趙鑫丹 賈彩霞 肖敏 郝苑汝 翟梅枝

(遼寧省旱地農林研究所，朝陽，122000)(西北農林科技大學)

核桃(JuglansregiaL.)，又稱胡桃、羌桃，胡桃科(Juglandaceae)核桃屬(Juglans)落葉喬木。我國核桃種質資源豐富，種植范圍極廣，黑龍江、遼寧、湖北、陜西、云南、四川等22省市均有分布[1]。核桃營養(yǎng)價值豐富，含油率在60%～70%，其中油酸、亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸占90%以上，其次是蛋白質和碳水化合物，含量分別在15%和10%以上[2]。核桃具有多種生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、抑菌、抗炎、降脂、降血糖等，其抗氧化活性尤為突出，素有“抗氧化之王”之稱[3]。已有研究表明，核桃仁中90%抗氧化活性物質都來源于核桃內種皮[4]。Angeli et al.[5]研究發(fā)現核桃內種皮提取物可以清除自由基，對超氧陰離子及DPPH自由基清除能力半抑制質量濃度分別為80和48.35 mg/L。張澤生等[6]研究發(fā)現核桃內種皮提取物可以減輕D-半乳糖致衰小鼠的氧化損傷，顯著提高小鼠血清、肝臟和腦組織中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶活力和總抗氧化能力，并降低丙二醛質量摩爾濃度。研究發(fā)現，核桃內種皮抗氧化活性物質主要為鞣花酸[7]。

鞣花酸，化學式為C14H6O8，是一種天然多酚，沒食子酸的二聚衍生物。鞣花酸最早于1818年被法國化學家亨利·布拉科諾從五倍子中發(fā)現。鞣花酸抗氧化活性極強，還具有抗癌變、抗菌、抗腫瘤等生物活性[8]。肖玉欣等[9]發(fā)現鞣花酸可以抑制脂質過氧化，并可以通過調控線粒體功能發(fā)揮抗氧化活性。孫勛[10]研究發(fā)現鞣花酸可以抑制小鼠突觸丟失、神經元凋亡及氧化應激水平，表明鞣花酸是一種較好的具有亨廷頓舞蹈病治療潛力的天然化合物。鞣花酸有游離和縮合兩種形式，自然界中鞣花酸大部分以縮合形式存在，游離鞣花酸含量極少[11]，經加酸處理可使縮合態(tài)鞣花酸水解出來[12]，但核桃內種皮鞣花酸的酸水解工藝未見報導。課題組前期研究初步顯示，核桃內種皮醇提物的不同極性萃取物抗氧化活性不同，但以乙酸乙酯萃取物(EAE)抗氧化活性較好。在此基礎上，本研究擬利用HPLC法測定EAE中鞣花酸含量，通過酸水解下的單因素篩選和正交試驗，優(yōu)化酸水解提高鞣花酸得率的提取工藝，為核桃內種皮資源的高效開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

試驗材料：核桃采自西北農林科技大學山陽核桃試驗示范站，選擇‘香玲’、‘西林3號’等核桃良種采樣。堅果挑選大小基本一致且無病蟲害的果實，人工去青皮、去果殼、剝離內種皮，將內種皮陰干、粉碎，過60目篩，冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

所用試劑：色譜乙腈、色譜甲醇(安徽天地高純溶劑有限公司)、色譜甲酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)、均為色譜純；三氟乙酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、鹽酸、硫酸、醋酸、磷酸、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇(成都市科隆化學品有限公司)均為分析純；鞣花酸(上海源葉生物科技有限公司)分析標準品。

所用儀器：LC-15C高效液相色譜儀(島津企業(yè)管理中國有限公司)；HH-2電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；YJ-2004高速中藥粉碎機(濟南億健醫(yī)療設備有限公司)；ME104E電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.1 供試樣品制備

稱取核桃內種皮粉末10 g，加體積分數85%乙醇300 mL，53 ℃超聲輔助提取55 min后過濾，收集上清液，殘渣在相同條件下重復提取2次，合并3次上清液，減壓濃縮得醇提物[13-14]。將醇提物用蒸餾水溶解，依次分別用1.5倍體積的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇多次萃取至顏色很淡時，收集各萃取液，減壓濃縮得浸膏，根據前期試驗乙酸乙酯萃取物(EAE)抗氧化活性最強，故本試驗選取EAE備用。

1.2 試驗方法

EAE游離鞣花酸測定。準確稱取0.05 g EAE樣品，加入V(色譜甲醇)∶V(0.1%三氟乙酸)=4∶1溶液至50 mL；樣液用0.22 μm濾膜過濾，取濾液上機分析[15]。HPLC的色譜條件：WondaSil C18色譜柱(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，進樣體積20 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，采用V(0.1%甲酸水溶液)∶V(乙腈)=80∶20等度洗脫[16]。

