王艷美，劉永樂，鄧凱，瑪依熱·奧斯曼，馬夏吟

（長沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 長沙 410114）

副干酪乳桿菌屬于干酪乳桿菌群，是一種在人類和動物腸道內(nèi)常見的革蘭氏陽性益生菌，被廣泛用于乳制品發(fā)酵中，在干酪發(fā)酵過程中對風(fēng)味的形成起關(guān)鍵性作用[1]。此外，副干酪乳桿菌具有增強(qiáng)人體免疫力，維持腸道微生態(tài)平衡等諸多益生特性[2]。然而，益生乳酸菌在進(jìn)入人體消化道后會遇到各種各樣的環(huán)境脅迫，如胃酸、胰消化酶及腸道中的膽鹽等[3]，此時益生菌存活率顯著降低。副干酪乳桿菌隨發(fā)酵食品進(jìn)入人體內(nèi)并最終定植于腸道系統(tǒng)，能否耐受一定程度的膽鹽脅迫是其發(fā)揮益生作用的關(guān)鍵。

膽鹽是膽酸形成的不同鈉鹽或鉀鹽的混合物，首先由膽固醇經(jīng)過一系列反應(yīng)形成初級膽鹽，后轉(zhuǎn)化為次級膽鹽，最后次級膽鹽與甘氨酸或?；撬嵝纬山Y(jié)合型膽鹽，人體中甘氨酸結(jié)合型膽鹽與?；撬峤Y(jié)合型膽鹽的比例約為3∶1[4]。結(jié)合型膽鹽比游離型膽鹽的溶解度更高，兩親性更強(qiáng)，是膽汁中發(fā)揮功能的主要成分。膽鹽作為一種具有較強(qiáng)抗菌活性的物質(zhì)，可通過破壞微生物細(xì)胞膜，誘導(dǎo)胞內(nèi)蛋白質(zhì)錯誤折疊及引發(fā)DNA 損傷等途徑發(fā)揮抑菌作用[5-7]，而細(xì)胞膜是膽鹽攻擊細(xì)菌的首要靶點(diǎn)，低濃度膽鹽會影響細(xì)胞膜上蛋白和酶的活性[8]，同時還會改變菌體的表面性質(zhì)，如疏水性和表面電位[9-10]；而高濃度的膽鹽會直接溶解微生物細(xì)胞膜，致細(xì)胞破裂菌體死亡[11]。腸道益生菌在長期膽鹽脅迫環(huán)境下形成一系列復(fù)雜的細(xì)胞表面蛋白抗性機(jī)制：一些膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)麅?nèi)膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，減輕其對菌體的毒性[12-13]；另有一些膜蛋白，如唾液乳桿菌OppA 蛋白、艱難梭菌跨膜蛋白激酶PrkC、丙二酸桿菌tolC 編碼蛋白具有維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，減少膽鹽進(jìn)入，提高細(xì)菌耐受能力的功能[14-16]。此外，一些膜蛋白還具有感受膽鹽脅迫，調(diào)控胞內(nèi)膽鹽應(yīng)激機(jī)制的功能，如雙歧桿菌中SenX3-RegX3 雙組分調(diào)控系統(tǒng)[17]。目前大部分關(guān)于膽鹽脅迫下表面蛋白的研究僅限于組學(xué)推測階段[18-19]，且乳酸菌抵抗膽鹽的機(jī)制存在菌株特異性，例如：在膽鹽應(yīng)激下，唾液乳桿菌（Lacticaseibacillus salivarius）FWXBH36M1 中LSL_1568、LSL_1716 和LSL_1709 的相對表達(dá)與LSL_0951相比有顯著變化，這些功能基因在唾液乳桿菌FJLHD9M1 中的相對表達(dá)水平呈相反趨勢，其中LSL_0951 表現(xiàn)出比其它基因更高的表達(dá)水平[20]。探究乳酸菌表面蛋白在膽鹽脅迫下的抗性機(jī)制，對于推動乳酸菌腸道適應(yīng)機(jī)制研究具有十分重要的作用。

