張盈銖,李文博,李艷*,周航
(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070)(2.遼寧科海食品化學(xué)工程有限公司,遼寧丹東 118000)
α-亞麻酸,為ω-3 系不飽和脂肪酸,是維持人體生命活動(dòng)必不可少,但自身不能合成,必須通過食物來提供的必需脂肪酸之一,在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA),對(duì)人體有諸多生理功能,如降血脂、降血壓,預(yù)防心腦血管疾病,抑制腫瘤的生長(zhǎng)等[1-4]。α-亞麻酸最常見的食物來源是植物油,如亞麻籽油、紫蘇油和牡丹籽油,其中亞麻籽油的α-亞麻酸含量最高,是補(bǔ)充α-亞麻酸的極佳來源[5]。然而甘油三酯的過多攝入會(huì)導(dǎo)致肥胖的發(fā)生,有研究證明不同形式的油脂在人體內(nèi)具有不同的新陳代謝率[6],因此在關(guān)注脂質(zhì)攝入量的同時(shí),還需要關(guān)注脂質(zhì)的攝入形式。
單、雙脂肪酸甘油酯是單甘酯與甘油二酯的混合物,由于甘油二酯獨(dú)特的代謝方式,使其具有多種生理功能,如降低血脂、抑制肝臟脂肪積累、預(yù)防心血管疾病等[7-9]。與甘油三酯相比,單、雙脂肪酸甘油酯與其結(jié)構(gòu)差異較小,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高,常被用作甘油三酯的替代品[7,10],因此,可以將富含α-亞麻酸的甘油二酯作為補(bǔ)充α-亞麻酸的極佳來源,而不會(huì)造成脂肪堆積的負(fù)擔(dān)[11]。在日本和美國(guó),甘油二酯已經(jīng)被允許作為烹調(diào)用油進(jìn)行食用[10]。此外,由于單、雙脂肪酸甘油酯的兩親性和表面活性,使其具有更高的溶解能力和更好的分散性[12]。有研究表明單、雙脂肪酸甘油酯有利于提高疏水性營(yíng)養(yǎng)素的溶解度和口服生物利用率[13,14]。然而,單、雙脂肪酸甘油酯在替代相應(yīng)油脂的潛力方面還有待深入研究。
由于食用油脂具有極強(qiáng)的疏水性,且在空氣中容易氧化,產(chǎn)生不良的風(fēng)味和有害物質(zhì),限制了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。為了解決油脂極易氧化和水溶性差的問題,開發(fā)有效的遞送系統(tǒng)具有重要的意義。水包油乳液已被證明是用于遞送功能性油脂的有效載體,許多研究表明水包油乳液能夠延緩油脂的氧化,并提高其穩(wěn)定性[15-18],還能提高不飽和脂肪酸的生物利用率[19,20]。
為此,本文選用常見的天然蛋白乳化劑(乳清蛋白Whey Protein Concentrate-WPC,大豆分離蛋白Soybean Protein Isolate-SPI,酪蛋白酸鈉 Sodium Caseinate-SC)及非離子型乳化劑(吐溫80-T80),以生物發(fā)酵來源的單、雙脂肪酸甘油酯(亞麻酸)為油相制備乳液,通過粒徑電位、微觀形態(tài)等乳液表征方法探究乳化劑類型對(duì)乳液形成的影響,對(duì)比不同乳液的物理穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性,并利用體外消化模型研究不同乳化劑對(duì)乳液脂質(zhì)消化速率和消化程度的影響,及亞麻籽油和單、雙脂肪酸甘油酯(亞麻酸)水解程度的差異,為單、雙脂肪酸甘油酯(亞麻酸)用于替代亞麻籽油的應(yīng)用提供參考依據(jù)。