EAE酸水解后游離鞣花酸測定。準確稱取0.05 g EAE樣品，加入2 mol/L三氟乙酸溶液至50 mL，90 ℃水浴2 h，冷卻后用色譜甲醇稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾，取濾液上機分析[15]。HPLC色譜條件同上。

鞣花酸標準曲線繪制。準確稱取10 mg鞣花酸標準品，加色譜甲醇至10 mL，得1 g/mL鞣花酸母液，用色譜甲醇將母液稀釋至鞣花酸質量濃度分別25、50、100、200、300、400、500 mg/L，0.22 μm濾膜過濾，取濾液上機分析。HPLC色譜條件同上。以峰面積(y)為縱坐標，鞣花酸濃度(x)為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸方程為：y=18.286x-350.52，R2=0.999 7。說明標準曲線回歸性良好，可以用于定量分析。

精密度試驗。取鞣花酸標準品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，計算相對標準偏差。

重復性試驗。精密稱取6份EAE樣品0.05 g，處理后按上述色譜條件進樣，記錄峰面積，計算相對標準偏差值。

穩(wěn)定性試驗。取處理后樣品，按上述色譜條件，在第0、4、6、8、12、24 h進樣，記錄峰面積，計算相對標準偏差值。

加標回收率試驗。精密稱取6份EAE樣品0.05 g，取處理后樣品，分別加入等量鞣花酸標準品，按上述色譜條件進行測定，計算加標回收率。

不同酸對EAE水解后游離鞣花酸質量分數的影響。準確稱取EAE樣品0.5 g，分別加入2 mol/L三氟乙酸、鹽酸、硫酸、醋酸、磷酸各50 mL，充分搖勻后放入水浴鍋90 ℃水解2 h，通過HPLC測定不同酸水解后樣品中游離鞣花酸質量分數。

水解時間對EAE水解后游離鞣花酸質量分數的影響。準確稱取EAE樣品0.5 g，加入2 mol/L三氟乙酸50 mL，充分搖勻后放入90 ℃水浴鍋，分別水解1、2、3、4、5 h，采用HPLC法測定不同時間水解后樣品中游離鞣花酸質量分數。

水解溫度對EAE水解后游離鞣花酸質量分數的影響。準確稱取EAE樣品0.5 g，加入2 mol/L三氟乙酸50 mL，充分搖勻后分別放入水浴鍋60、70、80、90、100 ℃水解2 h，采用HPLC測定樣品不同溫度水解后游離鞣花酸質量分數。

酸濃度對EAE水解后游離鞣花酸質量分數的影響。準確稱取EAE樣品0.5 g，分別加入1、2、3、4、5 mol/L三氟乙酸50 mL，充分搖勻后放入水浴鍋90 ℃水解2 h，采用HPLC測定樣品不同濃度酸水解后游離鞣花酸質量分數。

鞣花酸水解條件正交試驗。在單因素試驗的基礎上，以水解后游離鞣花酸質量分數為考察指標，選取三氟乙酸濃度、水解溫度和水解時間進行L9(34)正交優(yōu)化試驗，對水解內種皮EAE鞣花酸工藝進行優(yōu)化，確定內種皮鞣花酸水解的最佳工藝條件。因素水平設計如表1所示。

表1 正交試驗因素和水平

1.3 數據處理

測定設置3次重復試驗，試驗結果以(平均值±標準差)表示。采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析，Duncan法進行顯著性分析，Origin 9.1軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 酸水解前后游離鞣花酸質量分數

按上述色譜條件得到鞣花酸標準品、EAE水解前后樣品中游離鞣花酸質量分數色譜圖(圖1)。由圖1(A)可知，鞣花酸色譜峰峰形良好，無雜峰干擾，基線平穩(wěn)。根據峰面積及標準曲線計算游離鞣花酸質量分數，內種皮EAE酸水解前后游離鞣花酸分別為68.29、306.96 mg/g，水解后質量分數提高238.67 mg/g。這是由于加酸處理后樣品中結合態(tài)鞣花酸發(fā)生水解，使得游離鞣花酸質量分數由6.83%升高至30.70%，水解后游離鞣花酸得率是水解之前的4.49倍。說明加酸水解后可提高內種皮游離鞣花酸質量分數。為更好地提高EAE水解后游離鞣花酸得率，對EAE鞣花酸水解條件進行工藝優(yōu)化。

A、B、C分別代表鞣花酸標準品、EAE水解前后游離態(tài)鞣花酸質量分數的色譜圖；峰1為鞣花酸。

經方法學考察發(fā)現，其精密度、重復性和穩(wěn)定性試驗相對標準偏差(n=6)分別為0.92%、1.14%、1.38%。加樣回收率試驗結果見表2，鞣花酸加樣的平均回收率為98.18%，相對標準偏差為1.20%。這些都說明該方法下儀器精密度良好，方法準確、重復性好，供試樣品溶液在24 h內穩(wěn)定，此方法可用于核桃內種皮鞣花酸質量分數的定量測定與分析。

