蔣麗紅，吳國光，陳潔潤，李麗蘭

南寧輸血醫(yī)學(xué)研究所南寧中心血站，廣西 南寧 530003

CD36 蛋白也稱糖蛋白Ⅳ (GPⅣ)、GPⅢb、GP88、PASⅣ等，相對(duì)分子量約88 000[1]，是一種多肽單鏈的跨膜糖蛋白(B 型清道夫受體，SR-B2)，可與多種配基相結(jié)合。它在人體內(nèi)的分布廣泛，在血小板、單核細(xì)胞、有核紅細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞、心肌和骨骼肌等細(xì)胞表面均有表達(dá)[1]。它還有脂質(zhì)配體和蛋白質(zhì)配體兩大類配體，包括低密度脂蛋白、脂類、脂肪酸、膠原、血小板反應(yīng)蛋白也是CD36的配體之一。

在生物多樣性進(jìn)化過程中，部分健康個(gè)體中出現(xiàn)CD36 缺失[2-3]。CD36 缺失包括兩類表現(xiàn)型：Ⅰ型缺失，血小板上不表達(dá)CD36，單核細(xì)胞上亦不表達(dá)CD36；Ⅱ型缺失，血小板上不表達(dá)CD36，但單核細(xì)胞上表達(dá)CD36[4]。CD36 缺失個(gè)體可通過移植、妊娠或輸血等途徑接觸CD36抗原，引發(fā)CD36同種抗體的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致免疫性血小板輸注無效、胎兒和新生兒同種免疫血小板減少、輸血后紫癜等同種免疫血小板免疫異常疾病[5-6]。CD36 缺失個(gè)體在不同種族、人群中的分布不同，在高加索人中比較少見(0～0.06%)，在中國人群中CD36 缺失個(gè)體比例較高為1.8%～4.13%，其中廣西人群中的CD36缺失個(gè)體比例高于其他中國地區(qū)人群(4.13%)[3，7-11]。本研究在一名廣西CD36缺失個(gè)體中發(fā)現(xiàn)了可導(dǎo)致CD36缺失的CD36基因新突變，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 先證者為女性，1964 年11 月出生，壯族，為本實(shí)驗(yàn)室在廣西人群CD36缺失分布特征研究中發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)的CD36 缺失個(gè)體[1]；其女1986 年11月生，壯族；使用EDTA抗凝管采集所有受試者靜脈血5 mL，于-20℃保存待檢。本研究已通過本單位倫理審查批準(zhǔn)，并按倫理審批意見征得研究對(duì)象知情同意，并簽署知情同意書后采集樣本。

1.2 儀器與試劑 鼠抗人CD36 單抗(美國東南威斯康星血液中心Dr.BrianR.Curtis 饋贈(zèng))，鄰苯二胺(丹麥Dako 公司，批號(hào)：20002056)，Pure gene DNA Purification Kit(QIAGEN，德國，批號(hào)：8850000298)，擴(kuò)增引物(上海捷瑞生物工程有限公司合成)，TRIZOL(Invitrogen，美國，批號(hào)：15596026)，One Step RNA PCR Kit (TaKaRa，日本，批號(hào)：AJ30794A)，DNA 膠回收試劑盒(Axygen，美國，批號(hào)：15318KE1)，pLV4/StripII-HIS10(深圳盎然生物)，無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒(TIANGEN，北京，批號(hào)：S8008)，Mem-PERTM Plus試劑盒(Thermo，美國，批號(hào)：89842Y)，PCR擴(kuò)增儀(ABI，美國，GeneAmp9700 型)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，美國，Molecular Imager Gel DocTM XR System)，流式細(xì)胞儀(BD 公司)，轉(zhuǎn)膜儀(美國 Bio-Rad，Trans-Blot Turbo Transfer System)等。

