孫世東,趙文紅
(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州 450000)
番茄紅素(Lycopene)是來(lái)源于植物性食物的一種類(lèi)胡蘿卜素,廣泛存在于番茄、番石榴和西瓜等植物果實(shí)中[1]。它是一種含有多不飽和鍵的異戊二烯類(lèi)化合物,這種特殊的結(jié)構(gòu)賦予了番茄紅素極強(qiáng)的抗氧化活性[2]。研究表明,番茄紅素具有高效猝滅單線態(tài)氧[3,4]、抗癌抑癌[5,6]、清除過(guò)氧自由基[7]、預(yù)防心血管疾病[8,9]、調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊[10]及增強(qiáng)免疫力[11]等多種生理功能。番茄紅素因易受光、氧和熱等因素的影響而產(chǎn)生降解損失[12-14],從而極大地限制了其工業(yè)化應(yīng)用。
淀粉為精制谷物的主要成分,其在人體中的消化吸收與健康密切相關(guān)[15]。淀粉攝入過(guò)多、消化過(guò)快會(huì)使血糖失衡,不利于人體健康[16]。所以亟需設(shè)計(jì)和推廣能夠減緩淀粉消化速率的食物,因此抗性淀粉[17]應(yīng)運(yùn)而生。已有文獻(xiàn)研究表明[18,19]淀粉-配體復(fù)合物的螺旋構(gòu)象可降低直鏈淀粉的水解速率,進(jìn)而能調(diào)控糖代謝相關(guān)疾病,具有抗消化性。且直鏈淀粉作為一種良好的壁材,在保護(hù)功能性分子方面已得到廣泛的應(yīng)用。Jeong 等[20]研發(fā)的白藜蘆醇環(huán)直鏈淀粉包合物能夠有效保持白藜蘆醇的抗氧化活性;周小理等[21]制備的苦蕎直鏈淀粉-黃酮復(fù)合物具有抗消化性。
通過(guò)制備復(fù)合制劑可以增強(qiáng)番茄紅素的穩(wěn)定性。Wang 等[22]制備了番茄紅素-β-環(huán)糊精包合物,發(fā)現(xiàn)在50 ℃下保持210 min,番茄紅素的熱降解顯著高于包合物;劉會(huì)曉等[23]制備了番茄紅素納米脂質(zhì)體,發(fā)現(xiàn)無(wú)氧避光儲(chǔ)藏30 d 后其中番茄紅素保留率為80%。此外,還有番茄紅素與淀粉類(lèi)、蛋白類(lèi)和脂類(lèi)等結(jié)合制成的復(fù)合物制劑[24-26]。本課題組為提升番茄紅素的儲(chǔ)藏和加工穩(wěn)定性,選用安全可食用的直鏈淀粉為原料,由于直鏈淀粉具有特殊的螺旋空腔結(jié)構(gòu),可通過(guò)外力作用(熱、溶劑、超高壓等處理)使其分子內(nèi)氫鍵發(fā)生作用,鏈狀結(jié)構(gòu)旋轉(zhuǎn),形成疏水性左手螺旋空腔[27],一些配體(如碘[28]、脂質(zhì)[29]和線性醇[30]等)可以通過(guò)此過(guò)程與直鏈淀粉復(fù)合并形成復(fù)合物。在前期研究中基于直鏈淀粉的回生特性制備了直鏈淀粉-番茄紅素復(fù)合物(Amylose-Lycopene Complexes,ALCs)[31],并對(duì)其結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行表征,但對(duì)該復(fù)合物的熱穩(wěn)定性尚不明晰。本文即通過(guò)環(huán)境溫度下ALCs 中番茄紅素的含量和抗氧化活性變化,分析比較環(huán)境溫度及時(shí)間對(duì)其保留率的影響,并進(jìn)一步研究了了其熱降解動(dòng)力學(xué)模型。通過(guò)研究ALCs 的熱穩(wěn)定性變化規(guī)律,為番茄紅素穩(wěn)定制劑的開(kāi)發(fā)及其加工應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
直鏈淀粉(土豆來(lái)源)、番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品,上海源葉生物科技有限公司;二甲基亞砜、丙酮、鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)36.5%)、氫氧化鈉,均為分析純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;氮?dú)猓w積分?jǐn)?shù)98%),鄭州新豐化學(xué)試劑有限公司;蒸餾水和ALCs 實(shí)驗(yàn)室自制。
UV1800-BPC 型紫外分光光度計(jì),上海美普達(dá)儀器設(shè)備有限公司;JXDC-10 型氮?dú)獯祾邇x,上海凈信科技儀器有限公司;YM-120 S 型超聲波儀,廣東潔盟電器有限公司;DZF-6050 型真空干燥箱,上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;MX-S 型渦旋振動(dòng)器、MS-H280-Pro 型磁力攪拌器,美國(guó)SCI LOGEX 公司。
1.3.1 直鏈淀粉-番茄紅素復(fù)合物的制備
