崔 鑫，張 成，席俊羽，謝瑀婷，劉 毅*，謝雁鳴*

基于真實(shí)世界與靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)聚類的茵梔黃顆粒治療黃疸的聯(lián)合用藥方案及分子機(jī)制分析

崔 鑫1，張 成1，席俊羽1，謝瑀婷2，劉 毅1*，謝雁鳴1*

1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700 2. 中國人民大學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)院，北京 100872

挖掘茵梔黃顆粒治療黃疸的核心聯(lián)用藥物方案的臨床應(yīng)用規(guī)律，為探索臨床不同診療思路、用藥經(jīng)驗(yàn)和提高中醫(yī)藥臨床證據(jù)的循證等級提供參考?；谌珖?9家醫(yī)院信息管理系統(tǒng)（hospital information system，HIS）黃疸患者的用藥數(shù)據(jù)，運(yùn)用Tabu搜索算法，對真實(shí)世界茵梔黃顆粒治療黃疸的聯(lián)合用藥情況進(jìn)行回顧性分析。同時(shí)，采用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析核心聯(lián)合用藥方案的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，并通過分子對接技術(shù)對其作用機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)Tabu搜索算法聚類分析的結(jié)果，結(jié)合肝病相關(guān)指南和文獻(xiàn)，識別出3種茵梔黃顆粒治療黃疸的核心聯(lián)用藥物方案：（1）針對藥物性肝損傷導(dǎo)致的黃疸，可以聯(lián)用谷胱甘肽；（2）針對膽汁淤積導(dǎo)致的黃疸，可以聯(lián)用亮菌甲素；（3）針對病毒性肝炎導(dǎo)致的黃疸，可以聯(lián)用雙環(huán)醇。3種方案的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制均具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，茵梔黃聯(lián)用谷胱甘肽治療黃疸的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制主要與機(jī)體的炎癥免疫、Toll樣受體信號通路傳導(dǎo)、谷胱甘肽代謝通路和細(xì)胞死亡負(fù)調(diào)控的生物過程有關(guān)；茵梔黃聯(lián)用亮菌甲素治療黃疸的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制主要與動(dòng)脈粥樣硬化、膽汁分泌等關(guān)鍵通路有關(guān)；茵梔黃聯(lián)用雙環(huán)醇治療黃疸的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制主要與上皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和癌癥相關(guān)的信號通路有關(guān)。數(shù)據(jù)挖掘得出的茵梔黃顆粒核心聯(lián)合用藥方案，基本符合相關(guān)指南及診療規(guī)范，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了探索，為優(yōu)化臨床聯(lián)合用藥、合理用藥提供了一定的指導(dǎo)和參考。建議臨床實(shí)際應(yīng)用過程中，根據(jù)黃疸的疾病進(jìn)展情況，合理評估臨床聯(lián)合用藥方案的療效及安全性，注意用藥配伍禁忌。

茵梔黃顆粒；黃疸；真實(shí)世界研究；聯(lián)合用藥；谷胱甘肽；亮菌甲素；雙環(huán)醇；黃芩苷；梔子苷；羥基乙酮；綠原酸

黃疸是由于人體內(nèi)膽紅素過量聚積所致，臨床以鞏膜、黏膜、皮膚黃染為主要表現(xiàn)[1]。黃疸多見于新生兒患者，嚴(yán)重的新生兒黃疸發(fā)病率和死亡率均較高[2]，印度新生兒黃疸的死亡率高達(dá)30.8%[3]。嚴(yán)重的新生兒黃疸是導(dǎo)致患兒長期神經(jīng)認(rèn)知功能障礙、腦癱、耳聾、學(xué)習(xí)困難等后遺癥的主要原因，給全球帶來了沉重的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。黃疸可由肝炎、肝硬化、肝癌、溶血性貧血等多種肝臟疾病引起[5]。目前成人黃疸的治療尚無廣泛認(rèn)可的臨床指南，一般以保肝降酶退黃為基本治則，同時(shí)針對不同病因進(jìn)行對癥治療[6]。對于新生兒黃疸的治療，英國國家衛(wèi)生與臨床優(yōu)化研究所于2014年6月發(fā)布了相關(guān)臨床指南，明確指出藍(lán)光照射是治療新生兒黃疸的安全有效療法；同時(shí)該指南還提出，在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中推薦使用中藥茵陳治療新生兒黃疸[7]。

茵梔黃顆粒來源于《傷寒論》的茵陳蒿湯，是中醫(yī)藥治療黃疸的代表性方劑，由茵陳、梔子、黃芩、金銀花四味中藥的提取物組成，具有利濕退黃、清熱解毒的功效[8]。臨床上主要用于治療黃疸和急、慢性肝炎[9]。研究表明茵梔黃顆粒能夠降低血清膽紅素水平[10]，并保護(hù)肝細(xì)胞，且目前未見不良事件/ 反應(yīng)報(bào)道[11]，臨床有效性、安全性較好。盡管茵梔黃顆粒在治療黃疸方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢，但其優(yōu)效的臨床聯(lián)合用藥方案尚不明確。本研究運(yùn)用Tabu搜索算法對茵梔黃顆粒治療黃疸的優(yōu)效聯(lián)合用藥方案進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，分析總結(jié)治療黃疸的核心藥物聯(lián)合茵梔黃顆粒的臨床應(yīng)用規(guī)律。同時(shí)，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探索優(yōu)效聯(lián)合用藥方案的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，并通過分子對接對其作用機(jī)制進(jìn)行初步驗(yàn)證。以期為探索臨床不同診療思路、用藥經(jīng)驗(yàn)，提高中醫(yī)藥臨床證據(jù)的循證等級提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究臨床聯(lián)合用藥數(shù)據(jù)由中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所建立的多維數(shù)據(jù)倉庫提供[12]，共提取了全國39家醫(yī)院信息管理系統(tǒng)（hospital information system，HIS）的1840例黃疸用藥患者的數(shù)據(jù)信息。