表2 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.2 內種皮鞣花酸水解工藝條件優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗

單因素對內種皮鞣花酸水解效果的影響見表3。由表3可知，在濃度為2 mol/L時，三氟乙酸水解后游離鞣花酸的質量分數高于其他酸處理(p<0.05)。三氟乙酸水解后游離鞣花酸質量分數達371.95 mg/g，醋酸水解后游離鞣花酸質量分數最低，為197.00 mg/g，僅為三氟乙酸水解后游離鞣花酸質量分數的52.96%。不同酸水解后游離鞣花酸質量分數由大到小依次為三氟乙酸、鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸。說明加入三氟乙酸水解可以使結合態(tài)鞣花酸較好地游離出來。因此，選取三氟乙酸為適宜的水解酸。不同濃度三氟乙酸處理對水解后游離鞣花酸質量分數的影響差異顯著(p<0.05)。當酸濃度<4 mol/L時，水解后鞣花酸的質量分數隨著酸濃度的增大而增加，酸濃度>4 mol/L鞣花酸質量分數呈下降趨勢。表明在一定范圍內提高酸濃度可以促進結合態(tài)鞣花酸的水解，但濃度過高會影響水解效果。因此選取4 mol/L三氟乙酸為適宜水解濃度。水解處理在1～3 h時，游離鞣花酸質量分數隨水解時間的延長而呈顯著上升趨勢(p<0.05)，水解1 h時游離鞣花酸質量分數為285.07 mg/g，水解3 h達到409.50 mg/g；當水解時間3～5 h時，游離鞣花酸質量分數稍有上升，差異不顯著，水解5 h時質量分數為409.85 mg/g，僅比水解3 h增加0.35 mg/g。說明水解3 h時供試樣品中結合態(tài)鞣花酸幾乎水解完全，故選取3 h為適宜的水解時間。水解溫度在60～80 ℃時，隨著溫度的升高，水解后游離鞣花酸質量分數稍有增加，差異不顯著，80 ℃水解后游離鞣花酸質量分數為246.85 mg/g，僅比60 ℃水解后游離鞣花酸質量分數高10.75 mg/g；而當溫度>80 ℃時，隨著溫度的升高游離鞣花酸質量分數呈顯著上升趨勢(p<0.05)，100 ℃水解后游離鞣花酸質量分數達394.54 mg/g，比80 ℃時高出147.69 mg/g。說明溫度升高有利于EAE中結合態(tài)鞣花酸的水解。因此選取100 ℃為適宜水解溫度。

表3 單因素試驗內種皮鞣花酸水解效果

注：表中數據為平均值±標準差；同組同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

綜上，就水解酸種類、酸濃度、水解溫度、水解時間對水解后游離鞣花酸質量分數的影響而言，選擇4 mol/L三氟乙酸水溶液、水解溫度100 ℃和水解3 h較好。

2.2.2 正交試驗優(yōu)化工藝條件

基于單因素試驗，以三氟乙酸濃度、水解溫度、水解時間進行的鞣花酸水解工藝條件正交優(yōu)化，結果見表4。由表4可看出，正交試驗極差(R)由大到小表現為A、B、C，表明各因素對內種皮鞣花酸水解的影響效果由大到小依次為三氟乙酸濃度、水解溫度、水解時間。通過k值比較得到鞣花酸水解的最佳工藝條件為A1B2C3，即三氟乙酸濃度3.5 mol/L、水解溫度95 ℃、水解時間3.5 h。

表4 正交試驗結果

由極差進行直觀分析，方便清晰，但無法確定是由因素水平變化引起試驗結果不同，還是由誤差導致的，因此對試驗結果進行方差分析(表5)。結果顯示，三氟乙酸濃度對鞣花酸水解影響顯著(p<0.05)，水解溫度及時間影響不顯著，這與極差分析結果一致。說明試驗結果是由因素、水平變化不同所致，故A1B2C3為內種皮鞣花酸水解的最佳工藝條件。

表5 正交試驗方差分析結果

2.3 試驗結果驗證

根據正交試驗得出的最佳水解工藝條件為A1B2C3，即三氟乙酸濃度3.5 mol/L、水解溫度95 ℃、水解時間3.5 h。正交試驗的最優(yōu)組合(A1B2C3)未在正交試驗設計表內，因此對最佳工藝組合進行驗證試驗，在此條件下進行3次平行驗證試驗，結果見表6，其色譜圖見圖2。

