陳小琴，母應春，蘇偉，姜麗，趙馳

（貴州大學釀酒與食品工程學院 貴陽 550025）

酒曲是中國白酒釀造的糖化、發(fā)酵和生香劑，含多種微生物和風味物質(zhì)，對酒的產(chǎn)率和品質(zhì)有重要影響，有“曲是酒之骨”之稱[1]。鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）具有獨特藥用價值，含石斛多糖、生物堿等多種活性成分，具有抗癌、降血糖、增強免疫力等功效[2]。制作酒曲時添加藥食同源物質(zhì)能抑制雜菌生長，促進有益微生物繁殖，還能豐富產(chǎn)品風味[3]。吳志等[4]在制曲時添加3%的石菖蒲、生地黃和白術(shù)等醇提液，提高了曲發(fā)酵力和糖化力。禹曉婷等[5]添加12 味藥食同源物質(zhì)入曲，發(fā)現(xiàn)新基質(zhì)曲糖化力和液化力是傳統(tǒng)曲的1.3 倍和2.8 倍。目前，還未見將石斛莖作為小曲發(fā)酵基質(zhì)的研究報道。

近年來，高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing，HTS）在酒曲中廣泛應用，增強了人們對酒曲微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的了解[6]。同時，常結(jié)合代謝組學技術(shù)研究食品中揮發(fā)性風味物質(zhì)（volatile flavor components，VFCs）。如Zhao 等[7]采用宏基因組學和GC-TOF-MS 研究了貴州3 種小曲微生物群落和風味物質(zhì)，結(jié)果顯示乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、曲霉屬（Aspergillus）、釀酒酵母屬（Saccharomyces）等為小曲中優(yōu)勢菌屬，并篩選出39 種顯著差異代謝物。Tang 等[8]利用Illumina MiSeq 平臺和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS），檢測4 種小曲微生物群落和VCFs，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏氏細菌屬（Weissella）、根霉菌屬（Rhizopus）和念珠菌屬（Candida）為優(yōu)勢菌屬，同時鑒定出68 種顯著差異的VCFs。目前還沒有關(guān)于石斛小曲品質(zhì)的研究報道。

本研究以傳統(tǒng)小曲和石斛小曲為研究對象，采用HTS 和頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Headspace Solid Phase Microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS）分析石斛添加量對小曲微生物群落、揮發(fā)性風味物質(zhì)及理化特性的影響，為石斛小曲工藝優(yōu)化和生產(chǎn)應用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

石斛小曲原料為市售鐵皮石斛莖，產(chǎn)自貴州；種曲為根霉菌Q303，貴州輕工研究所；傳統(tǒng)小曲未添加石斛，編號為DZ；石斛小曲按石斛添加量30%，40%和50%分別編號為A，B 和C。

Power Soil DNA 提取試劑盒，美國MP Bio公司；2%瓊脂糖凝膠，西班牙Biowest 公司；DNA聚合酶，大連寶生物工程有限公司；正、反引物，深圳市英俊生物技術(shù)有限公司；MinElute PCR 純化試劑盒，德國Qiagen 公司；正構(gòu)烷烴（色譜純），美國Sigma 公司；環(huán)己酮（>99.5%，GC），上海阿拉丁生物科技股份有限公司。

1.2 儀器

ABI VeritiTM99012PCR 儀，美國ABI 公司；Gel Doc 2000 型凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；Illumina Hiseq 測序儀，美國Illumina 公司；GCMS TSQ8000 與TRACE1300 氣-質(zhì)譜聯(lián)用，美國賽默飛世爾科技公司；50/30 μm/CAR/PDMS/DVB萃取頭，美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備與采集 參照禹曉婷等[5]的方法并稍作修改制備小曲。所有樣品裝入無菌袋中，密封，置于-80 ℃超低溫冰箱，用于理化特性、VFCs和微生物檢測。