參照Lv 等[32]的制備方法,并作修改。稱(chēng)取番茄紅素15 mg 溶于15 mL 二甲基亞砜中在50 ℃保溫備用;直鏈淀粉300 mg 用0.4 mL 無(wú)水乙醇分散,加30 mL蒸餾水溶解并于95 ℃水浴5 min 后降溫至50 ℃;加入番茄紅素溶液后以500 r/min 混合攪拌2 h,程序降溫至4 ℃后在1 500 r/min 離心30 min,真空干燥沉淀,即得直鏈淀粉-番茄紅素復(fù)合物(ALCs)。過(guò)程需避光、無(wú)氧氮?dú)獗Wo(hù)操作。
1.3.2 直鏈淀粉-番茄紅素復(fù)合物中番茄紅素的含量測(cè)定
采用番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品,建立其吸收-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行番茄紅素含量的計(jì)算。分別配置0、2.5、5.0、7.5、10.0 和15.0 μg/mL 的番茄紅素丙酮溶液,并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在447 nm 處的吸光度,經(jīng)線性擬合得番茄紅素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.156 5x-0.011 3(R2=0.999 9)。稱(chēng)取樣品5 mg 溶于10 mL 丙酮中,避光經(jīng)超聲萃取5 min 后以1 500 r/min 離心15 min,取上清液測(cè)定其在447 nm 的吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算其中的番茄紅素含量。
1.3.3 直鏈淀粉-番茄紅素復(fù)合物的熱穩(wěn)定性
稱(chēng)取一定量復(fù)合物樣品于若干試管中,分別置于50、70、90、110 和130 ℃下,每隔一定時(shí)間取樣5 mg。將取出的樣品置于試管中加入10 mL 丙酮,用混勻儀處理3 min,避光4 ℃超聲處理5 min,1 500 r/min 離心處理15 min,取上清液于比色皿中,使用紫外可見(jiàn)光譜儀測(cè)量其在447 nm 的吸光度值。根據(jù)吸光度值計(jì)算番茄紅素含量,繪出各溫度下直鏈淀粉-番茄紅素復(fù)合物中番茄紅素含量及保留率隨時(shí)間的變化圖,并進(jìn)行降解動(dòng)力學(xué)分析。
式中:
D——番茄紅素保留率,%;
C0——ALCs 中番茄紅素的初始含量,μg/mL;
Ct——不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的ALCs 中番茄紅素含量,μg/mL;
V0——ALCs 初始樣品萃取番茄紅素的丙酮體積,mL;
Vt——不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定ALCs 中番茄紅素時(shí)萃取的丙酮體積,mL。
1.3.4 直鏈淀粉-番茄紅素復(fù)合物DPPH 自由基清除率測(cè)定
抗氧化活性的評(píng)價(jià)參考Zhou 等[33]的方法,采用DPPH 清除法進(jìn)行測(cè)定。將ALCs 和番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品分別置于50、70、90、110 和130 ℃下,每隔一定時(shí)間取樣5 mg,經(jīng)10 mL 丙酮超聲浸提得到其中的番茄紅素;量取1 mL 浸提液加入到3 mL DPPH(0.01 mmol/L)溶液中,避光反應(yīng)30 min 后在517 nm 處測(cè)定吸光度。測(cè)定完成后計(jì)算復(fù)合物的DPPH清除率。計(jì)算公式如下:
式中:
E——DPPH 清除率,%;
A0——DPPH 溶液(DPPH 溶液:丙酮=3:1)的吸光度;
A1——無(wú)水乙醇與ALCs 丙酮溶液(3:1)的吸光度;
A2——反應(yīng)后DPPH溶液和ALCs 溶液的混合物的吸光度。
1.3.5 直鏈淀粉-番茄紅素復(fù)合物的熱降解動(dòng)力學(xué)
參考Aliyu 等[34]的測(cè)定方法,并稍作修改。對(duì)ALCs中番茄紅素的含量變化規(guī)律代入零級(jí)、一級(jí)和二級(jí)降解動(dòng)力學(xué)方程式擬合,以探究直鏈淀粉-番茄紅素復(fù)合物的熱降解動(dòng)力學(xué)特征。各級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式見(jiàn)以下公式(3)、(4)和(5)。
式中:
C0——ALCs 中番茄紅素的初始含量,μg/mL;
Ct——不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)番茄紅素的相對(duì)含量,μg/mL;
T——不同時(shí)間點(diǎn),h;
k——速率常數(shù),μg/(mL·h)。
經(jīng)降解動(dòng)力學(xué)擬合后根據(jù)以上公式計(jì)算其速率常數(shù)k,μg/(mL·h)、半衰期T1/2,h和十分之一衰期T9/10,h等熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