表6可看出，在正交試驗確定的最佳工藝組合下，3次重復試驗的游離鞣花酸質量分數在562.08～599.18 mg/g，平均值為573.01±20.94 mg/g，高于正交試驗結果中任一組合條件下鞣花酸質量分數，由此說明A1B2C3為核桃內種皮鞣花酸水解的最優(yōu)工藝條件。由A1B2C3工藝條件下驗證試驗3的色譜圖(圖2)可見，鞣花酸是主峰，峰形良好，無雜峰干擾，其他物質峰面積遠低于鞣花酸，說明該條件可作為內種皮鞣花酸的最優(yōu)水解條件。

表6 驗證試驗結果

圖2 優(yōu)化組合A1B2C3工藝條件下鞣花酸HPLC色譜圖

3 結論與討論

本試驗利用加酸方式水解內種皮中鞣花酸，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗確定水解內種皮鞣花酸的最佳工藝條件為：三氟乙酸濃度3.5 mol/L、水解溫度95 ℃、水解時間3.5 h，該條件下游離鞣花酸質量分數可達573.01 mg/g，是水解前游離鞣花酸質量分數(68.29 mg/g)的8.4倍。各因素對鞣花酸水解效果的影響由大到小為三氟乙酸濃度、水解溫度、水解時間。

利用HPLC法測定核桃內種皮鞣花酸質量分數，結果發(fā)現，鞣花酸在測定范圍內呈良好線性關系，平均加樣回收率為98.18%，相對標準偏差為1.2%，其方法簡單、重復性和穩(wěn)定性均較好，該法可用于測定核桃內種皮中鞣花酸的質量分數。

鞣花酸作為一種天然多酚二內酯，廣泛的分布在自然界中。自然界中多以結合態(tài)存在，游離的鞣花酸質量分數較低、提取率不高，采用溶劑提取法直接從植物中僅能提取出少量游離鞣花酸，而加酸水解后可大大提高鞣花酸產率[17]。加酸水解的原理是在酸性及加熱條件下，結合態(tài)鞣花酸中的酯鍵或苷鍵易斷裂，產生游離態(tài)鞣花酸[18]。楊媛等[15]研究發(fā)現利用溶劑提取法直接提取不同品種樹莓中鞣花酸，其游離鞣花酸質量分數僅為3.86～11.83 mg/kg，而加酸水解后鞣花酸質量分數可達37.58～125.60 mg/kg。楊笑笑等[17]采用正交試驗優(yōu)化石榴皮中鞣花酸水解工藝，得到的最佳工藝條件為：水解時間6 h，水解溫度100 ℃，濃硫酸濃度1.0 mol/L；各因素的影響效果由大到小為酸濃度、水解溫度、水解時間，本試驗得到結果與此一致，即酸濃度顯著影響鞣花酸的水解效果。本研究發(fā)現相同條件下，內種皮乙酸乙酯萃取物中加入硫酸水解后游離鞣花酸質量分數為267.94 mg/g，而加入三氟乙酸水解后游離鞣花酸質量分數為371.95 mg/g，說明加三氟乙酸的水解效果優(yōu)于加硫酸水解；從安全性而言，濃硫酸屬中等毒性物質，而三氟乙酸只有輕微毒性，因此選擇三氟乙酸作為水解酸來提高鞣花酸水解的安全性；從水解時間來看，本研究的最佳水解時間為3.5 h，相比前人對鞣花酸水解工藝條件的優(yōu)化，提高了工作效率。

比較鞣花酸質量分數測定方法發(fā)現，紫外分光光度法耗用溶劑少、分析成本較低，但雜質干擾大，結果準確度不高[19]；高效毛細管電泳法測量方法準確，但前處理復雜、耗時長且溶劑用量大[20]；而高效液相色譜法(HPLC)操作簡單、效率高、準確性好，是目前最常用的一種檢測方法[12]。潘遐等[21]利用HPLC法測定藏藥石榴蓮花散中鞣花酸質量分數，結果發(fā)現鞣花酸的質量分數和峰面積在測定范圍內線性關系良好，平均回收率98.2%，相對標準偏差2.8%，該方法簡便、準確、重復性好，結果可靠，可用于測定石榴蓮花散中鞣花酸質量。鄒園生等[16]利用HPLC法測定猴棗中鞣花酸的質量分數，結果發(fā)現鞣花酸在0.049 5～989.4 mg/L呈良好線性關系，平均加樣回收率為99.4%，相對標準偏差為1.2%，該方法簡單，準確，重復性好，具有良好的穩(wěn)定性，可用于猴棗藥材中鞣花酸質量分數的分析測定。本研究利用HPLC法測定核桃內種皮鞣花酸的質量分數，其方法簡單、重復性和穩(wěn)定性均較好，結果可靠，說明該法可用于測定核桃內種皮中鞣花酸的質量分數。