工藝流程：

1.3.2 理化指標檢測 小曲水分、酸度、液化力、糖化力、發(fā)酵力和酯化力等檢測參考文獻[9]。

1.3.3 揮發(fā)性風味檢測

1.3.3.1 GC-MS 條件 進樣口溫度：240°C；升溫程序：40 °C（5 min），5 °C/min 上升到150 °C（3 min），最后以5°C/min 上升到240°C（5 min）。以高純氦氣（99.999%）為載氣，載氣流速1.00 mL/min，不分流進樣。

質(zhì)譜條件：EI 離子源，離子源溫度250°C，電離電壓70 eV，傳輸線溫度240°C，色譜掃描范圍35～550 amu。

1.3.3.2 定性及定量方法 與質(zhì)譜NIST 光譜數(shù)據(jù)庫比對并鑒定，僅保留正、反匹配度大于700 的化合物。通過內(nèi)標法計算得到各揮發(fā)性組分的質(zhì)量濃度。計算公式如下：

式中：Ci——待測揮發(fā)性組分質(zhì)量濃度，μg/kg；Cis——內(nèi)標質(zhì)量濃度，μg/mL；Ai——待測揮發(fā)性組分的色譜峰面積，mAU·min；Ais——內(nèi)標的色譜峰面積，mAU·min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS Statistics 26.0 軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)；SIMCA14.1 軟件繪制用于正交偏最小二乘判別得分圖，Origin 2018 軟件用于繪制微生物群落組成圖和主成分分析圖、層級聚類圖，R 語言軟件用于繪制VFCs 熱圖、微生物與VFCs 相關(guān)性熱圖，Canoco 5 軟件繪制冗余分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小曲理化性質(zhì)

由表1 可知，4 種小曲水分含量在11.42%～12.52%之間，差異不顯著（P>0.05），均小于國家標準的13%，利于長期儲存[10]。添加30%石斛莖時，糖化力、液化力和發(fā)酵力最大值分別為（122.40±0.61），（51.87±8.67）U/g 和（13.97±2.00）g/100 g；然而，酯化力在40%添加量時最大值（169.38 ±6.71）mg/g。糖化力和發(fā)酵力分別反映微生物將原料中的淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖的能力及將其轉(zhuǎn)化成乙醇的能力[11-12]；酯化力與白酒發(fā)酵過程中酯類物質(zhì)的形成密切相關(guān)[13]。此外，酸度是評價酒曲成熟度的一個重要指標[14]，且隨石斛添加量的增加而增大，在添加量為50%時最大值（0.82±0.03）mmol/10 g。綜上所述，較DZ 而言，添加30%石斛莖時小曲的理化品質(zhì)最佳。

表1 小曲樣品理化性質(zhì)分析Table 1 Analysis of physicochemical propertie in Xiaoqu sanples

2.2 揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

從4 種小曲中共鑒定出41 種可靠揮發(fā)性組分，主要為醇類12 種、酚類7 種、烴類6 種、醛酮類6 種、酸類3 種、酯類3 種和其它類4 種（表2）。其中，從A、B、C 和DZ 分別檢測出24，29，21種和7 種。醇類和酚類是構(gòu)成A、B、C 和DZ 中風味特征的重要物質(zhì)，其在A、B 和C 中的組成和含量明顯高于DZ。此外，烴類和其它類僅存在于A、B 和C 中，并隨石斛莖添加量的增加而增加，這可能來自石斛原料[15]。由此可見，在小曲制備中添加石后，提高了VFCs 組成及含量。當添加量為40%時，小曲VFCs 種類及含量均為最大值。

表2 小曲揮發(fā)性風味物質(zhì)分析Table 2 Analysis of volatile flavor compounds in Xiaoqu samples