1.3 方法

1.3.1 CD36 表型檢測(cè) 運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)室建立[12-13]的血小板流式細(xì)胞熒光免疫檢測(cè)試驗(yàn)(platelet immunou fluorescence test-flow cytometry，PIFT-FC)、血小板抗原單克隆抗體特異性免疫固定試驗(yàn)(monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigen，MAIPA)檢測(cè)CD36 于血小板上的表達(dá)情況。運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)室建立的單核細(xì)胞檢測(cè)流式細(xì)胞熒光免疫檢測(cè)技術(shù)(monocyte immunoufluorescence test-flow cytometry，MIFT-FC)[11-12]檢測(cè)CD36于單核細(xì)胞上的表達(dá)情況。

1.3.2 全血DNA和全血總RNA抽提 研究對(duì)象血樣 DNA 使用 Pure gene DNA Purification Kit 試劑盒按照試劑盒說明書提取，于-20℃凍存?zhèn)溆?。?yīng)用傳統(tǒng)的手工TRIzol 法對(duì)研究對(duì)象的全血總RNA進(jìn)行抽提，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 CD36 基因檢測(cè) 按照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法[13-14]，對(duì)先證者及其女兒的CD36 基因(參考序列：NG_008192.1，下同)外顯子3～14進(jìn)行測(cè)序，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲取包含CD36 mRNA(參考序列：NM_000072.3，下同)開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)序列全段的cDNA(簡稱 CD36 cDNA)，構(gòu)建包含 CD36 cDNA 和熒光報(bào)告基因EGFP的pLV4/StripII-HIS10真核表達(dá)質(zhì)粒(簡稱CD36-EGFP質(zhì)粒)后，篩選培養(yǎng)，挑取克隆菌落，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證為陽性菌落后，擴(kuò)大培養(yǎng)陽性菌落，應(yīng)用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行克隆測(cè)序。

1.3.4 真核穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立 按本實(shí)驗(yàn)室建立方法[14-15]，將CD36-EGFP真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入CHO-K1細(xì)胞系，篩選和建立包含CD36 cDNA轉(zhuǎn)錄本變異體的真核表達(dá)細(xì)胞株(MT-CD36 細(xì)胞株)，并建立作為下一步蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照的含有CD36 cDNA野生型轉(zhuǎn)錄本的真核表達(dá)細(xì)胞株(WT-CD36 細(xì)胞株)，和作為蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照的僅含EGFP基因的真核表達(dá)細(xì)胞株(EGFP-細(xì)胞株)。對(duì)建立并且篩選成功的細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞株總RNA抽提，通過反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增測(cè)序驗(yàn)證所建立細(xì)胞株對(duì)所轉(zhuǎn)染的目的基因的表達(dá)情況。

1.3.5 Western Blot 蛋白印跡驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)參考文獻(xiàn)[14]的方法，應(yīng)用Mem-PERTM Plus 試劑盒提取上述構(gòu)建成功細(xì)胞株的細(xì)胞膜蛋白，并使用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上述建立細(xì)胞株的CD36蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 CD36 表型檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)MAIPA、PIFT-FC和MIFT-FC 檢測(cè)，先證者的CD36 在血小板和單核細(xì)胞上均不表達(dá)，為Ⅰ型CD36 缺失；CD36 在其女兒的血小板和單核細(xì)胞上均呈陽性表達(dá)，為CD36 表達(dá)陽性個(gè)體，見圖1。

圖1 CD36表型分析結(jié)果

2.2 CD36 外顯子測(cè)序結(jié)果 先證者于CD36 外顯子4 中有CD36c.T200A 突變雜合子，其他外顯子3及5～14 均未發(fā)現(xiàn)基因突變；其女兒CD36的外顯子3～14中未發(fā)現(xiàn)基因突變，見圖2。

圖2 CD36外顯子測(cè)序結(jié)果

2.3 CD36 cDNA克隆測(cè)序結(jié)果 先證者包含兩種CD36 mRNA 轉(zhuǎn)錄本：CD36 c.T200A(p.Ile67Asn)(Gen-Bank的注冊(cè)號(hào)：HM217022.1)轉(zhuǎn)錄本變異體和CD36的野生型轉(zhuǎn)錄本；其女兒只有野生型CD36mRNA 轉(zhuǎn)錄本，見圖3。