1.3.6 數(shù)據(jù)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 24 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,并采用Origin 2018 和Microsoft Excel 2019 作圖。各項(xiàng)指標(biāo)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組采用配對(duì)t檢驗(yàn),定性數(shù)據(jù)比較采用X2檢驗(yàn)。p<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
為了研究不同溫度環(huán)境下ALCs 的熱穩(wěn)定性,以番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照,研究ALCs 經(jīng)50、70、90、110和130 ℃處理后其番茄紅素含量及其保留率的變化。
2.1.1 復(fù)合對(duì)ALCs 穩(wěn)定性的影響
以番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照,研究直鏈淀粉與番茄紅素復(fù)合對(duì)其穩(wěn)定性的影響。不同溫度環(huán)境下ALCs和對(duì)照品中番茄紅素含量變化見(jiàn)圖1。
圖1 ALCs 和番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品在不同溫度環(huán)境下其番茄紅素含量的變化Fig.1 Changes of lycopene content in ALCs and lycopene standard at different temperature
與番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品相比,ALCs 在各溫度環(huán)境處理下有利于其番茄紅素穩(wěn)定性。如圖1 所示,在50 ℃處理4 h 時(shí),ALCs 中的番茄紅素含量為12.55 μg/mL,顯著高于對(duì)照組;在70 ℃處理5 h 時(shí)復(fù)合物和對(duì)照品中番茄紅素的含量分別為11.39 μg/mL 和10.11 μg/mL;在110 ℃處理6 h時(shí)其含量分別為9.43 μg/mL和7.92 μg/mL(p<0.05)。研究表明:與對(duì)照組相比,直鏈淀粉和番茄紅素的復(fù)合可對(duì)番茄紅素起到保護(hù)作用,改善長(zhǎng)時(shí)間熱處理對(duì)復(fù)合物中番茄紅素的影響,延緩其中番茄紅素的降解損失。這可能是由于復(fù)合物為直鏈淀粉與番茄紅素形成的包合型復(fù)合物有關(guān)。與番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品直接暴露在環(huán)境中不同,復(fù)合物中的番茄紅素可進(jìn)入到直鏈淀粉的疏水螺旋空腔中,或與直鏈淀粉分子鏈纏繞形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)[35-37],因此可保護(hù)其中的番茄紅素免受熱降解損失。且同一溫度下處理前期降解損失較后期快,是由于空間位阻的存在和番茄紅素碳鏈的長(zhǎng)度,使得一部分番茄紅素被截留在分子間螺旋結(jié)構(gòu)縫隙中,一部分進(jìn)入到分子內(nèi)螺旋腔。番茄紅素不能完全進(jìn)入到直鏈淀粉的螺旋空腔中,而暴露在環(huán)境中的部分番茄紅素直接降解,使得前期降解速率較快。孫新虎等[38]制備的番茄紅素β-環(huán)糊精包合物對(duì)番茄紅素穩(wěn)定性起到有效的改善作用。全莉嬋等[39]研發(fā)了水分散型番茄紅素微乳,發(fā)現(xiàn)溫度與番茄紅素穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)。
2.1.2 熱處理溫度和時(shí)間對(duì)ALCs 番茄紅素穩(wěn)定性的影響
依照1.3.3 項(xiàng)下公式(1)計(jì)算得到ALCs 中番茄紅素保留率,研究處理溫度和時(shí)間對(duì)ALCs 番茄紅素穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖2。
圖2 ALCs 不同處理時(shí)間下其番茄紅素保留率的變化Fig.2 Changes of lycopene retention rate of ALCs under different treatment times
由圖2 可知,各溫度環(huán)境下,隨處理時(shí)間延長(zhǎng),ALCs 的番茄紅素保留率均呈下降趨勢(shì)。樣品處理3 h后ALCs 中番茄紅素保留率分別為87.83%(50 ℃)、86.03%(70 ℃)和75.49%(90 ℃);繼續(xù)處理12 h 時(shí),其番茄紅素保留率分別顯著降低至80.89%(50 ℃)、70.86%(70 ℃)和58.34%(90 ℃)(p<0.05)。結(jié)果表明:復(fù)合物的受熱時(shí)間越長(zhǎng)、熱處理溫度越高,穩(wěn)定性越低,番茄紅素含量損失加劇。朱軍敏[40]將番茄紅素微囊在40 ℃儲(chǔ)存30 d,其番茄紅素殘存率明顯高于在60 ℃下的儲(chǔ)存,其研究表明環(huán)境溫度影響番茄紅素制劑的熱穩(wěn)定性。Baenas 等[41]將番茄汁在96 ℃下處理30 s 后番茄紅素活性降低了60%,與本研究結(jié)果相符。
