有限公司；GZX-9140MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；電子天平 慈溪市天東衡器廠；SPX-100B-Z 生化培養(yǎng)箱 上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司；3730XL測(cè)序儀、2720 Thermal Cycler PCR儀 美國(guó)ABI公司；JY04S-3C 凝膠成像儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Legend Micro 17離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 常見食源性致病菌檢測(cè)方法

根據(jù)GB 4789.4-2016[20]、GB 4789.10-2016[21]、GB 4789.41-2016[22]、GB 4789.30-2016[23]、GB 4789.7-2013[24]、GB 4789.11-2014[25]，對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、腸桿菌科、單增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、β型溶血性鏈球菌進(jìn)行處理及檢測(cè)。

1.4.2 腸桿菌科疑似菌生理生化鑒定方法

對(duì)篩選出的食源性致病細(xì)菌疑似菌進(jìn)行革蘭氏染色、乙酰甲基甲醇(V.P.)、甲基紅(M.R.)、糖發(fā)酵、吲哚、明膠液化、接觸酶、尿素水解等生理生化實(shí)驗(yàn)，以判斷菌的屬[26]。

1.4.3 腸桿菌科疑似菌分子生物學(xué)鑒定方法

操作步驟：基因組DNA 提?。喊碊P336 試劑盒提??；PCR 擴(kuò)增；凝膠電泳：1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA 20 min 電泳觀察；純化回收：PCR 產(chǎn)物的電泳條帶切割所需DNA靶帶，純化后的PCR產(chǎn)物直接用前體物測(cè)序。

將純化后的菌株送到擎科生物有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序；將得到的序列用BLAST軟件進(jìn)行對(duì)比分析[27]，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比較；根據(jù)比對(duì)的結(jié)果再結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)確定鑒定的菌種。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

利用Excel 2016統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 常見食源性致病細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果

富順香辣醬及主要原輔料中食源性致病細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 富順香辣醬及主要原輔料中食源性致病細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of foodborne pathogenic bacteria in Fushun spicy sauce and its main raw and auxiliary materials

續(xù) 表

由表1可知，干辣椒和花椒中均檢出腸桿菌科疑似菌、沙門氏菌疑似菌、金黃色葡萄球菌疑似菌、副溶血性弧菌疑似菌和β型溶血性鏈球菌疑似菌，與Doren等[28]在辣椒等香料中檢測(cè)出包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、坂崎克羅諾桿菌、梭狀芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的結(jié)果基本吻合；八角中未檢出上述致病菌，可能是因?yàn)榘私侵械能钕阌蛯?duì)食品常見細(xì)菌有明顯的抑制作用[29]；在成品中也未檢出上述6類致病菌，說(shuō)明在后續(xù)工藝過(guò)程中能夠殺滅上述食源性致病細(xì)菌。花椒中金黃色葡萄球菌數(shù)量較少，可能是因?yàn)榛ń诽崛∫簩?duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效力遠(yuǎn)大于辣椒提取液[30]。干辣椒中的腸桿菌科疑似菌和金黃色葡萄球菌疑似菌的數(shù)量比花椒中多，與姜太玲等[31]研究得出花椒籽蛋白抗菌肽對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用的結(jié)果相符；Wang等[32]研究出花椒精油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌和單核增生乳桿菌)的抑菌圈大于革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)的結(jié)果與本研究腸桿菌科疑似菌的數(shù)量明顯大于金黃色葡萄球菌疑似菌和單增李斯特氏菌的數(shù)量相符。干辣椒和花椒中腸桿菌科疑似菌的數(shù)量多于金黃色葡萄球菌疑似菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，腸桿菌科為革蘭氏陰性菌，可能是因?yàn)槔苯泛突ń分械囊志煞滞ㄟ^(guò)影響細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)從而達(dá)到抑制效果[33-34]。

原輔料中各食源性致病細(xì)菌菌落形態(tài)特征見表2。

表2 富順香辣醬主要原輔料中食源性致病細(xì)菌部分疑似菌菌落形態(tài)Table 2 Colonial morphology of some suspected foodborne pathogenic bacteria in the main raw and auxiliary materials of Fushun spicy sauce

