姜彬，張亞運，方儀德，許金海，葉潔，莫文

1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海 200032；2.同濟大學附屬楊浦醫(yī)院，上海 200090

頸椎病是指由于頸椎區(qū)域脊柱結(jié)構(gòu)退化，累及周圍結(jié)構(gòu)(神經(jīng)、血管等)，并出現(xiàn)與影像學改變相符的臨床表現(xiàn)的疾病[1-2]。在中醫(yī)古籍中雖未記載此病名，但中醫(yī)理論和臨床對于本病已積累了豐富的經(jīng)驗。該病在中醫(yī)學中可歸為“項痹”。《素問·逆調(diào)論》曰：“腎不生則髓不能滿”[3]?！鹅`樞·五癃津液別》中曰：“五谷之精液，和合而為膏者……補益腦髓”[4]；古代醫(yī)家認為本病與督脈、腎、脾關(guān)系密切。龍華醫(yī)院骨傷科主任莫文教授是石氏傷科第五代傳人，師從國醫(yī)大師施杞教授，繼承其“從痹論治頸椎病”的學術(shù)觀點，臨床上長期堅持使用中醫(yī)藥辨證論治頸椎病，并進行一系列臨床研究[5-6]。本文收集了莫文教授門診中治療頸椎病患的中藥處方，通過數(shù)據(jù)挖掘的方式探索頸椎病的遣方用藥規(guī)律，總結(jié)學術(shù)思想，對篩選出的核心藥對“黃芪-川芎-甘草”進行網(wǎng)絡藥理學分析，探索其治療頸椎病的通路及機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例資料來源于2020 年1 月至2021年6月上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院莫文教授特需、專家門診的病例記錄。通過回顧醫(yī)院門診病例系統(tǒng)記錄，共計收集到符合頸椎病相關(guān)診斷的中藥處方108例[7]。

1.2 納入標準 (1)收集病例診斷符合頸椎病的分型、診斷及非手術(shù)治療專家共識(2018)；(2)病例中患者處方用藥完整；(3)接受中藥治療后患者癥狀都較前有明顯改善。

1.3 排除標準 (1)合并心、腦、腎等其他嚴重原發(fā)疾病患者[8]；(2)數(shù)據(jù)收集不準確者。

1.4 數(shù)據(jù)庫建立與核對 由雙人分別進行相關(guān)病例篩選，將符合要求的病例錄入Excel2016 軟件的表格，建立數(shù)據(jù)庫。若納入的為同一患者的多次就診病例，不同診次使用處方藥物不同，則記為多個處方納入。為防止錄入過程中產(chǎn)生的誤差，錄入完畢后兩人分別檢查是否存在處方重復、錯字或缺漏，減少對最終結(jié)果的影響[7]。

1.5 相關(guān)信息的規(guī)范化 方劑組成藥物及其加減藥物均予統(tǒng)計，中成藥所含中藥不明者不納入統(tǒng)計；中藥名及其功能分類、歸經(jīng)分類標準參照《中華人民共和國藥典》[9]進行校正，功能分類參照《中藥學》[10]。

1.6 研究方法 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢“川芎、黃芪、甘草”藥對中藥活性化合物及對應的靶點信息，通過Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡圖。再以“Vertebral artery type cerbical spondylosis、Nerve Root Cervical Spondylopathy、Cervical spondylotic myelopathy、Mixed cervical spondylosis”為關(guān)鍵詞檢索，采用GeneCards（http://www.genecards.org/)、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/)收集頸椎病相關(guān)的靶點，之后通過在線平臺和STRING 數(shù)據(jù)庫進行“藥物—疾病靶點”韋恩圖和PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析，最終將潛在靶點代入Metascape數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路和GO富集分析。

1.7 統(tǒng)計學方法 運用Excel2016軟件計算方藥的頻數(shù)、頻率；運用SPSS25.0 軟件對數(shù)據(jù)庫中的高頻藥物采用Q 型聚類方法進行聚類分析；運用SPSS Modeler 18.0軟件中的Apriori算法和網(wǎng)絡對高頻藥物進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料 本研究共納入108 例患者，男性46例，女性62例，平均年齡(68.55±9.67)歲。其中神經(jīng)根型頸椎病32 例，脊髓型頸椎病45例，混合型頸椎病31例。

