郭立凈，袁利杰，袁陽(yáng)蕾

（河南省食品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(食品安全快速檢測(cè)與智慧監(jiān)管技術(shù))，特殊食品工程技術(shù)中心，河南鄭州 450003）

隨著我國(guó)工業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，環(huán)境污染問(wèn)題使得空氣質(zhì)量不斷惡化，以及人們工作壓力增大，嗜好煙酒、熬夜、飲食油膩辛辣等生活習(xí)慣，咽喉疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]，加上人們保健意識(shí)的提升，清咽類保健食品深受廣大消費(fèi)者的追捧。從申報(bào)注冊(cè)的資料發(fā)現(xiàn)，清咽類保健食品的原料主要是金銀花、胖大海、羅漢果等藥食同源類中草藥，但是一些不法分子為牟取利潤(rùn)和快速緩解咽喉不適，在清咽類保健食品中添加療效更為顯著的化學(xué)藥物，添加的藥物種類和添加劑量均處于一個(gè)不可控制的狀態(tài)，消費(fèi)者在不知情的情況下超劑量或長(zhǎng)期服用，會(huì)對(duì)身體造成較大的傷害[2-4]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在中成藥復(fù)方咳喘王膠囊中檢出鹽酸二氧丙嗪[5]，鹽酸二氧丙嗪屬于抗組胺類藥物，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、消炎和黏膜表面局部麻醉等作用；另外近期出現(xiàn)保健食品中檢出麻黃堿的報(bào)道[6]，麻黃堿屬于腎上腺素受體激動(dòng)劑，主要用來(lái)治療支氣管哮喘、過(guò)敏反應(yīng)、鼻粘膜充血等疾病。從抗組胺類藥物和麻黃堿類藥物的治療功能上分析，很容易被添加到清咽類保健食品中用來(lái)快速緩解咽喉疾病[7]，而且這些藥物存在一定的副作用，譬如抗組胺類藥物存在中樞神經(jīng)抑制作用、抗膽堿作用、心臟毒性及體質(zhì)量增加的不良反應(yīng)[8]，均不得在保健食品中添加。

目前已報(bào)道的中成藥或保健食品中非法添加藥物的檢測(cè)技術(shù)主要有薄層色譜法[9]、高效液相色譜法[7,10]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[11-15]、高分辨質(zhì)譜法[16-18]、紅外光譜法[19-21]、核磁共振法[22,23]等，其中文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于清咽類保健食品中非法添加藥物主要是沙丁胺醇、鹽酸二氧丙嗪等。UPLC-Q/Orbitrap HRMS 是一種高通量的篩查技術(shù)，具有高靈敏度和高選擇性，在缺少標(biāo)準(zhǔn)品的情況下根據(jù)建立的數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)現(xiàn)可靠性的快速定性篩查，目前已在食品安全領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但尚沒(méi)有使用UPLC-Q/Orbitrap HRMS 對(duì)清咽類保健食品中麻黃堿、甲基麻黃堿以及10 種抗組胺類藥物的快速篩查分析的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以市面上常見(jiàn)的六類清咽類保健食品為研究對(duì)象，建立UPLC-Q/Orbi-trap HRMS 同時(shí)快速篩查麻黃堿、抗組胺類等12 種藥物的分析方法，實(shí)現(xiàn)清咽類保健食品中12 種非法添加藥物快速定性篩查和定量分析，為監(jiān)管部門(mén)做到早預(yù)警、早發(fā)現(xiàn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Vanquish 超高效液相色譜系統(tǒng)、Q Exactive PlusTM四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，美國(guó)Thermo；Mettler XS205 電子天平，瑞士梅特勒；3-30K 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma；Milli-Q 超純水器，美國(guó)密理搏公司；KQ-500 TDB 溫控超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司。

12 種藥物標(biāo)準(zhǔn)品：苯海拉明（批號(hào)21060496，純度99.80%）、鹽酸異丙嗪（批號(hào)21070641，純度99.50%）、馬來(lái)酸氯苯那敏（批號(hào)21070312，純度99.90%）、西替利嗪（批號(hào)21040011，純度99.80%）、氯雷他定（批號(hào)21081374，純度99.80%）、地氯雷他定（批號(hào)11692103，純度99.90%）、鹽酸二氧丙嗪（批號(hào)9062103，純度99.50%），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；麻黃堿（批號(hào)S036177，100.00 μg/mL），阿爾塔科技有限公司；甲基麻黃堿（批號(hào)11279，1.00 mg/mL），LGC Mikromol；伊巴斯?。ㄅ?hào)2106580，純度99.9%），上海安普璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；氮卓斯?。ㄅ?hào)22Z042-B4，純度98.00%）、非索非那定（批號(hào)22Z042-B2，純度99.60%），上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純），德國(guó)Merck 公司；甲酸（質(zhì)譜純）、乙酸銨（質(zhì)譜純），美國(guó)Sigma公司；超純水（電阻率為18.20 MΩ·cm，25 ℃），美國(guó)Millipore 公司。105 批次的草珊瑚、羅漢果、川貝枇杷、金銀花、西瓜霜、胖大海等為原料的含片清咽類保健食品，購(gòu)買(mǎi)于本地市場(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，4 ℃保存。分別精密量取上述12種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用新制。