值得注意的是,在本研究的中高溫度(90 ℃和110 ℃)條件下,ALCs 中番茄紅素含量呈先升高后降低趨勢(shì)。其中,在90 ℃處理5 h 時(shí),其中番茄紅素含量異常上升至12.79 μg/mL(p<0.05),繼續(xù)處理其含量均呈持續(xù)下降。Sun 等[42]研究認(rèn)為順式構(gòu)型的番茄紅素與反式構(gòu)型相比,其溶液吸光度升高。因此,高溫(90 ℃和110 ℃)處理?xiàng)l件下,番茄紅素受熱后吸收強(qiáng)度增強(qiáng)的現(xiàn)象可能與其構(gòu)型轉(zhuǎn)變有關(guān)[43],吸收強(qiáng)度為假性增加。本研究進(jìn)一步對(duì)此樣品進(jìn)行紫外可見(jiàn)光譜全掃描(圖3b)可見(jiàn):與番茄紅素對(duì)照品(圖3a)相比,高溫(90 ℃和110 ℃)處理?xiàng)l件下復(fù)合物中的番茄紅素分別在364 nm 和310 nm 處出現(xiàn)了新的吸收峰。該處為番茄紅素順式峰的吸收位置[12]。結(jié)果表明:復(fù)合物和標(biāo)準(zhǔn)品中番茄紅素在中高溫度環(huán)境(90 ℃和110 ℃)下會(huì)發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)變和降解損失。
圖3 番茄紅素(a)和經(jīng)中高溫(90 ℃和110 ℃)處理的ALCs中番茄紅素(b)紫外可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描光譜圖Fig.3 UV-Vis full wavelength scanning spectra of lycopene (a)and lycopene in ALCs treated with medium and high temperatures (90 ℃ and 110 ℃) (b)
為了研究熱處理對(duì)ALCs 抗氧化特性的影響,測(cè)定ALCs 在50、70、90、110 和130 ℃條件下的抗氧化活性變化,結(jié)果見(jiàn)圖4。
由圖4 可知,在不同熱處理?xiàng)l件下,ALCs 和番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品的DPPH自由基清除率整體均呈下降趨勢(shì),且表現(xiàn)出比對(duì)照組強(qiáng)的抗氧化活性。經(jīng)過(guò)不同熱處理,ALCs和對(duì)照組番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品的DPPH自由基清除率從最初的49.35%(0 h)分別顯著降至41.63%和35.57%(50 ℃,12 h)、18.93%和14.42%(70 ℃,12 h)、25.24%和4.81%(90 ℃,10 h)、23.73%和4.06%(110 ℃,10 h)、25.16%和3.55%(130 ℃,6 h)(p<0.05)。結(jié)果表明,在不同熱處理?xiàng)l件下ALCs 表現(xiàn)出更強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力,即ALCs 能更好地保持番茄紅素的抗氧化活性。這可能與儲(chǔ)藏過(guò)程中復(fù)合物對(duì)番茄紅素的保留有關(guān)。柴星星等[44]發(fā)現(xiàn)番茄紅素納米分散體的抗氧化活性與其番茄紅素含量相關(guān)。究其原因,直鏈淀粉是淀粉分子中的線性組分,具有特殊的螺旋結(jié)構(gòu),在施加外力(熱處理、溶劑處理、超高壓等)的作用下,其分子內(nèi)氫鍵相互作用、鏈狀結(jié)構(gòu)旋轉(zhuǎn),形成了疏水性的左手螺旋空腔結(jié)構(gòu),這時(shí)番茄紅素便可借助疏水作用力進(jìn)入直鏈淀粉螺旋空腔與其復(fù)合[45,46],進(jìn)而達(dá)到對(duì)番茄紅素有效的保護(hù)作用。
圖4 不同熱處理?xiàng)l件下ALCs 的抗氧化特性Fig.4 Antioxidant properties of ALCs under different heat treatment conditions
在90 ℃和110 ℃條件下,ALCs 的抗氧化活性在處理期間出現(xiàn)了先升高后降低的趨勢(shì),這可能是由于番茄紅素在高溫下構(gòu)型發(fā)生了轉(zhuǎn)變[47],且順式構(gòu)型的番茄紅素抗氧化活性更強(qiáng)[48]。但所有熱處理?xiàng)l件下ALCs 的抗氧化活性均存在降低現(xiàn)象,這與ALCs 中的番茄紅素?zé)峤到庥嘘P(guān)[30]。綜上,番茄紅素與直鏈淀粉復(fù)合形成ALCs 后,能更好保持其抗氧化活性。