2.2 用藥頻數(shù)及頻次統(tǒng)計 根據(jù)統(tǒng)計，治療頸椎病的中藥共計149味，累計出現(xiàn)頻次1 961次。其中頻率大于1%的藥物共計34 味，其中頻數(shù)最高的藥物是炙甘草(95 次)，但莫文教授認為炙甘草為常規(guī)配伍用藥，對疾病沒有針對性，故在排除甘草的基礎(chǔ)上，頻數(shù)最高的是川芎(83次)，其次是黃芪(83次)、白芍(74次)、桂枝(66 次)、柴胡(64 次)、葛根(60 次)、當歸(59 次)、大棗(56次)，見表1。

表1 頸椎病常用中藥頻數(shù)、頻率表(頻數(shù)＞1%)

2.3 藥物功效 藥物類別中占比最重是補虛藥(28 味)，尤以補氣藥及補血藥為重，由此可見，補氣養(yǎng)血是治療頸椎病的基本治法，在此基礎(chǔ)上可配合清熱解表、活血化瘀、祛風利濕等治法，見表2。

表2 頸椎病常用中藥功用類別表(降序排列)

2.4 藥物的四氣、五味、歸經(jīng)情況 溫類和熱類藥物在總數(shù)中占比最多，共計65味，其次是寒類和平類藥物，可見，莫文教授用藥總體是以溫熱為主，但用藥時注重陰陽平衡，會適量加入寒涼藥物，且注重使用平類藥物固護脾胃(圖1)。五味中以辛味(69 味)及苦味(74 味)藥物為主，《臟氣法時論》曰“辛散、酸收、甘緩、苦堅、咸耎”[3]217，辛味與苦味合用，具有“辛開苦降”的特點，可調(diào)節(jié)患者氣機，如《六微旨大論》所言：“非升降，則無以生長化收藏，是以升降出入，無氣不有”[3]568，調(diào)暢氣機是中醫(yī)治療的重要思想。排第三的甘味藥(61 味)，除了本身可以緩解頸椎病患者疼痛癥狀，也體現(xiàn)出《素問·陰陽應象大論》“辛甘發(fā)散為陽”[3]56的用藥原則。藥物歸經(jīng)方面，以肝經(jīng)(74 味)和脾經(jīng)(65 味)為主，肝主筋，脾主肌肉，肝脾同治，符合石氏傷科“筋骨并調(diào)”的理論思想。

圖1 藥物的性、味、歸經(jīng)分布雷達圖

2.5 高頻藥物聚類分析 將Excel中收集的中藥數(shù)據(jù)后，使用數(shù)據(jù)透視表匯總，然后轉(zhuǎn)換為SPSS25.0軟件可識別矩陣。對出現(xiàn)頻率＞1.00%的32 味高頻中藥進行系統(tǒng)聚類分析，聚類方法選則組間聯(lián)接、度量標準區(qū)間選Pearson 相關(guān)性，將度設為24，可聚為3 類(圖2)：第1 類包括熟地、砂仁、桑枝、地龍、烏梢蛇、川芎、黃芪、白芍、當歸、炙甘草、香附、白術(shù)、瓦楞子，為補陽還五湯與圣愈湯加減，適用于氣虛血瘀的患者，扶正祛邪，補氣化瘀；圣愈湯中加入香附、桑枝和烏梢蛇，可增強其理氣活血通絡之力。第2類包含秦艽、五靈脂、葛根、蔓荊子、桂枝、麻黃、大棗、干姜、鮮地黃；小藥對中，秦艽與五靈脂都可止痹痛，葛根與蔓荊子皆為輕揚升發(fā)之品，可升陽舉陷[11]，引藥上行；麻黃、桂枝配伍溫通經(jīng)脈，干姜、大棗調(diào)和營衛(wèi)，諸藥合用，可溫經(jīng)散寒、升陽止痛。第2 類藥物為葛根湯與身痛逐瘀湯加減，適用于氣滯血瘀兼有風寒的患者。第3 類包括荷葉、升麻、天麻、姜半夏、陳皮、茯苓、莪術(shù)、柴胡、黃芩、太子參、半夏、牡蠣。柴胡、黃芩、太子參、半夏，構(gòu)成小柴胡湯，用以和解少陽，升麻、荷葉皆可引經(jīng)上行、清利頭目，配合天麻可息風止眩，陳皮、姜半夏、茯苓燥濕化痰；諸藥并用，可疏解少陽、化痰息風。第3 類藥物為小柴胡湯、清震湯、二陳湯加減，適用于伴有眩暈的患者[12]，莫文教授所用清震湯以葛根、升麻、天麻、荷葉為主方，更兼平抑肝陽。