1.2.2 樣品前處理

取草珊瑚、羅漢果、川貝枇杷、金銀花、西瓜霜、胖大海六類藥食同源中草藥為原料的含片清咽類保健食品，經(jīng)制樣機(jī)打碎，研磨成粉狀，精密稱取制備樣品1.00 g 于50 mL 容量瓶中，加30 mL 乙腈，振蕩混勻，超聲10 min，放冷至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾后，上機(jī)測(cè)試。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZOBAX XDB C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流速：0.30 mL/min；流動(dòng)相A：0.1%甲酸（含5 mmol/L 乙酸銨）溶液，B：甲醇；梯度洗脫程序：0～4.0 min，95% A～10% A；4.0～7.5 min，10% A；7.5～7.6 min，10% A～95% A；7.6～10.0 min，95% A。

1.2.4 質(zhì)譜條件

Q Exactive TM 質(zhì)譜系統(tǒng)配有加熱電噴霧離子源（HESI），采用正離子掃描模式（ESI+）；噴霧電壓為3.00 kV，毛細(xì)管溫度和噴霧溫度分別為350 ℃和250 ℃；鞘氣和輔助氣流速分別設(shè)為35 arb 和5 arb，霧化氣為氮?dú)?，S-lens RF 電壓為50 V。質(zhì)譜掃描方式為Full MS/dd-MS2模式。Full MS（一級(jí)母離子全掃描）分辨率設(shè)為70 000 FWHM，質(zhì)譜掃描范圍為m/z100～550，自動(dòng)增益控制（AGC）、最大注入時(shí)間（IT）分別設(shè)為1.00×106和50 ms；dd-MS2（數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)質(zhì)譜掃描）分辨率設(shè)為17 500 FWHM，AGC 設(shè)為5.00×105，IT 設(shè)為50 ms，分離窗品設(shè)為m/z2.00，強(qiáng)度閾值（Intensity Threshold）設(shè)為2.00×105，同位素排除設(shè)為“on”，動(dòng)態(tài)排除值設(shè)為10.00 s。各化合物的步進(jìn)歸一化碰撞能量（NCE）值統(tǒng)一設(shè)為30、50、70 eV。12 種藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 12 種藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of the 12 drugs

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

實(shí)驗(yàn)采用常見(jiàn)的C18色譜柱，分別選取φ=0.1%甲酸溶液和φ=0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L 乙酸銨）作為水相，甲醇和乙腈作為有機(jī)相進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相為φ=0.1%甲酸（含5 mmol/L 乙酸銨）溶液和甲醇時(shí)，各物質(zhì)響應(yīng)強(qiáng)度明顯高于流動(dòng)相為φ=0.1%甲酸水溶液和甲醇的強(qiáng)度，且峰型拖尾現(xiàn)象得到明顯改善；與乙腈作為有機(jī)相相比，甲醇能在更短時(shí)間內(nèi)使待測(cè)組分得到有效分離。因此，實(shí)驗(yàn)選擇φ=0.1%甲酸（含5 mmol/L 乙酸銨）溶液和甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；同時(shí)實(shí)驗(yàn)考察了Agilent ZOBAX XDB C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）和Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）兩個(gè)品牌的C18色譜柱，發(fā)現(xiàn)二者沒(méi)有顯著性差異。

取六類清咽類保健食品作為空白基質(zhì)樣品，按照1.2.2 操作，從提取的離子色譜圖（Extracted Ion Chromatograms，XICs）中顯示，12 種藥物的保留時(shí)間處均沒(méi)有干擾峰，表明方法專屬性較強(qiáng)。在陰性樣品中添加12 種藥物，濃度均為100.00 μg/L，按照1.2.2操作，12 種藥物提取的離子色譜圖分離良好，單次測(cè)定12 種藥物在7.63 min 之內(nèi)完成分離，見(jiàn)圖1。

圖1 12 種藥物提取的離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of 12 drugs

2.2 提取溶劑的選擇

按照1.2.2，實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙腈、乙醇3 種常見(jiàn)提取溶劑對(duì)12 種藥物加標(biāo)回收率的影響。結(jié)果表明，草珊瑚與羅漢果清咽類保健食品在提取溶劑為乙腈、甲醇時(shí)，12 種藥物的回收率明顯高于乙醇；胖大海、西瓜霜、金銀花清咽類保健食品中12 種藥物的回收率在三種提取溶劑中無(wú)明顯差異；川貝枇杷清咽類保健食品在提取溶劑為乙腈時(shí)，12 種藥物回收率明顯高于甲醇、乙醇。結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析測(cè)定采用的為軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)，乙腈抗干擾能力較強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)選取乙腈作為提取溶劑。