副干酪乳桿菌（Lacticaseibacillus paracasei）L9（CGMCC No.9800）分離自廣西巴馬長壽老人腸道[21]，具有維持腸道菌群平衡，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，緩解過敏癥狀等益生作用[22-23]。在前期膽鹽脅迫研究中，副干酪乳桿菌 L9 中假定表面蛋白LPL9_0968 所在操縱子基因均顯著上調(diào)（9.67～23.75 倍），為所有差異表達(dá)基因中上調(diào)倍數(shù)最高[24]。本試驗(yàn)通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，LPL9_0968編碼一個屬于LiaX 家族的表面蛋白，目前該家族蛋白僅在糞腸球菌的達(dá)托霉素抗性機(jī)制中有表述，研究顯示這種表面蛋白可與抗生素結(jié)合，通過調(diào)控胞內(nèi)LiaFSR 系統(tǒng)引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變化，從而提升糞腸球菌的耐藥性[25-26]。本文通過構(gòu)建突變體及膽鹽脅迫試驗(yàn)，驗(yàn)證LPL9_0968 蛋白在L9 膽鹽脅迫抗性機(jī)制中的重要作用，探究失去該表面蛋白后，突變菌株對4 種組分膽鹽的敏感性，以及細(xì)胞膜表面產(chǎn)生的電位、形態(tài)變化，通過生物信息學(xué)分析及模擬分子對接佐證該表面蛋白與膽鹽組分之間結(jié)合方式及作用位點(diǎn)。本文首次探究了LiaX家族的表面蛋白在乳酸菌中的功能，對乳酸菌膽鹽脅迫機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

MRS（Man-Rogosa-Sharpe）培養(yǎng)基、LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱生物科技有限公司；紅霉素、氨芐西林、FastPurebacterium DNA 試劑 盒、FastPureEndoFree Plasmid 試劑盒、T4 DNA 連接試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；混合牛膽鹽，上海麥克林生化科技有限公司；?；撬崮扄}、?；撬崦撗跄扄}、甘氨酸膽鹽、甘氨酸脫氧膽鹽，美國Sigma 公司；E.coli DH5α，北京擎科生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶，賽默飛世爾科技公司。

電穿孔儀，美國BIO-RAD；納米粒度分析儀，NanoBrook 90plus，美國Bookhaven；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SU8220），日本JEOL。

1.2 菌株和載體

本研究用菌株和質(zhì)粒列于表1 中。將副干酪乳桿菌L9 在MRS 培養(yǎng)基中37 ℃厭氧培養(yǎng)，大腸桿菌DH5α 在LB 培養(yǎng)基中37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中添加10 μg/mL 紅霉素用于篩選副干酪乳桿菌L9 突變株，添加100 μg/mL 氨芐西林用于大腸桿菌DH5α 重組菌株篩選。加入不同濃度的牛混合膽鹽（Ox-bile）和單一組分膽鹽——?；撬崮扄}（TCA）、?；撬崦撗跄扄}（TDCA）、甘氨酸膽鹽（GCA）、甘氨酸脫氧膽鹽（GDCA）。

表1 本試驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.3 DNA 操作技術(shù)

試驗(yàn)所用引物均為軟件primer 5 設(shè)計（表2）。采用FastPurebacterium DNA 試劑盒提取副干酪乳桿菌L9 的基因組；采用FastPureEndoFree Plasmid 試劑盒提取大腸桿菌的質(zhì)粒；采用Green Taq Mix DNA 聚合酶擴(kuò)增DNA 片段；采用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行DNA 酶切；用T4 DNA 連接試劑盒進(jìn)行載體和片段的連接。采用熱休克轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒引入大腸桿菌DH5α[28]，采用電穿孔法將重組質(zhì)粒引入副干酪乳桿菌L9[29]。所有重組菌株均通過DNA 測序（生工生物工程），并用DNAMAN 軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析。