乳清濃縮蛋白:約為85%,Hilmar 8010,美國(guó)希爾瑪配料公司;大豆分離蛋白:≥90%,西寶生物科技(上海)股份有限公司;酪蛋白酸鈉:90%,上海源葉生物技術(shù)有限公司;吐溫80:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;單、雙甘油脂肪酸酯(亞麻酸):?jiǎn)熙ズ?1.5%,雙酯含量24%,亞麻酸含量60.2%,遼寧科海食品化學(xué)工程有限公司;亞麻籽油:益海嘉里食品營(yíng)銷有限公司;其他所用試劑均為分析純。
Ultra-TurraxT25 型高速剪切機(jī),德國(guó)IKA 公司;M-110L 型高壓微射流均質(zhì)機(jī),美國(guó)Microfluidics 公司;TI-S 倒置熒光顯微鏡,日本尼康公司;UV-1700 型紫外-可見分光光度計(jì),日本島津公司;902 Titrando 全自動(dòng)電位滴定儀,瑞士萬(wàn)通公司;Malvern 2000 型激光粒度分析儀,英國(guó)Malvern 公司;Zetasizer Nano ZS 型納米粒度測(cè)定儀,英國(guó)Malvern 公司。
1.3.1 乳液制備
將1%(m/m)WPC、SPI、SC 和T80 分別溶解在緩沖溶液(5 mmol/L 磷酸鹽緩沖液PBS,pH 值7.0)中制備水相,其中WPC、SPI 和SC 溶液置于4 ℃冰箱中冷藏過夜以充分水合。以單、雙脂肪酸甘油酯(亞麻酸)為油相,將油相(5%,m/m)與水相(95%,m/m)攪拌混合,用高速分散均質(zhì)機(jī)以12 000 r/min 的速度持續(xù)剪切1.5 min 形成粗乳液,粗乳液在62 MPa的壓力下通過高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行5 次循環(huán),制得的乳液于4 ℃保存?zhèn)溆?。由T80、SC、SPI 和WPC 制得的乳液分別標(biāo)記為:T-GLE、C-GLE、S-GLE、W-GLE。
1.3.2 體外消化模型的構(gòu)建
1.3.2.1 口腔
參考Sarkar 等[21]的方法并稍作修改。將6 mL 的乳液和1.5 mL PBS(pH 值7.0,5 mmol/L)混合,再與7.5 mL 模擬口腔液混合,將混合液的pH 值調(diào)至6.8,在37 ℃的恒溫水浴鍋中孵育10 min,模擬口腔消化。模擬口腔液由粘蛋白和不同種類的鹽組成,其配方為:蒸餾水,NaCl(1.594 g/L),NH4NO3(0.328 g/L),KH2PO4(0.636 g/L),KCl(0.202 g/L),K3C6H5O7·H2O(0.308 g/L),H2NCONH2(0.198 g/L),粘蛋白(5 g/L)。
1.3.2.2 胃
取15 mL經(jīng)口腔消化樣品與15 mL模擬胃液混合,用NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至2.5。最終混合物以100 r/min 連續(xù)攪拌,于37 ℃下孵育1 h。模擬胃液的配方為:蒸餾水,NaCl(2 g/L),胃蛋白酶(3.2 g/L)和HCl(0.084 mol/L),將pH 值調(diào)為1.2 即得模擬胃液[22]。
1.3.2.3 小腸
將30 mL 胃消化樣品加入100 mL 玻璃燒杯中,在37 ℃水浴中孵育,然后將pH 值調(diào)至7.0。將1.5 mL的模擬小腸液和3.5 mL 的膽汁鹽溶液(53.57 mg/mL)添加到燒杯中,不斷攪拌,并將混合物的pH 值調(diào)至7.0。隨后加入2.5 mL 新鮮制備的胰酶懸浮液(24 mg/mL),采用pH-stat 滴定儀使體系pH 值維持在7.0,保持2 h,監(jiān)測(cè)消耗的NaOH 體積。模擬小腸液的配方為:蒸餾水,CaCl2(125 mmol/L)和NaCl(3.75 mol/L)[23]。
通過公式(1)可由消化過程中NaOH 消耗量計(jì)算出游離脂肪酸的釋放量,反應(yīng)出油脂的消化速率和最終消化程度。
游離脂肪酸的釋放率用下式表示:
式中:
FFA——游離脂肪酸的釋放率,%;