2.3 提取溶劑體積和基質(zhì)效應(yīng)的考察

按照1.2.2，實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑體積為10、25、50 mL 對(duì)12 種藥物加標(biāo)回收率的影響。從圖2 金銀花清咽類保健食品中12 種藥物在不同提取體積的回收率變化可以看出，地氯雷他定在提取溶液為10 mL 時(shí)的回收率明顯低于25 mL 和50 mL，其他11 種藥物在三種提取體積時(shí)的回收率均在80.00%以上，這種回收率變化趨勢(shì)同樣出現(xiàn)在胖大海和西瓜霜清咽類保健食品中。

圖2 金銀花清咽類保健食品中12 種藥物在不同提取體積的回收率變化Fig.2 The recoveries of 12 drugs added to honeysuckle throat-clearing health food at different extraction volume

從圖3草珊瑚清咽類保健食品中12種藥物在不同提取體積的回收率變化可以看出，12 種藥物的回收率均隨提取溶液體積的增大而增加，在提取溶液體積為10 mL 和25 mL 時(shí)，8 種藥物的回收率未達(dá)到60.00%，而提取溶液體積為50 mL 時(shí)，除地氯雷他定回收率為76.13%外，其余11 種藥物的回收率均在80.00%以上，這種回收率變化趨勢(shì)同樣出現(xiàn)在羅漢果清咽類保健食品中。

圖3 草珊瑚清咽類保健食品中12 種藥物在不同提取體積的回收率變化Fig.3 The recoveries of 12 drugs added to Sarcandra glabra throat-clearing health food at different extraction volume

從圖4川貝枇杷清咽類保健食品中12種藥物在不同提取體積的回收率變化可以看出，地氯雷他定、西替利嗦、非索非那定的回收率隨著提取體積的增大而明顯增加，尤其在提取液體積為10 mL 時(shí)，回收率均低于50.00%。

圖4 川貝枇杷清咽類保健食品中12 種藥物在不同提取體積的回收率變化Fig.4 The recoveries of 12 drugs added to chuanbei pipa throat-clearing health food at different extraction volume

這些數(shù)據(jù)表明以藥食同源類中草藥為原料的清咽類保健食品，在用乙腈溶劑提取時(shí)，由于提取的基質(zhì)溶液比較復(fù)雜，不同藥物在不同的中草藥基質(zhì)提取液中呈現(xiàn)了不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，尤其地氯雷他定在六種清咽類保健食品中均呈現(xiàn)較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，但隨著提取溶液稀釋倍數(shù)的增加，基質(zhì)效應(yīng)逐漸消除，考慮到保健食品中非法添加藥物的量比較大，實(shí)驗(yàn)選擇提取溶液體積為50 mL，12 種藥物在六種清咽類保健食品中提取回收率均在75.15%～117.65%之間。

2.4 提取時(shí)間的選擇

按照1.2.2，實(shí)驗(yàn)考察了超聲提取時(shí)間為10、20、30 min 對(duì)樣品加標(biāo)回收率的影響，結(jié)果表明，草珊瑚與羅漢果糖清咽類保健食品中西替利嗪與氯雷他定在超聲時(shí)間為20 min 時(shí)，回收率達(dá)到最高，30 min 基本保持不變，其他四種清咽類保健食品中12 藥物的回收率隨超聲時(shí)間的改變無(wú)顯著性變化，所以實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取時(shí)間為20 min。

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

12 種藥物均采用ESI+，使用一級(jí)質(zhì)譜全掃描/數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)質(zhì)譜子離子掃描模式（Full MS/dd-MS2）對(duì)選定的質(zhì)量數(shù)（m/z100～550）進(jìn)行掃描，該模式能夠同時(shí)得到一級(jí)質(zhì)譜母離子精確質(zhì)量數(shù)和二級(jí)質(zhì)譜的子離子全掃描信息，盡管Q/Orbitrap 能提供不同的分辨率，考慮到定性和定量的準(zhǔn)確性，高分辨率可帶來(lái)更好的質(zhì)量精度，但同時(shí)也會(huì)降低相應(yīng)的靈敏度并減少采集的掃描點(diǎn)數(shù)，最終一級(jí)質(zhì)譜掃描采用分辨率R=70 000，保證得到準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)并作為定量分析；而二級(jí)質(zhì)譜掃描采用相對(duì)較低的分辨率R=17 500，保證高分辨掃描的同時(shí)加快掃描速度，利用碎片離子的質(zhì)譜圖和離子信息進(jìn)行定性。在此分辨率下，各化合物的靈敏度較好，且質(zhì)量偏差均小于1.45×10-6（見(jiàn)表1），理論質(zhì)量數(shù)與實(shí)測(cè)質(zhì)量數(shù)相對(duì)偏差越小，結(jié)果準(zhǔn)確度越高。12 種藥物二級(jí)質(zhì)譜掃描的碰撞能量設(shè)為30、50、70 eV，得到的二級(jí)質(zhì)譜圖是在3 種碰撞能量下的疊加，有效避免了采用單一碰撞能量導(dǎo)致的不同儀器間重現(xiàn)性差的情況。