圖2 藥物聚類樹狀圖

2.6 高頻藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 由于炙甘草在處方當中出現(xiàn)頻率高，在處方中無特殊作用，故在刪除炙甘草的基礎(chǔ)上對出現(xiàn)頻率＞1.00%的高頻中藥進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析。設置支持度為40%、置信度為80%，將藥物組合按照支持度降序排列，16 條核心藥物組合見表3。設置弱鏈接上限15，強鏈接下限30，對關(guān)聯(lián)規(guī)則進行可視化，構(gòu)建出18 味核心中藥組成的中藥網(wǎng)絡圖(圖3)。本次研究中，兩味藥組合中支持度最高(65.87%)的是川芎與黃芪組合，其后是白芍和桂枝與川芎或黃芪的組合，還涉及葛根、當歸。川芎為活血化瘀藥，黃芪為補氣藥，兩者組合，符合石氏傷科“以氣為主、以血為先”的思想。此外大部分為引經(jīng)藥，川芎屬太陽、少陽，葛根屬陽明、桂枝因其自然特征可引藥至四肢，這可以體現(xiàn)傷科疾病重視引經(jīng)藥的特點。再加黃芪、當歸補氣養(yǎng)血，但最終都需要健脾補虛。三味藥的組合可歸結(jié)于炙甘草、川芎、黃芪、白芍四種藥，可見此為莫文教授治療頸椎病的核心。

表3 藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則表(按支持度降序排列)

圖3 核心藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)絡圖

2.7 核心藥物模式“川芎、黃芪、甘草”治療頸椎病的作用機制

2.7.1 川芎、黃芪、甘草活性成分及靶點篩選 采用OB≥30%和DL≥0.18 的標準在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中進行活性成分篩選，得到119種活性成分。119種化合物在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中預測得到潛在靶蛋白4 116 個，并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換為基因名稱，刪除重復后最終獲得339 個潛在靶基因。通過Cytoscape3.8.0 軟件構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡圖，見圖4。根據(jù)網(wǎng)絡Degree值結(jié)果，位居前三的成分依次為槲皮素(Quercetin)、山柰酚(kaempferol)、芒柄花素(formononetin)。

圖4 核心藥物核心成分-靶點網(wǎng)絡圖

2.7.2 頸椎病疾病相關(guān)靶點 采用GeneCardsOMIM數(shù)據(jù)庫收集頸椎病相關(guān)的靶點1 921個。將獲取的藥物靶點與頸椎病差異表達基因進行匹配映射，并利用在線平臺繪制韋恩圖，見圖5。得到藥物-疾病共同靶點50 個。將交集基因輸入至STRING數(shù)據(jù)庫，得到PPI 網(wǎng)絡圖，得到相關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能與基因之間的相互作用關(guān)系，見圖6。

圖5 藥物-疾病靶點韋恩圖

圖6 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡圖

2.7.3 KEGG 通路富集分析 將50 個潛在靶點代入Metascape 數(shù)據(jù)庫進行通路富集分析，設置P＜0.01，得到353 個信號通路，主要涉及IL-17 等信號通路，根據(jù)LogP排名靠前的16個信號通路，見圖7。

圖7 KEGG熱圖

2.7.4 核心藥物治療頸椎病靶點功能通路富集分析 將50個潛在靶點代入Metascape數(shù)據(jù)庫進行靶點功能通路富集分析，GO富集結(jié)果分別從BP(biological process，生物過程)、CC (cellular component，細胞組分)和MF(molecular function，分子功能)三個方面進行生物學過程分析，設置P＜0.01，BP主要涉及apoptotic signaling pathway 等；CC 主 要 涉 及 membrane raft等；MF主要涉及kinase binding等，見圖8。