VNaOH(t)——在t時(shí)刻消耗NaOH 的體積,L;
MNaOH——NaOH 的摩爾濃度,mol/L;
Mlipid——油脂的摩爾質(zhì)量,g/mol;
wlipid——消化前乳液中油的質(zhì)量,g。
1.3.3 乳液粒徑與Zeta 電位測(cè)量
采用激光粒度分析儀和納米粒度測(cè)定儀測(cè)定乳液及各消化階段的平均粒徑、粒徑分布及Zeta 電位,測(cè)量溫度為25 ℃。分析前用磷酸鹽緩沖液(5 mmol/L,pH 值7.0)稀釋初始樣品、口腔樣品、小腸樣品,胃樣品用蒸餾水稀釋至pH 值2.5。
1.3.4 微觀結(jié)構(gòu)觀察
1.3.4.1 光學(xué)顯微鏡
利用光學(xué)顯微鏡觀察初始乳液的微觀結(jié)構(gòu)。取10 μL 樣品滴于載玻片中央,通過100 倍油鏡對(duì)乳液的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,拍照記錄并根據(jù)標(biāo)尺判斷乳滴大小。
1.3.4.2 熒光顯微鏡
采用熒光顯微鏡觀察乳液和消化液液滴分布情況。染色方法為:1.5 mL 樣品加10 μL 尼羅紅(0.01%),熒光染色后,于熒光顯微鏡下觀察各階段乳液的微觀結(jié)構(gòu)。
1.3.5 穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)
1.3.5.1 貯藏穩(wěn)定性
將制備好的乳液進(jìn)行分裝,置于4 ℃環(huán)境下保存14 d,分別在第0、3、5、7、14 天記錄乳液的宏觀和微觀變化,并測(cè)定其粒徑的大小,評(píng)價(jià)外部環(huán)境對(duì)乳液貯藏穩(wěn)定性的影響。
1.3.5.2 氧化穩(wěn)定性
將乳液樣品置于50 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行加速氧化,比較由不同乳化劑穩(wěn)定的乳液中油脂氫過氧化物及次級(jí)氧化產(chǎn)物丙二醛的含量隨時(shí)間的變化趨勢(shì),研究乳液的抗氧化機(jī)制與性能。
氫過氧化值(Peroxide Value,POV)參考Julio等[24]的方法并稍作修改。取0.2 mL 乳液或取與乳液中油相含量相當(dāng)?shù)膯?、雙脂肪酸甘油酯(亞麻酸)和亞麻籽油與1 mL 異辛烷/異丙醇(3:1,V/V)混合,渦旋震蕩20 s,然后在3 400 g 下離心2 min,取0.2 mL 有機(jī)相,溶于甲醇/正丁醇(2:1,V/V)溶液中,加入20 μL 3.94 mol/L 硫氰酸銨溶液和20 μL 二價(jià)鐵離子溶液(由0.132 mol/L氯化鋇和0.144 mol/L 硫酸亞鐵混合制成),用甲醇/正丁醇(2:1,V/V)溶液定容至8 mL,置于暗處反應(yīng)20 min 后于510 nm 處測(cè)定溶液的吸光度。以過氧化氫為標(biāo)準(zhǔn)繪制曲線,計(jì)算樣品的POV 值。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。
硫代巴比妥酸值(Thiobarbituric Acid Value,TBARS)參考Nasrabadi 等[15]的方法并稍作修改。取乳液0.2 mL,用水稀釋至2 mL,加入4 mL 硫代巴比妥酸(TBA)溶液(由0.375 g TBA、15 g 三氯乙酸和100 mL 0.25 mol/L HCl 混合而成),沸水浴15 min,在自來水下冷卻5 min,于10 000 r/min 離心10 min 后,收集上清液并于532 nm 處測(cè)定吸光度。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品的TBARS 值。每個(gè)樣品平行測(cè)量3 次,記錄平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。