2.6 線性方程與測(cè)定下限

Q/Orbitrap 可以通過(guò)全掃描并提取精確質(zhì)量數(shù)色譜圖完成定性定量測(cè)定，利用自動(dòng)觸發(fā)的二級(jí)質(zhì)譜采集完成準(zhǔn)確定性。實(shí)驗(yàn)按照1.2.2，配制12 種藥物濃度為1.00、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00、200.00 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以藥物的一級(jí)高分辨準(zhǔn)分子離子峰的色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（X，μg/L）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，12 種藥物在線性范圍1.00 μg/L～200.00 μg/L 內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999（見(jiàn)表2），可滿足檢測(cè)要求。

高分辨質(zhì)譜使用目標(biāo)物的精確質(zhì)量數(shù)提取，色譜圖基線噪音很低，信噪比往往無(wú)窮大，因此不采用以3倍信噪比（S/N）確定目標(biāo)物檢出限，10 倍信噪比確定目標(biāo)物定量限的方法。實(shí)驗(yàn)按照1.2.2，在六類清咽類保健食品空白基質(zhì)中逐級(jí)降低加標(biāo)濃度，以各目標(biāo)物在線性范圍中滿足回收率值在60%～120%區(qū)間內(nèi)的最低濃度為方法的測(cè)定下限，結(jié)果表明12 種藥物在六種清咽類保健食品中的測(cè)定下限為50.00 μg/kg～150.00 μg/kg（見(jiàn)表2）。

表2 12 種藥物的線性方程和在六種清咽類保健食品中的測(cè)定下限Table 2 Linear equation and lower limits of determination of 12 drugs in six throat-clearing health food

2.7 回收率與精密度

實(shí)驗(yàn)按照1.2.2，取六類清咽類保健食品的空白基質(zhì)樣品，分別添加250、2 500、5 000 μg/kg 三個(gè)濃度水平，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6 次，計(jì)算回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviations，RSDs），結(jié)果見(jiàn)表3，12 種藥物回收率在75.15%～117.65%之間，精密度為0.89%～4.84%，符合檢驗(yàn)檢測(cè)要求。

表3 12 種藥物在六種清咽類保健食品中的加標(biāo)回收率和精確度（n=6）Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 12 kinds of drugs in sixthroat-clearing health food (n=6)

續(xù)表3

2.8 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

實(shí)驗(yàn)按照1.2.2，分別對(duì)12 種藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，得到保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜的母離子精確質(zhì)量數(shù)、二級(jí)質(zhì)譜的子離子信息，導(dǎo)入Trace Finder軟件，建立12 種藥物的定性快速篩查數(shù)據(jù)庫(kù)。在不使用標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，如果樣品中的藥物一級(jí)母離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)和二級(jí)碎片離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)及同位素分布與數(shù)據(jù)庫(kù)里的藥物離子質(zhì)量數(shù)信息能夠匹配，則初步判定樣品為陽(yáng)性，可以進(jìn)一步用該藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液在同一色譜條件下考察保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行確證和定量分析，從而實(shí)現(xiàn)清咽類保健食品中12 種藥物的快速篩查定量檢測(cè)。

2.9 樣品測(cè)定

實(shí)驗(yàn)按照1.2.2，應(yīng)用所建立的快速篩查方法對(duì)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的105 批清咽類保健食品進(jìn)行監(jiān)測(cè)，每個(gè)樣品做2 個(gè)平行測(cè)定。經(jīng)與建立的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，篩查出一批次樣品中含麻黃堿和甲基麻黃堿成分；經(jīng)麻黃堿和甲基麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)一步定量計(jì)算，檢出值分別為30.79×103μg/kg 和0.31×103μg/kg。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用超高效液相色譜－四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)建立了清咽類保健食品中12 種藥物的快速篩查和定量分析方法。依靠一級(jí)母離子精確質(zhì)量數(shù)、二級(jí)碎片離子精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)的快速匹配，利用一級(jí)高分辨母離子峰進(jìn)行定量，該方法前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，適用于清咽類保健食品中添加藥物的快速篩查及定量檢測(cè)，為保健食品安全監(jiān)管工作提供了必要的技術(shù)支持。