3 討論

頸椎病是頸椎間盤或椎間關(guān)節(jié)退變性疾病，在國內(nèi)發(fā)病率為10%～20%[13]。根據(jù)臨床癥狀及相應影像表現(xiàn)的不同，頸椎病可分為神經(jīng)根型、脊髓型、頸型和其他型頸椎病[14]。大部分頸椎病無需手術(shù)，通過保守治療即可改善患者癥狀，而中醫(yī)藥治療方式以其療效顯著、副作用小而受到關(guān)注。莫文教授長期致力于研究中醫(yī)藥辨證論治脊柱退行性疾病，提出了“氣血為綱，臟腑為本，法宗調(diào)衡，中西結(jié)合”的觀點。這在本研究中得到充分體現(xiàn)。莫文教授用藥的特點是處方常為經(jīng)方之間的組合，很少純粹以藥對疊加。莫師認為，先賢留世處方往往匠心獨運，配伍得宜，或急治其標，或緩圖其本，須抽絲剝繭，體會個中意。臨診辨證清楚，就能如臂使指，思過半矣。在此基礎(chǔ)上再增減藥物以突出某一方面的功效，方能收效頗豐[15]。莫師組方時還善用引經(jīng)藥。傷科疾病往往部位明確，故引經(jīng)藥運用十分廣泛。如細辛通督脈，故可治療脊柱疾病；羌活祛上身風濕，獨活祛下身風濕等。本次聚類分析，第一類隊列中圣愈湯及補陽還五湯中加用桑枝，為上行引經(jīng)藥；第二類藥物隊列中加用蔓荊子；第三類藥物中則含有升麻、荷葉等升提清陽的藥物，足見引經(jīng)藥在頸椎病治療中的重要。然而，患者常表現(xiàn)為一側(cè)上肢麻木疼痛，卻未有明確可分人身左右之引經(jīng)藥。張錫純在《醫(yī)學衷中參西錄》曾提及，病在左者宜用鹿茸、鹿角或鹿角膠作引；病在右者宜用虎骨或虎骨膠作引[11]，這一點有待進一步研究。最后，臨床中骨傷科患者常會伴隨焦慮或抑郁情緒，莫師善從少陽及厥陰二經(jīng)辨證論治頸椎病?！秱摗吩唬骸吧訇栔疄椴。诳?，咽干，目眩也”，頸椎病患者常伴有頭暈目眩、口干口苦等表現(xiàn)，此時可用小柴胡湯為底。還有患者常見身熱汗出，心煩不眠，又兼手足冷，脈沉，這與厥陰病“脈微，手足厥冷，煩躁”相符，證見寒熱錯雜，此時可用烏梅丸為底，寒熱并用，辛開苦降[16]。

頸椎間盤慢性炎癥是頸椎病發(fā)病的主要原因，巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞通過釋放TNF、IF-1、IL-6、IL-10和IFN等參與到繼發(fā)的脊髓病理炎癥反應，炎癥反應對脊髓損傷早期有修復作用，但在后期阻礙了神經(jīng)生長[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)的核心藥物發(fā)揮治療頸椎病作用的成分可能為槲皮素、芒柄花素、山奈酚。槲皮素、芒柄花素都屬于黃酮類藥物，研究顯示黃酮類成分具有較強的抗氧化活性和抗炎作用[18]，可以改善血液循環(huán)及抑制炎性物質(zhì)滲出[19]；王業(yè)楊等[20]通過給予大鼠脊髓損傷模型術(shù)后每日槲皮素注射治療發(fā)現(xiàn)槲皮素可抑制TLR4/NF-κB 介導的炎癥反應和細胞凋亡從而減輕脊髓損傷，而山奈酚抑制炎癥細胞因子IL-6、IL-1β的表達。

富集分析發(fā)現(xiàn)核心中藥主要通過調(diào)控IL-17通路影響頸椎病，研究顯示IL-17 通路過度表達可加速炎癥因子分泌及中性粒細胞聚集，激活炎癥反應，參與到脊髓損傷后炎癥反應[21]。而中藥單體如姜黃素、川芎嗪等可調(diào)控炎癥因子，降低炎癥反應嚴重程度，促進脊髓損傷的修復[22]。

BP 分析發(fā)現(xiàn)，核心中藥治療頸椎病涉及細胞凋亡過程。中藥中如人參皂苷Rg1、芍藥苷可以抑制脊髓神經(jīng)元細胞凋亡，對受損的脊髓細胞起到保護作用[23]。川芎嗪則可以抑制血管內(nèi)皮凋亡，從而改善受壓脊髓局部的微循環(huán)，增加血供[24]。

CC 分析發(fā)現(xiàn)，核心藥物主要影響頸椎病的膜筏部分。膜筏是細胞膜上一種非均一性富集固醇和鞘脂的高動態(tài)小型域[25]。研究顯示，在脊髓損傷后，一些阻斷軸突再生或促進細胞死亡的受體被定位在膜筏中，通過在膜筏中聚集不利的蛋白質(zhì)，阻礙脊髓損傷后的運動恢復[26]。

MF 分析發(fā)現(xiàn)，核心藥物治療頸椎病與其調(diào)節(jié)激酶結(jié)合有關(guān)。徐同虓等[27]研究證明，氨酸激酶結(jié)合蛋白可介導小膠質(zhì)細胞，抑制其過度活化，從而抑制炎癥反應，起到保護神經(jīng)的作用。

綜上所述，核心藥物可以通過抑制細胞凋亡、減少神經(jīng)炎癥反應、膜筏、激酶結(jié)合等過程發(fā)揮作用[28]，這為之后的基礎(chǔ)研究提供了理論依據(jù)。