表2 引物序列Table 2 Sequences of oligonucleotide primers

1.4 突變體菌株構(gòu)建

利用同源重組單交換的方法構(gòu)建LPL9_0968基因并插入失活突變體。首先用引物L(fēng)PL9_0968-F 和LPL9_0968-R 擴(kuò)增LPL9_0968 基因內(nèi)部長度為400 bp（50～450 bp）的片段作為同源臂，該同源臂片段兩側(cè)包含Xba I 和EcoR I 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。然后，將所得同源臂片段和質(zhì)粒pUC19E 均用Xba I 和EcoR I 酶切連接，并將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α 中，通過氨芐霉素篩選獲得重組菌株，將提取獲得的重組質(zhì)粒命名為pUC19E0968。最后，利用電穿孔法將重組質(zhì)粒pUC19E0968 電轉(zhuǎn)入副干酪乳桿菌L9 中，自殺載體pUC19E0968 在乳酸菌中無法復(fù)制，在紅霉素的篩選壓下只能通過同源重組插入LPL9_0968 基因內(nèi)部，導(dǎo)致該基因失活，產(chǎn)生的突變體被命名為LPL9_0968-。在紅霉素耐藥基因內(nèi)部及LPL9_0968 基因組序列下游設(shè)計引物（總長2 396 bp），PCR 擴(kuò)增后測序驗(yàn)證突變株LPL9_0968-是否構(gòu)建成功。

同時，為了消除培養(yǎng)中紅霉素對突變株菌株后續(xù)膽鹽脅迫試驗(yàn)產(chǎn)生的影響，選擇構(gòu)建副干酪乳桿菌 L9 菌株α-半乳糖苷酶基因（melA，LPL9_2172）突變株作為對照菌株（LPL9_melA-）。

1.5 膽鹽脅迫試驗(yàn)

將活化3 代后的LPL9_melA-和LPL9_0968-接種于含紅霉素的MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600nm=0.6，于常溫下8 000×g 離心4 min，收集菌體，棄培養(yǎng)基后將菌體重懸于同體積新鮮MRS 液體培養(yǎng)基中，添加不同濃度的膽鹽。繼續(xù)培養(yǎng)2 h，通過梯度稀釋法進(jìn)行菌落計數(shù)，以不添加膽鹽組為對照，計算膽鹽脅迫下菌株的存活率。本試驗(yàn)中添加的膽鹽組分及含量為：混合牛膽鹽（Oxbile；0%，0.025%，0.05%，0.075%）、?；撬崮扄}（TCA；0%，1.0%，2.0%，3.0%）、?；撬崦撗跄扄}（TDCA；0%，0.2%，0.4%，0.6%）、甘氨酸膽鹽（GCA；1.0%，2.0%，3.0%）和甘氨酸脫氧膽鹽（GDCA；0%，0.025%，0.05%，0.075%）。所有試驗(yàn)至少進(jìn)行3 個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)均做3 份技術(shù)平行試驗(yàn)，用單因素方差分析（ANOVA）來評估數(shù)據(jù)。

1.6 Zeta 電位試驗(yàn)

Zeta 電位依照Giaouris 等[30]的方法進(jìn)行測定：將LPL9_melA-和LPL9_0968-在含有紅霉素的MRS 中培養(yǎng)12 h，收集菌體（6 000×g，10 min，4℃），用1.5 mmol/L 的NaCl 清洗菌體兩遍并重懸至OD400nm=0.3。用納米粒度分析儀測量其Zeta 電位數(shù)值。所有試驗(yàn)至少進(jìn)行3 個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)均進(jìn)行3 份技術(shù)平行試驗(yàn)，使用單因素方差分析（ANOVA）來評估數(shù)據(jù)。

1.7 掃描電鏡

將LPL9_melA-和LPL9_0968-培養(yǎng)至OD600nm=0.6，收集菌體，用0.85%的生理鹽水洗滌2 次后，重懸于含膽鹽（0.4% TDCA）的MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h。離心收集菌體，用4%戊二醛在4 ℃下過夜固定。用雙蒸水洗滌3 次，然后，依次用30%，50%，70%，85%，95%，100%的乙醇浸泡13 min，6 000×g 離心5 min，棄上清，再用100%乙醇重復(fù)上述操作3 次，使用冷凍干燥機(jī)（寧波新芝SCIENTZ-10N）凍干成粉，用場發(fā)射掃描電子顯微鏡進(jìn)行13 萬倍和30 萬倍放大成像。