（續(xù)表2）

為更好地說明樣品小曲間VFCs 含量的差異，利用正交偏最小二乘判別法（Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA）進行分析。如圖1a 所示，R2X 為0.675，Q2Y 為0.93，說明該模型在分析樣品時不存在異常值[16]。4種小曲分別位于不同象限，表明各樣品間VFCs 存在差異。此外，基于VIP ＞1.0 和P ＜0.05，共篩選出16 種顯著差異代謝物（Important Significantly Different Metabolites，ISDMs），對其熱圖統(tǒng)計分析。如圖1b 所示，A、B 和C 的風味特征仍明顯優(yōu)于DZ。A、B 和C 中的ISDMs 以醇類、醛酮類和酚類為主，如芳樟醇、正己醇、苯甲醇、苯乙醇、苯甲醛、壬醛、愈創(chuàng)木酚等，而DZ 中主要為苯乙醇。這是因為鐵皮石斛莖中多糖、苯丙氨酸等可在微生物作用下產(chǎn)生醇類和醛酮類物質(zhì)[17]。芳樟醇呈現(xiàn)鈴蘭香氣和木香，有鎮(zhèn)痛、抗炎癥的功效[18]；苯乙醇呈現(xiàn)玫瑰花香味和桃子果香味，是大曲VFCs 中優(yōu)勢醇類[19]；苯甲醛具有杏仁和焦糖氣味[20]；壬醛稀釋時散發(fā)玫瑰和橘子的香氣[21]；正己醇有青草香氣和樹葉氣味，能影響白酒香氣[22]；松油烯呈現(xiàn)柑橘香和木香，可用于調(diào)配檸檬和薄荷香精[23]；愈創(chuàng)木酚有木香及香莢蘭的隱香，被證實為白酒中重要揮發(fā)性組分[24]。同時，4 個小曲聚類為兩大支，A和B 聚為一類，C 和DZ 聚為另一類。這與OPLS-DA 得分圖在t1 上的結(jié)果一致。

圖1 小曲樣品揮發(fā)性物質(zhì)的OPLS-DA 得分圖（a）和重要顯著差異物質(zhì)的聚類熱圖（b）分析Fig.1 Opls-da score chart of VFCs（a）and hierarchical clustering heat map of ISDMs（b）in Xiaoqu samples

2.3 樣品中細菌的分析

2.3.1 細菌α-多樣性 分析 A、B、C 和DZ 在97%相似度水平下進行聚類，共獲得OTUs 平均數(shù)分別為214，393，582 和339（表3）。由表3 可知，覆蓋率在98.44%～99.81%間，表明未被檢出序列的概率較小[25]。本研究測序結(jié)果能真實反映小曲樣品中細菌微生物真實情況。此外，Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)被用來描述物種豐度和多樣性。C 的Chao1 和Shannon 指數(shù)最大（619.12 和7.87），而A的Chao1 和Shannon 指數(shù)最?。?41.88 和0.40）。添加50%石斛莖時，小曲細菌群落組成和結(jié)構(gòu)最復雜。

表3 小曲細菌微生物α-多樣性分析Table 3 α-Diversity index of bacterial microorganism in Xiaoqu

2.3.2 細菌群落結(jié)構(gòu)分析 在門水平上，從4 個小曲中共檢測到22 個細菌門，圖2a 顯示豐度前10 的物種，其余物種合并為其它。A 和B 以厚壁菌門（Firmicutes）為絕對優(yōu)勢細菌門，分別占比96.96%和75.40%。此外，B 中變形菌門（Proteobacteria，13.59%）同樣占優(yōu)勢。C 以厚壁菌門（32.36%）、變形菌門（26.13%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，23.98%）為優(yōu)勢細菌門。同時，B 和C 中還含有少量酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）。DZ 以厚壁菌門（12.91%）、變形菌門（29.99%）、酸桿菌門（16.47%）和藍細菌門（Cyanobacteria，12.63%）為優(yōu)勢細菌門。據(jù)報道，厚壁菌門、變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門是小曲中主要優(yōu)勢細菌門[26-28]。A、B 和C 中厚壁菌門與擬桿菌門含量比DZ 中高，可能是石斛多糖促進其生長，這與張俊楠等[29]研究結(jié)果相似。

圖2 小曲在細菌門水平（a）和屬水平（b）的群落組成Fig.2 Community composition of Xiaoqu at phylum level（a）and genus level（b）