圖3 先證者CD36 cDNA克隆測(cè)序結(jié)果

2.4 真核表達(dá)細(xì)胞株的建立結(jié)果 成功建立了表達(dá)CD36c.200T＞A轉(zhuǎn)錄本變異體的真核表達(dá)細(xì)胞株(MT-CD36細(xì)胞株)、表達(dá)CD36野生型轉(zhuǎn)錄本的真核表達(dá)細(xì)胞株(WT-CD36 細(xì)胞株)和僅表達(dá)EGFP 熒光報(bào)告基因的真核表達(dá)細(xì)胞株(EGFP-細(xì)胞株)，并通過mRNA的逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增測(cè)序驗(yàn)證，比對(duì)細(xì)胞株mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA和轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的目的基因片段，結(jié)果顯示所建立的細(xì)胞株所表達(dá)的CD36cDNA序列或/和EGFP基因序列與轉(zhuǎn)染的基因片段均一致，比對(duì)結(jié)果見圖4和圖5。

圖4 所建立的真核表達(dá)細(xì)胞株CD36 cDNA 與轉(zhuǎn)入質(zhì)粒CD36 cDNA目的片段電泳結(jié)果

圖5 所建立的真核表達(dá)細(xì)胞株CD36 cDNA 與轉(zhuǎn)入質(zhì)粒CD36 cDNA目的片段測(cè)序結(jié)果比對(duì)

2.5 Western blot 蛋白印跡驗(yàn)證結(jié)果 所建立的MT-CD36細(xì)胞株和陰性對(duì)照EGFP-細(xì)胞株的CD36蛋白表達(dá)為陰性，而陽性對(duì)照WT-CD36 細(xì)胞株CD36 蛋白表達(dá)為陽性，見圖6。

圖6 Western blot蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

人CD36 基因全長32 Kb，位于常染色體7q11.2上，含有15個(gè)外顯子。其中外顯子3～14編碼CD36蛋白，所編碼的CD36蛋白由472個(gè)氨基酸組成[14]。目前已報(bào)道的有超過40 個(gè)基因突變可導(dǎo)致CD36 缺失，基因突變有多種形式，包括單核苷酸取代、堿基插入、堿基缺失及mRNA 剪切加工中的外顯子跳讀等[14，16-17]。本研究在廣西CD36缺失的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可導(dǎo)致CD36 缺失的 CD36 基因新突變 c.T200A(p.Ile67Asn)，并探討其導(dǎo)致CD36缺失的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

該CD36基因新突變被發(fā)現(xiàn)于一名廣西壯族女性個(gè)體，其CD36 表型經(jīng)檢測(cè)鑒定為Ⅰ型CD36 缺失，即血小板和單核細(xì)胞上的CD36表達(dá)均缺失。為探索該個(gè)體CD36 缺失的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，本研究分別從DNA和mRNA水平進(jìn)行研究分析，在DNA水平，針對(duì)涉及編碼CD36蛋白的CD36外顯子3～14進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)先證者具有CD36 c.200T＞A 突變雜合子，該突變位于CD36 外顯子4 上。在mRNA 水平，通過CD36 cDNA克隆測(cè)序檢測(cè)，探討該個(gè)體CD36轉(zhuǎn)錄遺傳信息的變化情況，發(fā)現(xiàn)先證者攜帶有CD36 c.200T＞A轉(zhuǎn)錄本變異體(GenBank的注冊(cè)號(hào)：HM217022.1)和CD36野生型轉(zhuǎn)錄本等兩種mRNA 轉(zhuǎn)錄本，其中CD36c.200T＞A 轉(zhuǎn)錄本變異體可導(dǎo)致所編碼CD36 蛋白的第67位氨基酸由異亮氨基酸(Ile)變?yōu)樘於０?Asn)。