續(xù) 表

由表2可知，從數(shù)量和種屬分類上推測(cè)腸桿菌科菌為富順香辣醬主要原輔料中的相對(duì)優(yōu)勢(shì)致病菌，研究結(jié)果與賀稚非等[35]研究的辣椒中的革蘭氏陰性桿菌多數(shù)是腸桿菌科菌，劉會(huì)平等研究的未經(jīng)輻照處理的花椒粉的大腸菌群數(shù)處于較高水平結(jié)果相一致。因此，擬定對(duì)腸桿菌科疑似菌進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化、生理生化和分子生物學(xué)的鑒定分析。

2.2 腸桿菌科疑似菌鑒定結(jié)果

2.2.1 腸桿菌科疑似菌生理生化鑒定結(jié)果

從主要原輔料干辣椒中分離出腸桿菌科疑似菌11株，花椒中分離出腸桿菌科疑似菌8株，其生理生化鑒定結(jié)果見表3。

表3 富順香辣醬原輔料中腸桿菌科疑似菌生理生化鑒定結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical identification results of suspected Enterobacteriaceae in raw and auxiliary materials of Fushun spicy sauce

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

圖1 部分代表性腸桿菌科疑似菌16S rDNA序列PCR擴(kuò)增序列電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified sequence of 16S rDNA sequence of some representative suspected Enterobacteriaceae bacteria

圖1中序號(hào)與表3中菌株編號(hào)相對(duì)應(yīng)。由圖1可知，6條泳道在1 500 bp左右位置都出現(xiàn)了均一亮條，且無(wú)特異性擴(kuò)增，符合測(cè)序要求。將條帶清晰的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)，選取相似度大于99%且比對(duì)分?jǐn)?shù)最高的序列，確定種屬。

利用聚類分析軟件MEGA 6.0將原輔料中的腸桿菌科疑似菌的拼接序列進(jìn)行聚類分析，采用鄰位相連法(Neighbor-Joining)建立系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。原輔料中腸桿菌科疑似菌鑒定結(jié)果見表4。

圖2 香辣醬原輔料中腸桿菌科疑似菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of suspected Enterobacteriaceae in the raw and auxiliary materials of spicy sauce

表4 富順香辣醬原輔料中腸桿菌科疑似菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果Table 4 Molecular biological identification results of suspected Enterobacteriaceae in raw and auxiliary materials of Fushun spicy sauce

續(xù) 表

結(jié)合生理生化和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果可知，從富順香辣醬原輔料干辣椒和花椒中鑒定出腸桿菌科致病菌13株。其中干辣椒中有6株腸桿菌科致病菌，分別為大腸桿菌(Escherichiacoli)、克羅諾桿菌(Cronobacterzurichensis)、Enterobacterbugandensis、弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)、腸桿菌屬(Enterobactersp.)、成團(tuán)泛菌屬(Pantoeaagglomerans)?；ń分杏?株腸桿菌科致病菌，分別為歐文氏菌屬(Erwiniasp.)、阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、塔斯馬尼亞歐文氏菌(Erwiniatasmaniensis)、桃色歐文氏菌(Erwiniapersicina)、致癌腸桿菌(Enterobactercancerogenus)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)檢測(cè)香辣醬原輔料中幾種常見食源性致病菌，確定相對(duì)優(yōu)勢(shì)食源性致病細(xì)菌，并對(duì)該相對(duì)優(yōu)勢(shì)食源性致病細(xì)菌進(jìn)行分離純化，對(duì)純化后的菌落進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA鑒定分析，研究結(jié)果表明，干辣椒和花椒中腸桿菌科疑似菌的數(shù)量相對(duì)較多，從鑒定結(jié)果的數(shù)量和種屬分類上可以確定，在富順香辣醬主要原輔料中腸桿菌科菌為常見食源性致病細(xì)菌(沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、腸桿菌科、單增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、β型溶血性鏈球菌)中相對(duì)優(yōu)勢(shì)的致病性細(xì)菌。干辣椒和花椒中共檢測(cè)出19株腸桿菌科疑似菌，結(jié)合生理生化和16S rDNA分子測(cè)序鑒定出腸桿菌科菌13種。針對(duì)富順香辣醬主要原輔料中食源性致病細(xì)菌的檢測(cè)、分離與鑒定，能夠了解富順香辣醬原輔料和產(chǎn)品中致病性細(xì)菌情況，為香辣醬生產(chǎn)過(guò)程的安全控制提供一定的理論基礎(chǔ)。