1.3.6 數(shù)據(jù)分析
每個(gè)樣品至少進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,p<0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
不同乳液的粒徑電位如圖1 所示,初始乳液均具有較小的平均粒徑(131.97~224.87 nm)(圖1a)。T80由于其較高的表面活性,所穩(wěn)定的乳液粒徑最?。ā?31.97 nm)。初始液滴尺寸的差異通常是由均質(zhì)化過程中乳化劑表面活性和吸附動(dòng)力學(xué)的差異所引起[25]。對(duì)乳液的Zeta 電位進(jìn)行測(cè)量(圖1b),結(jié)果表明所有乳液的表面電位均為負(fù)值,其中,由蛋白質(zhì)穩(wěn)定的乳液具有較強(qiáng)的靜電斥力(電勢(shì)絕對(duì)值大于3 0 mV),T80 穩(wěn)定的乳液的電位值相對(duì)較?。?4.20 mV),這可能是因?yàn)橛傻鞍追€(wěn)定乳液的pH 值遠(yuǎn)高于蛋白的等電點(diǎn)(pI≈4~5),因此吸附的蛋白質(zhì)會(huì)帶強(qiáng)烈的負(fù)電荷,從而賦予乳滴間較強(qiáng)的靜電排斥力。
圖1 不同乳化劑穩(wěn)定乳液的初始粒徑(a)和電位(b)Fig.1 Particle size (a) and zeta-potential (b) of the emulsions stabilized by different emulsifier
2.2.1 貯藏穩(wěn)定性
乳液的粒徑大小和微觀形態(tài)對(duì)乳液的穩(wěn)定性(乳析、絮凝和聚結(jié))有重要影響。將新鮮制備的乳液置于4 ℃下貯藏14 d,觀察乳液平均粒徑、宏觀和微觀結(jié)構(gòu)的變化(圖2)。從結(jié)果可以看出,四種乳液在外觀上相似,為顏色均一的乳白色,無分層、乳析現(xiàn)象。在4 ℃貯藏兩周后乳液的外觀、微觀結(jié)構(gòu)及粒徑大小變化不大,表明乳液具備良好的貯藏穩(wěn)定性。
圖2 乳液在14 d 貯藏期的外觀(a)、微觀結(jié)構(gòu)(b)及粒徑(c)的變化Fig.2 Appearance (a),microstructure (b) and particle size (c) of emulsions during 14 days storage
2.2.2 氧化穩(wěn)定性
油脂的氧化是影響食品品質(zhì)和貨架期的主要原因。多不飽和脂肪酸極易被氧化,產(chǎn)生不良的風(fēng)味和氣味,甚至產(chǎn)生有毒化合物,損害人體健康[26]。可以通過測(cè)定乳液在加速氧化儲(chǔ)存期所產(chǎn)生的初級(jí)氧化產(chǎn)物和次級(jí)氧化產(chǎn)物來評(píng)估乳液的氧化穩(wěn)定性。
如圖3a 所示,儲(chǔ)藏14 d 后,純亞麻籽油具有最高的過氧化物含量(628.16 mmol/kg)。與純油和酯相比,乳液界面的組成和厚度能有效減緩脂質(zhì)氧化的發(fā)生[27]。在氧化初期,乳液中的過氧化物含量較高,可能與乳液的高界面面積、乳化過程引入的氧氣、剪切應(yīng)力產(chǎn)生的過熱等因素有關(guān)[28]。此外,由于單、雙脂肪酸甘油酯(亞麻酸)中不飽和脂肪酸的含量較多,對(duì)氧的敏感性更大,故在氧化初期其過氧化值迅速增加。在儲(chǔ)藏14 d 后,由WPC、SPI 和SC 穩(wěn)定的乳液氫過氧化物含量分別為217.45、197.73、235.95 mmol/kg,顯著少于由T80 穩(wěn)定的乳液(377.40 mmol/kg)(p<0.05)。這是由于T80 乳液具有較小的平均粒徑,更大的界面面積有利于脂質(zhì)與氧氣的接觸,加快了脂質(zhì)的氧化速度,而蛋白質(zhì)可作為金屬螯合劑和自由基清除劑,有利于延緩脂質(zhì)氧化的發(fā)生[29]。