1.8 生物信息學(xué)分析

通過 GenBank 及 KEGG 等數(shù)據(jù)庫對LPL9_0968 基因進(jìn)行原位分析；用TMHMM server v.2.0 工具分析相關(guān)蛋白中的跨膜區(qū)；用NCBI 中的Blast 工具進(jìn)行蛋白同源序列的分析，并使用MEGA 軟件，采用鄰位相接法設(shè)置各分支的置信度，構(gòu)建N-J 系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用ClustalX 軟件對LPL9_0968 相似蛋白序列進(jìn)行比對，分析其保守位點(diǎn)。

1.9 分子對接

利用I-TASSER（https：//zhanggroup.org//ITASSER/）服務(wù)器對LPL9_0968 進(jìn)行蛋白三維結(jié)構(gòu)建模，在PubChem 數(shù)據(jù)庫中下載各膽鹽組分的結(jié)構(gòu)文件。以LPL9_0968 編碼蛋白為受體，各膽鹽組分分子為配體，運(yùn)用Discovery Studio（DS）軟件中CDOCKER 模塊進(jìn)行分子對接。在分子對接開始前使用DS 中Preparation Protein 對蛋白進(jìn)行優(yōu)化，Prepare Ligands 對配體進(jìn)行優(yōu)化，執(zhí)行諸如刪除重復(fù)、枚舉異構(gòu)體和互變異構(gòu)體以及生成3D 構(gòu)象等任務(wù)。準(zhǔn)備結(jié)束后使用CDOCKER 模塊進(jìn)行對接，設(shè)置Pose Cluster Radius 為0.5 以確保對接構(gòu)象盡可能具有多樣性，其余參數(shù)默認(rèn)。最終數(shù)據(jù)以-CDOCKER ENERGY為主，以-CDOCKER INTERACTION ENERGY 為輔，以Binding Energy、Ligand Energy 等數(shù)據(jù)為參考進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果

根據(jù)GenBank 和KEGG 等數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果，副干酪乳桿菌L9 中LPL9_0968 基因所在操縱子的結(jié)構(gòu)如圖1 所示：LPL9_0968、LPL9_0969和LPL9_0970 3 個基因構(gòu)成一個功能未知的操縱子。利用在線工具TMHMM server w.2.0 進(jìn)行跨膜區(qū)域分析，結(jié)果（圖2），LPL9_0969 和LPL9_0970分別編碼兩個89AA 和111AA 大小的跨膜區(qū)域蛋白，LPL9_0968 編碼的493AA 蛋白則完全位于細(xì)胞外側(cè)。通過Blast 進(jìn)行蛋白序列比對，發(fā)現(xiàn)LPL9_0968 編碼的蛋白屬于LiaX 家族的膜蛋白，用MEGA 7.0 中的Neighorjoining 算法構(gòu)建進(jìn)化樹，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析如圖3 所示。LiaX 家族蛋白多存在于腸球菌屬和乳酸菌干酪乳桿菌群中（干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳酪桿菌），在乳酸菌中該蛋白間相似度高達(dá)93.59%，而與糞腸球菌中的LiaX 蛋白從進(jìn)化上看明顯分為兩個亞組，副干酪乳桿菌L9 中LPL9_0968 蛋白與糞腸球菌中的LiaX 蛋白序列相似度高達(dá)61.96%。通過ClustalX 序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），LiaX 家族蛋白具有一些明顯的保守區(qū)域，蛋白N 端1～30序列處存在多個保守氨基酸位點(diǎn)。此外，蛋白200～500 序列處也屬于保守氨基酸較多的部分，其中包含多個天冬酰胺和甘氨酸（ng）保守位點(diǎn)。

圖1 LPL9_0968 基因所在操縱子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure of the operon where the LPL9_0968 gene is located.