在屬水平上，共檢測到342 個細菌屬。圖2b顯示豐度前10 的物種，其余物種歸類為其它。如圖2b 所示，A、B 和C 與DZ 細菌群落存在較大差異，且無規(guī)律可言。芽孢桿菌屬（Bacillus）是A（96.13%）和B（71.89%）中的優(yōu)勢細菌屬。C 以2.75%的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、5.26%的uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、5.15%的葡萄球菌屬（Staphylococcus）和4.05%的uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae 為優(yōu)勢細菌屬。DZ 以uncultured_bacterium_o_Chloroplast、uncultured_ bacterium_f_Mitochondria、乳酸桿菌和uncultured_bacterium_k_Bacteria 為優(yōu)勢細菌屬，分別占比12.63%，12.04%，5.51%和7.83%。

uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae 屬于擬桿菌門細菌，于2002 年首次被發(fā)現(xiàn)，可產(chǎn)生維生素B12，能治療惡性貧血癥[31]。uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae 和uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae 分別屬于擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門，其為水稻秸稈和糖漿廢水共發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸優(yōu)勢菌門[32]。芽孢桿菌屬在A 和B 中占優(yōu)勢，是因為石斛能促進其繁殖[33]。芽孢桿菌屬通過分泌蛋白酶和淀粉酶賦予小曲糖化力、液化力和發(fā)酵力[34]，并與吡嗪類、酯類、醇類和有機酸類物質(zhì)密切相關(guān)[35]。乳酸桿菌屬能產(chǎn)生豐富有機酸，還能產(chǎn)生細菌素抑制致病菌[36]。由此可見，當添加30%石斛時，小曲有益細菌比例最高，添加量為50%時不利于有益細菌繁殖。

2.4 樣品中真菌的分析

2.4.1 真菌α-多樣性分析 由表4 可知，基于97%相似度，分別獲得OTUs 數(shù)為80（A）、444（B）、510（C）、121（DZ）。覆蓋率均大于99.0%，表明測序結(jié)果基本反映樣品小曲中真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性。C 的Chao1 和Shannon 指數(shù)最大（577.80 和5.83），而DZ 的Chao1 和Shannon 指數(shù)最?。?40.88 和1.24）。這表明C 的真菌群落豐富度和多樣性最高，DZ 最低，即添加50%石斛莖時，小曲真菌群落組成及結(jié)構(gòu)最復雜。

表4 小曲真菌微生物α-多樣性分析Table 4 α-Diversity index of fungus microorganism in Xiaoqu

2.4.2 真菌群落結(jié)構(gòu)分析 在門水平上，共檢出7 個真菌物種。如圖3a 所示，A、B、C、DZ 優(yōu)勢真菌門均為子囊菌門（Acomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota），分別占比54.53%、46.56%、50.27%、82.42%和42.92%、47.25%、33.38%、17.45%。據(jù)報道，子囊菌門和毛霉菌門在不同酒曲中占主導[37-38]。值得注意的是擔子菌門（Basidiomycota）僅存在于A、B 和C 中，且與石斛莖添加量呈正比關(guān)系。毛霉菌門和擔子菌門在A、B 和C 中明顯增加，說明石斛莖中某些活性成分能促進毛霉菌門與擔子菌門生長。

圖3 小曲在門水平（a）和屬水平（b）真菌群落組成Fig.3 The fungus composition of Xiaoqu at phylum level（a）and genus level（b）

在屬水平上，共檢測到226 個真菌屬。圖3b顯示相對豐度前10 的物種，其余物種分別歸類為其它和未分類。DZ 與A、B 和C 間真菌群落存在差異，同時，A、B 和C 間也存在差異。A 中優(yōu)勢真菌屬為根霉菌屬（Rhizopus，42.89%）、曲霉菌屬（Aspergillus，26.97%）和威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces，22.59%）。B 中優(yōu)勢真菌屬為根霉菌屬（47.25%）和威克漢姆酵母屬（24.06%）；C 中優(yōu)勢真菌屬為根霉菌屬（33.37%）。同時，A、B 和C 中還有少量釀酒酵母屬（Saccharomyces）、棒孢酵母屬（Clavispora）、古根菌屬（Archaeorhizomyces）和鐮刀菌屬（Fusarium）。DZ 中真菌物種組成較為簡單，優(yōu)勢真菌屬為根霉菌屬（17.42%）和曲霉菌屬（81.60%）。