TBARS 是表征脂質(zhì)次級(jí)氧化程度的指標(biāo)之一,一般與氫過氧化物相結(jié)合共同解釋油脂氧化過程。如圖3b 所示,TBARS 與脂質(zhì)過氧化物的結(jié)果具有類似的趨勢(shì)。儲(chǔ)存14 d 后,亞麻籽油具有最高的TBARS值,為1.30 mmol/kg,Nasrabadi 等[15]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明散裝亞麻籽油在50 ℃的儲(chǔ)存下具有更高的POV 和TBARS 值,這是多不飽和脂肪酸在高溫下更快氧化的結(jié)果。四種乳液的 TBAR S 值均較低(0.26~0.37 mmol/kg),由于乳液的界面層充當(dāng)了油滴的物理屏障,油脂液滴與具有促進(jìn)油脂氧化的離子相互作用減弱,使其氧化速率減慢[15]。氧化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乳液能夠提高亞麻籽油及其甘油酯的氧化穩(wěn)定性,并且相比T80,蛋白質(zhì)對(duì)油脂的氧化保護(hù)效果更好。
圖3 乳液在50 ℃下貯藏14 d氫過氧化物濃度(a)和TBARS濃度(b)Fig.3 Lipid hydroperoxide concentration (a) and TBARS concentration (b) of emulsions stored at 50 °C for 14 days
乳液經(jīng)模擬口腔消化后,所有樣品的平均粒徑較初始粒徑都略微增加(圖4a),但仍保持初始乳液的粒徑分布(圖5)。熒光顯微圖(圖6)顯示模擬口腔消化后脂滴發(fā)生了輕微的絮凝,脂滴絮凝可歸因于模擬唾液中黏蛋白分子的橋接作用[30],這與Yuan 等[31]的研究結(jié)果一致。在電位方面(圖4b),經(jīng)口腔消化后各乳液的電位與初始樣品具有相似的趨勢(shì),T80 穩(wěn)定乳液的電位值較初始值顯著升高(p<0.05)。
模擬胃相消化后,可以觀察到所有樣品的平均粒徑顯著增加(p<0.05)(圖4a),且粒徑分布中大顆粒的數(shù)量增多(圖5),尤其以蛋白穩(wěn)定的乳液最為明顯。從熒光顯微鏡圖像可以看出經(jīng)過胃相消化后出現(xiàn)了大量液滴絮凝(圖6),其中,T80 穩(wěn)定的乳液的液滴聚集水平要比蛋白質(zhì)乳液小得多,胃內(nèi)脂滴聚集可歸因于蛋白質(zhì)被胃液中的蛋白酶水解,使得蛋白包被液滴之間的靜電斥力降低[31]。通過模擬胃相消化后,所有樣品的電位相當(dāng)相似,接近于零(0.35~4.19 mV)(圖4b),這可能是因?yàn)橹伪砻娴牡鞍踪|(zhì)被蛋白酶部分消化,蛋白質(zhì)分子在低于其等電點(diǎn)的低pH 值下帶正電荷,使陰離子被吸收到陽(yáng)離子液滴表面,從而實(shí)現(xiàn)電荷中和,這與之前的研究報(bào)道一致[31]。
圖4 不同模擬消化階段乳液的粒徑(a)和電位(b)Fig.4 Particle size (a) and zeta-potential (b) of emulsions at different simulative digestion stages
圖6 不同模擬消化階段乳液的熒光顯微圖像Fig.6 Fluorescence microscopic images of emulsions at different simulative digestion stages