圖2 LPL9_0968、LPL9_0969、LPL9_0970 基因蛋白跨膜區(qū)域分析Fig.2 Analysis of the transmembrane domain in LPL9_0968，LPL9_0969 and LPL9_0970 proteins

圖3 Neighorjoining 法構(gòu)建LiaX 家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of LiaX proteins constructed by Neighorjoining method

圖4 假定表面蛋白LPL9_0968 與其它乳酸菌和腸球菌中LiaX 蛋白氨基酸序列的多重比對分析Fig.4 Multiple alignment of LPL9_0968 with LiaX proteins from other Lacticaseibacillus and Enterococcus.

目前該家族蛋白僅在糞腸球菌中被報道參與達(dá)托霉素抗藥性機(jī)制[31]。研究發(fā)現(xiàn)，LiaX 膜蛋白存在胞外游離態(tài)和細(xì)胞膜結(jié)合態(tài)兩種狀態(tài)，能夠根據(jù)環(huán)境中的達(dá)托霉素信號改變與細(xì)胞膜上蛋白的結(jié)合狀態(tài)，從而激活菌體的達(dá)托霉素抗性相關(guān)基因[25]。推測LPL9_0968、LPL9_0969 和LPL9_0970 3個基因表達(dá)的蛋白可能共同構(gòu)成一個細(xì)胞膜表面蛋白，其中LPL9_0969 和LPL9_0970 表達(dá)的蛋白構(gòu)成跨膜錨定區(qū)域，LPL9_0968 通過與跨膜錨定區(qū)域蛋白相連而位于細(xì)胞膜表面。有研究表明，副干酪乳桿菌L9 在膽鹽脅迫下，該操縱子中的3個基因轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)9.67，10.33 倍和23.75倍[24]，表明該表面蛋白很有可能參與副干酪乳桿菌L9 膽鹽脅迫抗性機(jī)制。

2.2 突變體的構(gòu)建及膽鹽脅迫

為了研究LPL9_0968 相關(guān)基因在副干酪乳桿菌L9 膽鹽脅迫中的作用，利用同源重組單交換的方法構(gòu)建LPL9_0968 基因，插入失活突變株LPL9_0968-，試驗(yàn)原理見圖5。PCR 擴(kuò)增及測序結(jié)果表明（數(shù)據(jù)未顯示），自殺載體pUC19E0968 已成功插入副干酪乳桿菌L9 基因組LPL9_0968 基因內(nèi)部，整個操縱子均已失活。同理，本試驗(yàn)成功構(gòu)建了α-半乳糖苷酶基因melA 突變株LPL9_melA-作為對照菌株。對突變株LPL9_melA-和LPL9_0968-進(jìn)行混合牛膽鹽脅迫試驗(yàn)，結(jié)果如圖6 所示：在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.025%，0.050%和0.075%混合牛膽鹽含量下，LPL9_0968 基因突變株的膽鹽耐受能力均低于對照組，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.075%下LPL9_0968-存活率為4.2%，與對照組相比降低10.17 倍，存在顯著性差異（P＜0.05）。這表明LPL9_0968 及其相關(guān)基因所構(gòu)成的表面蛋白在副干酪乳桿菌L9 膽鹽抗性機(jī)制中具有重要作用。

圖5 基于同源重組單交換原理構(gòu)建LPL9_0968-基因突變菌株Fig.5 Construction of L.paracasei mutant strain LPL9_0968- based on homologous recombination single crossover

圖6 LPL9_melA- and LPL9_0968- 在?；旌夏扄}脅迫下的存活率Fig.6 Survival rate of recombination strain LPL9_melA- and LPL9_0968- under Ox-bile stress

2.3 單一組分膽鹽脅迫試驗(yàn)