研究表明，石斛能促進根霉菌屬和釀酒酵母屬繁殖，相反抑制曲霉菌屬生長[38-39]，這解釋了為何石斛小曲中根霉菌屬和釀酒酵母屬增多，而曲霉菌屬明顯減少的變化趨勢。根霉菌屬和曲霉菌屬作為小曲中核心真菌屬，能產(chǎn)生多種水解酶，用于淀粉糖化和蛋白質(zhì)水解生成還原糖及氨基酸[40-41]，且曲霉屬與吡嗪類、酯類和芳香族化合物的形成有密切聯(lián)系[33]。威克漢姆酵母屬是常見的非釀酒酵母，能促進酚類及芳香類物質(zhì)形成[42]。釀酒酵母屬是乙醇的主要生產(chǎn)者，同時也能產(chǎn)生酯類和高級醇[43]。古根菌屬、鐮刀菌屬、芽枝霉屬和被孢霉屬主要存在于A、B 和C 中，且與石斛莖添加量存在正比關(guān)系，因此推測其來自石斛原料。鐮刀菌屬與芽孢桿菌屬存在拮抗作用[44]，因此C 中芽孢菌屬含量較少。綜上，當添加30%石斛莖時，小曲中有益真菌種類及含量最大，利于發(fā)酵；相反，添加50%石斛莖時不利于有益真菌生長，這與細菌群落結(jié)構(gòu)分析一致。

2.5 小曲群落相似性聚類分析

為更好地說明樣品小曲中微生物群落的差異，分別對細菌和真菌組成進行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）及層級聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）。如圖4a 所示，PC1 和PC2 對細菌群落差異的貢獻率之和高達94.2%，能較好地反映樣品小曲間細菌群落差異。A 和B 與C 和DZ 分別位于主坐標軸左、右兩側(cè)，說明A 和B 與C 和DZ 之間差異較大。圖4b顯示，4 個小曲聚兩大支，A 和B 聚為一類，C 和DZ 聚為另一類，這與PCA 結(jié)果一致。如圖4c 所示，PC1 和PC2 對真菌群落差異貢獻率之和高達97.4%。A、B 和C 與DZ 分別位于主坐標軸左、右兩側(cè)，表明A、B 和C 與DZ 間差異較大。圖4d 顯示，A、B 和C 聚為一類，DZ 聚為另一類，這與PCA結(jié)果一致。

圖4 小曲細菌群落主成分（a）和層級聚類（b），真菌群落主成分（c）和層級聚類（d）分析圖Fig.4 PCA（a）and HCA（b）of bacterial community，PCA（c）and HCA（d）of fungal community in Xiaoqu samples

2.6 關(guān)聯(lián)性分析

2.6.1 小曲微生物與理化性質(zhì)的冗余分析 冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）分析了小曲微生物與理化性質(zhì)間的相關(guān)性。如圖5a 所示，芽孢桿菌屬與發(fā)酵力、糖化力、液化力及酯化力呈正相關(guān)，A 和B 細菌群落結(jié)構(gòu)相似，因此與這4 個理化指標相關(guān)性高。葡萄球菌屬和乳酸桿菌屬與酸度呈正相關(guān)，酸度主要與小曲C 有較高相關(guān)性；葡萄球菌屬在白酒生產(chǎn)中起何作用至今未見報道，但葡萄球菌屬中的腐生葡萄球菌屬可通過產(chǎn)生酸性蛋白酶降低環(huán)境酸度[45-46]。如圖5b 所示，根霉菌屬、威克漢姆酵母和曲霉菌與液化力、發(fā)酵力、糖化力和酯化力呈正相關(guān)，其中A 和B 與液化酶活力、糖化酶活力、發(fā)酵力和酯化力相關(guān)性較高。鐮刀菌屬、紅菇屬、古根菌屬、芽枝霉屬、被孢霉屬和棒孢酵母屬則與酸度呈較強正相關(guān)，C 與酸度相關(guān)性最高。綜上所述，真菌對小曲理化特性形成的影響較大。