本研究通過建立真核表達(dá)細(xì)胞株和Western blot實(shí)驗(yàn)探討CD36 轉(zhuǎn)錄本變異體c.200T＞A(p.IIe67Asn)對(duì)CD36 蛋白表達(dá)的影響，確證了攜帶CD36 c.200T＞A轉(zhuǎn)錄本變異體的真核細(xì)胞株(MT-CD36細(xì)胞株)不表達(dá)CD36，而攜帶野生型CD36 轉(zhuǎn)錄本的真核表達(dá)細(xì)胞株的CD36表達(dá)為陽性，證實(shí)該CD36 mRNA轉(zhuǎn)錄本變異體可導(dǎo)致CD36 表達(dá)缺失，是CD36 新突變c.T200A(p.Ile67Asn)導(dǎo)致CD36缺失的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。在文獻(xiàn)報(bào)道中[1，13-14，20]，單位點(diǎn)的 CD36 雜合突變雜在 CD36Ⅰ型缺失個(gè)體、Ⅱ型缺失個(gè)體，以及CD36表達(dá)陽性個(gè)體中均有發(fā)現(xiàn)，這可能是由于不同個(gè)體間存在不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制所致[1，14，18-19]。本研究的Ⅰ型CD36缺失個(gè)體，具有單個(gè)位點(diǎn)的CD36 DNA突變雜合子(CD36 c.200T＞A)，其CD36 mRNA轉(zhuǎn)錄本包含了該位點(diǎn)的突變型轉(zhuǎn)錄本變異體和CD36 野生型轉(zhuǎn)錄本，最終CD36表達(dá)卻表現(xiàn)為Ⅰ型CD36缺失，這可能由于該個(gè)體中CD36 c.200T＞A突變型轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄表達(dá)占據(jù)優(yōu)勢(shì)而最終導(dǎo)致該個(gè)體表現(xiàn)為CD36表達(dá)缺失，這仍需進(jìn)一步研究和探討。

在先證者的家系調(diào)查中，其女兒未遺傳來自先證者的CD36突變基因，CD36表達(dá)為陽性。很遺憾由于先證者父母已過世，而其丈夫和兄弟姐妹等其他家系成員經(jīng)反復(fù)動(dòng)員均不同意提供樣本參加本研究，因此未能展開深入的家系調(diào)查。

由于人群多態(tài)性原因，不同人群中導(dǎo)致CD36 缺失的CD36基因突變特征有所不同，在非洲CD36缺失個(gè)體中，以c.975T＞C 突變的頻率最高，而在日本則以c.268C＞T 和 c.329_330del 突變最為常見[7]。在我國，LIU等[3]對(duì)來自我國吉林、山西、云南、貴州、青海、廣東等地獻(xiàn)血者開展的CD36 缺失的相關(guān)研究中，檢測(cè)到的 82 例 CD36 缺 失 個(gè) 體 中 ，以 329-330delAC 和1228-1239delATTGTGCCTATT最為常見；在廣西目前已報(bào)道的抗-CD36介導(dǎo)的血小板同種免疫案例，具有的 CD36 基因突變包括 c.380C＞T、c.329-330delAC、c.1156C＞T等[17]，研究并在廣西CD36缺失個(gè)體中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)可導(dǎo)致CD36 缺失的新突變?nèi)鏲.538 T＞C、c.430-1G＞C、c.1006+2T＞G等[13-14，20]。本研究是在廣西CD36 缺失個(gè)體人群中發(fā)現(xiàn)的又一個(gè)可導(dǎo)致CD36 缺失的基因新突變，CD36 基因突變的多樣性及陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的新突變體現(xiàn)了廣西地區(qū)導(dǎo)致CD36 缺失的CD36基因突變具有其獨(dú)特的人群特征。

綜上，本研究在廣西地區(qū)的1名壯族Ⅰ型CD36缺失個(gè)體中，發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)CD36 基因新突變c.T200A(p.Ile67Asn)(GenBank:HM217021.1)，其可導(dǎo)致 CD36 缺失，本研究的結(jié)果為中國人群導(dǎo)致CD36 缺失的分子基礎(chǔ)研究提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。