為了研究該表面蛋白在膽鹽脅迫抗性機(jī)制中是否對不同膽鹽組分具有特異性，采用4 種單一膽鹽組分（TCA、TDCA、GCA、GDC）來評估突變株LPL9_melA-和LPL9_0968-的膽鹽耐受能力，結(jié)果見圖7。在4 種單一膽鹽脅迫下，LPL9_0968-存活率與LPL9_melA-相比均出現(xiàn)不同程度的下降，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%的TCA 中，LPL9_0968-存活率顯著下降1.95 倍（P＜0.05）；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的TDCA中，LPL9_0968-存活率顯著下降2.85 倍（P＜0.05）；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的GCA 中，LPL9_0968-存活率顯著下降2.05 倍（P＜0.05）；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%的GDCA 中，LPL9_0968-存活率顯著下降8.21 倍（P＜0.05），下降程度最高。以上結(jié)果表明，試驗(yàn)菌株和對照菌株對TDCA 和GDCA 的耐受能力明顯低于TCA 和GCA，這與脫氧結(jié)合型膽鹽有更強(qiáng)的毒性有關(guān)[32]。此外，在4 種結(jié)合型膽鹽中，突變株對甘氨酸脫氧膽鹽更為敏感，表明LPL9_0968 表面蛋白在菌株膽鹽抗性中對甘氨酸脫氧膽鹽具有特異性。

圖7 LPL9_melA- and LPL9_0968-在單一組分膽鹽脅迫下的存活率Fig.7 Survival rate of mutant strains LPL9_melA- and LPL9_0968- under different kind of bile salt stress

2.4 Zeta 電位

為了進(jìn)一步探究LPL9_0968 假定表面蛋白在副干酪乳桿菌L9 膽鹽抗性中的作用機(jī)制。通過Zeta 電位考察突變菌株表面所帶電荷量的變化，結(jié)果見圖8。LPL9_0968-的表面電位顯著低于LPL9_melA-（P＜0.05），負(fù)值增大。這表明LPL9_0968膜蛋白缺失后，菌體的雙電層吸附層的負(fù)電荷增加，從而反映菌體表面所帶的正電荷增加，這可能導(dǎo)致膜電位的紊亂，細(xì)胞膜穩(wěn)定性降低，菌株的膽鹽耐受能力降低。

圖8 LPL9_melA-和LPL9_0968- Zeta 電位Fig.8 Zeta potential of LPL9_melA- and LPL9_0968-

2.5 掃描電鏡結(jié)果

為了驗(yàn)證LPL9_0968 蛋白缺失引起的菌體Zeta 電位下降會導(dǎo)致突變株更易受膽鹽的攻擊，用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察膽鹽脅迫下LPL9_melA-和LPL9_0968-細(xì)胞表面的形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖9 所示，經(jīng)2 h，0.4% TDC 的脅迫后，LPL9_0968-菌體表面形態(tài)的完整性明顯差于對照組LPL9_melA-，出現(xiàn)較多的粗糙和萎縮現(xiàn)象（綠色箭頭處）。這表明LPL9_0968-在相同濃度膽鹽脅迫下，細(xì)胞膜受損和細(xì)胞內(nèi)含物泄露更為嚴(yán)重。

圖9 場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察LPL9_melA-和LPL9_0968-膽鹽脅迫下菌體形態(tài)Fig.9 The morphology of LPL9_melA- and LPL9_0968- under bile stress by FESEM.

3 討論

細(xì)胞膜是膽鹽攻擊細(xì)菌的首要目標(biāo)，而表面蛋白作為第1 道防線，通過多種機(jī)制抵抗膽鹽脅迫，以提高細(xì)菌的生存能力[5]。LPL9_0968，LPL9_0969 和LPL9_0970 是副干酪乳桿菌L9 基因組中一組功能未知的假定膜蛋白，在前期膽鹽脅迫相關(guān)研究中，該組基因在膽鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)為全基因組中最高。通過構(gòu)建插入失活突變體及膽鹽脅迫試驗(yàn)，成功證明LPL9_0968相關(guān)的假定膜蛋白參與副干酪乳桿菌L9 的膽鹽抗性機(jī)制。然而，通過分析可知LPL9_0968 假定蛋白為膜表面蛋白，并不具有膜內(nèi)部分及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道，因此不具有轉(zhuǎn)運(yùn)膽鹽的能力。