為了研究不同溫度環(huán)境條件下ALCs 中番茄紅素的熱降解變化,參照1.3.5 項(xiàng)下方法進(jìn)行零級(jí)、一級(jí)和二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程擬合,并計(jì)算其動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
ALCs 在不同溫度環(huán)境條件下,其番茄紅素的降解動(dòng)力學(xué)擬合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程和回歸系數(shù)R2見(jiàn)表1。比較不同溫度下最大擬合R2值可知,在ALCs 中番茄紅素在不同溫度環(huán)境條件下的降解均符合二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征。
表1 不同溫度環(huán)境條件下ALCs 中番茄紅素的降解動(dòng)力學(xué)線性回歸方程和系數(shù)R2Table 1 Linear regression equations and coefficients R2 for the degradation kinetics of lycopene in ALCs under different environmental conditions of temperature
基于二級(jí)反應(yīng)擬合方程1/Ct-1/C0=kt+b,不同溫度環(huán)境下ALCs 的降解反應(yīng)擬合見(jiàn)圖5。根據(jù)公式分別得出其速率常數(shù)k(μg/(mL·h))、半衰期T1/2(h)和十分之一衰期T9/10(h)等動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。由圖可見(jiàn):不同溫度下ALCs 降解動(dòng)力學(xué)常數(shù)的排序?yàn)閗130>k110>k90>k70>k50,k110值為0.009 2,遠(yuǎn)大于90 ℃時(shí)的0.003 4 及50 ℃時(shí)的0.001 1,結(jié)果表明隨溫度升高,ALCs 中番茄紅素的降解程度增大,110 ℃以上高溫加工環(huán)境加劇其中的番茄紅素降解變化;由表2 可知,隨溫度環(huán)境升高ALCs 中番茄紅素的半衰期呈降低趨勢(shì)。50 ℃處理?xiàng)l件下ALCs 的番茄紅素T9/10為9.58 h,至110 ℃時(shí)T9/10縮短至1.15 h。結(jié)果表明:隨溫度升高,ALCs 中番茄紅素的熱降解反應(yīng)越快。
圖5 不同溫度環(huán)境下ALCs 的二級(jí)降解動(dòng)力學(xué)擬合圖Fig.5 Kinetic fitting of secondary degradation of ALCs under different temperature environments
表2 不同熱處理?xiàng)l件下ALCs 的熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of thermal degradation of ALCs under different heat treatment conditions
本研究表明制劑ALCs 能改善其中番茄紅素的熱穩(wěn)定性。在不同溫度處理下,ALCs 中的番茄紅素含量均顯著高于標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照組。處理溫度和時(shí)間均影響ALCs 中番茄紅素的穩(wěn)定性。不同溫度處理后,ALCs中番茄紅素的保留率和抗氧化活性均有一定程度的下降。值得注意的,由于順式構(gòu)型出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致溶液吸光度上升,呈現(xiàn)含量增多的假性現(xiàn)象。本研究中在中高溫度下即觀察到番茄紅素基于構(gòu)型轉(zhuǎn)變出現(xiàn)的番茄紅素含量增加變化,并通過(guò)可見(jiàn)吸收分光光譜分析進(jìn)行了初步驗(yàn)證,但這一方面尚需進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析與確證。此外,對(duì) ALCs 中番茄紅素?zé)峤到庑袨榈难芯靠梢?jiàn)符合二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征。番茄紅素降解速率常數(shù)k與處理溫度t呈正相關(guān),k130>k110>k90>k70>k50;其衰期T1/2和T9/10均與處理溫度t呈負(fù)相關(guān),且110 ℃以上高溫加工環(huán)境加劇其中的番茄紅素降解變化,50 ℃時(shí)的T9/10為9.58 h 縮短至110 ℃時(shí)的1.15 h。結(jié)果表明:應(yīng)用ALCs 制劑進(jìn)行產(chǎn)品開(kāi)發(fā)時(shí),加工溫度過(guò)高會(huì)造成其熱降解反應(yīng)加快,加劇降解損失。本研究探究不同處理時(shí)間和溫度對(duì)ALCs 中番茄紅素?zé)岱€(wěn)定性的影響,為番茄紅素的加工應(yīng)用提供理論依據(jù)。