2.6.2 小曲微生物與揮發(fā)性組分相關(guān)性分析 基于Spearman 算法分別剖析細菌和真菌在屬水平前10 的物種與16 種ISDMs 間的相關(guān)性，借助R語言軟件進行熱圖可視化分析。如圖6a 所示，芽孢桿菌屬與環(huán)己醇、苯甲醇、正己醇、4-叔丁基苯酚和正己醛呈顯著正相關(guān)，這與Azokpota 等[47]研究一致。葡萄球菌屬與松油烯和芳樟醇呈顯著正相關(guān)。如圖6b 所示，根霉菌屬和威克漢姆酵母屬與醛酮類、醇類和酚類物質(zhì)呈正相關(guān)，如環(huán)己醇、苯甲醇、正己醇、1-十一醇和愈創(chuàng)木酚等，這與Chen 等[48]和劉曉柱等[49]的研究結(jié)果一致。釀酒酵母菌屬與1-十一醇、壬醛、芳樟醇、松油烯、苯甲醛和苯并噻唑呈正相關(guān)；釀酒酵母屬在白酒釀造過程中的主要作用是產(chǎn)生醇類物質(zhì)，同時也與醛類物質(zhì)的形成有關(guān)[50]。苯并噻唑、1-十一醇、壬醛、芳樟醇、松油烯、3-甲基-2-庚醇和苯甲醛與紅菇菌屬、棒孢酵母菌、古根菌屬、鐮刀菌屬、芽枝霉屬和被孢霉屬呈正相關(guān)。根據(jù)重要顯著差異揮發(fā)性風味熱圖（圖2b）和真菌群落組成圖（圖5b）可知，芳樟醇、松油烯等7 種風味組分和古根菌屬、鐮刀菌屬等6 個真菌屬在A、B 和C 中含量較高，推測其與石斛原料存在密切關(guān)聯(lián)，而彼此間具體聯(lián)系還需進一步研究。

圖5 細菌（a）和真菌（b）群落與環(huán)境因子的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of bacterial（a）and fungal（b）community and environmental factors

圖6 細菌（a）和真菌（b）群落與重要顯著差異風味物質(zhì)相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between bacterial（a）and fungal（b）communities and important significantly different metabolites

3 結(jié)論

采用高通量測序技術(shù)結(jié)合HS-SPME/GC-MS分析石斛添加量對小曲微生物群落、理化特性和揮發(fā)性風味物質(zhì)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：DZ 優(yōu)勢細菌屬 為 uncultured_bacterium_o_Chloroplast、uncultured_bacterium_f_Mitochondria 和乳酸桿菌屬，優(yōu)勢真菌屬為根霉菌屬和曲霉菌屬。A、B 和C 中優(yōu)勢細菌屬為芽孢桿菌，優(yōu)勢真菌屬存在差異，主要為根霉菌屬、曲霉菌屬和威克漢姆酵母屬。添加石斛莖增大了小曲中芽孢桿菌和根霉菌等有益微生物含量。當添加量為30%時，小曲有益細菌和真菌物種占比最大。與DZ 相比，石斛莖明顯增加了烴類、醇類、酚類和醛酮類化合物的種類和含量。小曲樣品不同理化特性間存在差異，添加30%石斛莖時提高了小曲糖化力、液化力、發(fā)酵力和酯化力等。相關(guān)性分析顯示，芽孢桿菌屬、根霉菌屬和威克漢姆酵母屬與糖化力、液化力、發(fā)酵力和酯化力，醇類、酚類和醛酮類物質(zhì)呈正相關(guān)。綜上，最終確定添加30%石斛莖時小曲品質(zhì)最好。同時要注意制曲過程的衛(wèi)生狀況，降低不可培養(yǎng)的細菌含量。