經(jīng)分析比對，LPL9_0968 基因編碼的蛋白屬于LiaX 家族表面蛋白，與糞腸球菌中的LiaX 蛋白具有很高的相似性。LiaX 蛋白在糞腸球菌中是細(xì)菌抵抗達(dá)托霉素的表面響應(yīng)蛋白，它能夠感受胞外抗達(dá)托霉素分子，通過與細(xì)胞表面LiaFSR 調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，激活細(xì)胞膜表面的多種蛋白響應(yīng)機(jī)制來修復(fù)因外界脅迫而導(dǎo)致的細(xì)胞膜完整性受損[25，31，33]。推測副干酪乳桿菌L9 中的LPL9_0968蛋白很可能也通過感受膽鹽信號，調(diào)控相關(guān)膜蛋白基因的表達(dá)，從而在膽鹽脅迫下維持細(xì)胞膜的平衡，抵抗膽鹽脅迫。Zeta 電位結(jié)果反映突變體表面正電荷量增加，而結(jié)合型膽鹽在溶液中會解離成為帶負(fù)電的分子，菌體表面正電荷增加可能導(dǎo)致膽鹽分子吸附增多，細(xì)胞膜受到更為嚴(yán)重的破壞。通過掃描電鏡觀察膽鹽脅迫下的菌體表面，證實(shí)了這一結(jié)果，表明LPL9_0968 參與了維持細(xì)胞表面電荷穩(wěn)定與細(xì)胞膜完整性的過程。

為了進(jìn)一步探討LPL9_0968 蛋白是否能感受膽鹽分子信號，通過分子對接來考察假定表面蛋白與膽鹽組分的相互作用。通過I-TASSER 網(wǎng)站建立LPL9_0968 蛋白模型（圖10），利用DS 將蛋白與4 種單一膽鹽組分對接，結(jié)果表明：蛋白與膽鹽組分之間存在以氫鍵為主的相互作用（圖11）。4 種膽鹽與LPL9_0968 蛋白對接所產(chǎn)生的結(jié)合能均為負(fù)值，說明二者間發(fā)生結(jié)合的可能性很大，且發(fā)生結(jié)合后的狀態(tài)相對穩(wěn)定。LPL9_0968 與GDCA 間還存在電荷之間的吸引力，并且膽鹽分子與LPL9_0968 相互作用的區(qū)域是LiaX 家族蛋白序列300～500 部分氨基酸保守度較高的區(qū)域，該區(qū)域可能與感受環(huán)境信號分子相關(guān)，同時也可能控制LiaX 與膜上蛋白結(jié)合或分離。通過比對發(fā)現(xiàn)，LPL9_0969 和LPL9_0970 與糞腸球菌中LiaFSR蛋白相似度并不高，且未在副干酪乳桿菌L9 中找到與之相似的同源蛋白，因此LPL9_0968 感受膽鹽脅迫參與調(diào)控機(jī)制尚待探究。

圖10 同源建模Fig.10 Homology modeling

圖11 假定表面蛋白與4 種膽鹽組分模擬分子對接的結(jié)合能及對接結(jié)果2D 示意圖Fig.11 2D schematic diagram of binding energy and docking results between hypothetical surface protein and four simulated bile salt components

4 結(jié)論

本研究首次報道乳酸菌中的LiaX 家族表面蛋白LPL9_0968，采用生物信息學(xué)分析對其基因結(jié)構(gòu)、蛋白序列保守性及其與腸球菌中LiaX 家族蛋白的關(guān)系進(jìn)行初步分析，同時探究了LPL9_0968 的功能，確定其參與副干酪乳桿菌L9膽鹽脅迫抗性機(jī)制。該蛋白可能通過維持細(xì)胞膜的平衡及完整性來提高菌株的膽鹽耐受能力。通過分子對接推測該表面蛋白可能與膽鹽組分存在相互作用，可作為膽鹽脅迫的表面響應(yīng)蛋白，參與胞內(nèi)未知的調(diào)控。

致謝

感謝長沙理工大學(xué)創(chuàng)新項(xiàng)目：假定表面蛋白LPL9_0968 在副干酪乳桿菌L9 膽鹽脅迫應(yīng)激中的作用對本試驗(yàn)給予的經(jīng)費(fèi)支持。