模擬小腸消化后,可以觀察到所有樣品的平均粒徑(d32<1 μm)顯著降低(p<0.05)(圖4a),平均粒徑的減小主要是由于脂滴被脂肪酶消化所致。此外,部分乳液粒徑分布呈多峰分布(圖5),這可能是由于食糜中存在不同類型的膠體顆粒,如混合膠束、不溶性鈣鹽等[31]。所有樣品經(jīng)過模擬小腸階段后,負(fù)電荷均高于胃階段,這可以歸因于模擬小腸相中存在陰離子膠體粒子。乳化劑的類型對(duì)模擬小腸階段后混合物的電勢(shì)有一定的影響,WPC、SPI 和SC 比T80 具有更高的負(fù)電荷,這可能是由于蛋白質(zhì)更容易在顆粒表面聚集,從而導(dǎo)致負(fù)電荷更低。
圖5 不同模擬消化階段乳液的粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of emulsions at different simulative digestion stages
通過pH-stat 方法研究了乳化劑類型對(duì)脂質(zhì)消化的影響,以單、雙脂肪酸甘油酯(亞麻酸)和亞麻籽油為對(duì)照,體外模擬消化模型中的脂肪酸釋放率如圖7所示。與純油和酯相比,乳液因其較小的液滴尺寸和更大的比表面積有利于脂質(zhì)的消化,且表面活性劑和蛋白質(zhì)易于被膽汁鹽置換,從而提高脂質(zhì)的消化速率[15]。對(duì)乳液的消化速率分析表明,乳化劑類型對(duì)游離脂肪酸的釋放影響不大,表現(xiàn)為SPI(68.03%)>SC(64.03%)≈T80(63.22%)≈WPC(61.67%)。不同乳液之間脂解程度存在的差異可能是因?yàn)槿榛瘎┑男再|(zhì)會(huì)影響模擬消化液中的膽汁鹽、脂肪酶和其他反應(yīng)物吸附到脂滴表面的能力,此外,乳化劑與胃腸道中成分的相互作用、乳液液滴的大小和比表面積也會(huì)對(duì)脂質(zhì)消化產(chǎn)生影響[32,33]。有研究表明,盡管小分子表面活性劑(T20)穩(wěn)定乳液在胃部消化過程中聚集程度較小,但由于T20 較高的表面活性,限制了脂肪酶/共脂肪酶復(fù)合物在脂滴表面的吸附,從而降低了乳液的消化速率[33]。與亞麻籽油(23.93%)相比,單、雙脂肪酸甘油酯(亞麻酸)的初始消化速度更快,最終消化率更高(46.33%)。此前有文獻(xiàn)報(bào)道,富含α-亞麻酸的甘油二酯比亞麻籽油具有更高的消化率[11]。Golding 等[34]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,在消化吸收特性實(shí)驗(yàn)中,與甘油三酯相比,甘油二酯產(chǎn)生的乳糜微粒更容易被脂肪酶水解,從而釋放更多的脂肪酸。
圖7 小腸消化階段乳液中游離脂肪酸的釋放曲線Fig.7 Released profile of free fatty acid from emulsions during small intestine digestion phase
以單、雙脂肪酸甘油酯(亞麻酸)為油相,以乳清濃縮蛋白、大豆分離蛋白、酪蛋白酸鈉和吐溫80 為乳化劑制備乳液。結(jié)果表明,不同乳化劑所制備的乳液均具有較小的粒徑和均一的粒徑分布,且在14 d 的儲(chǔ)藏期內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定。脂質(zhì)氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相比T80,蛋白質(zhì)作為乳化劑在抑制油脂氧化方面更加有效。在體外消化試驗(yàn)中,蛋白質(zhì)穩(wěn)定的乳液在胃消化階段出現(xiàn)大量顆粒聚集,但所選乳化劑對(duì)乳液中脂質(zhì)的最終水解程度影響不大,同時(shí)與亞麻籽油相比,單、雙脂肪酸甘油酯(亞麻酸)的初始消化速度更快,最終消化率更高。因此,為了延長(zhǎng)富含不飽和脂肪酸脂質(zhì)的貨架期并改善其消化能力,在乳液遞送體系的構(gòu)建過程中,選擇合適的乳化劑具有重要的意義。