聯(lián)合用藥方案的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制分析中的藥物成分及其靶點(diǎn)來源于《中國藥典》2020年版、TCMSP數(shù)據(jù)庫、Drug Bank數(shù)據(jù)庫、SEA和Swiss Target Prediction平臺(tái)；黃疸相關(guān)的疾病靶點(diǎn)來源于OMIM數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫。蛋白質(zhì)相互作用（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)來源STRING數(shù)據(jù)庫。富集分析的生物過程和關(guān)鍵通路來源于g:Profiler和Matescape平臺(tái)。分子對接驗(yàn)證的三維分子結(jié)構(gòu)來源于ZINC及PubChem數(shù)據(jù)庫。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

將符合以下標(biāo)準(zhǔn)的患者定義為茵梔黃顆粒治療黃疸的有效人群：（1）符合《診斷學(xué)》第9版[13]中關(guān)于黃疸的診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者血清總膽紅素（total bilirubin，TBil）＞17.1 μmol/L（1.0 mg/dL）；（2）患者在住院期間使用了茵梔黃顆粒；（3）患者的治療結(jié)局為治愈或好轉(zhuǎn)。

以下藥物不納入分析：（1）各類溶媒，如葡萄糖、氯化鈉等；（2）各類維生素（如有研究證據(jù)表明某種維生素對黃疸治療有效，也可納入分析）；（3）未在茵梔黃顆粒用藥期間聯(lián)合使用的藥物。

1.3 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

由于各臨床醫(yī)院信息系統(tǒng)的設(shè)置及編碼規(guī)則存在差異，因此本研究運(yùn)用數(shù)據(jù)倉庫技術(shù)（extract-transform-load，ETL）將多元異構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，對提取的患者個(gè)人信息數(shù)據(jù)進(jìn)行離散化處理，進(jìn)而構(gòu)建統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)倉庫[14]。

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化根據(jù)統(tǒng)一制定的規(guī)則進(jìn)行，疾病的中醫(yī)診斷、證候根據(jù)《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)臨床診療術(shù)語》來統(tǒng)一[15]；疾病的西醫(yī)診斷按照《內(nèi)科學(xué)》第8版教材[16]和WHO制定的ICD-10編碼標(biāo)準(zhǔn)[17]進(jìn)行規(guī)范?；瘜W(xué)藥按照WHO制定的解剖-治療-化學(xué)的藥物分類系統(tǒng)（Anatomical Therapeutic Chemical，ATC）來統(tǒng)一編碼標(biāo)化[18]，中藥名稱的標(biāo)準(zhǔn)化主要參考《國家基本藥物目錄》[19]、《國家醫(yī)保目錄》[20]和《中國藥典》2020年版[21]。

1.4 篩選聯(lián)合用藥的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方法

本研究選用Tabu搜索算法對標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)倉庫構(gòu)建的復(fù)雜信息網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行結(jié)構(gòu)關(guān)系的劃分，將最終形成的指標(biāo)群數(shù)提前設(shè)定，通過最終形成的指標(biāo)群體的數(shù)集大小來判斷指標(biāo)群劃分，因此能夠真實(shí)反映各指標(biāo)之間客觀存在的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)關(guān)系[12]。通過Tabu搜索算法分析真實(shí)世界臨床聯(lián)合用藥的多層次結(jié)構(gòu)關(guān)系，進(jìn)而探索挖掘黃疸臨床優(yōu)效干預(yù)方案的藥物組成規(guī)律[22]。

1.5 分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制分析及驗(yàn)證方法

本研究首先從《中國藥典》2020年版分別收集核心聯(lián)合用藥方案中藥物的有效成分，并通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得中藥有效成分對應(yīng)的靶點(diǎn)，通過Drug Bank數(shù)據(jù)庫獲得化學(xué)藥對應(yīng)的靶點(diǎn)；通過OMIM數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得黃疸相關(guān)的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。然后，分別將核心聯(lián)合用藥方案干預(yù)黃疸的靶點(diǎn)映射至STRING數(shù)據(jù)庫獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治觥Ｗ詈?，通過g:Profiler平臺(tái)和Matescape平臺(tái)分析3種聯(lián)合用藥方案作用于黃疸的生物過程和關(guān)鍵信號通路。分子對接驗(yàn)證通過檢索ZINC及PubChem數(shù)據(jù)庫，分別獲取核心聯(lián)用藥物方案的有效成分和其關(guān)鍵靶點(diǎn)的三維分子結(jié)構(gòu)，利用軟件對其兩兩進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，并將其中對接較好的組合進(jìn)行可視化展示。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

本研究應(yīng)用SAS軟件（版本9.4，SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）對納入患者的一般特征進(jìn)行描述性分析。通過UCINET6軟件運(yùn)行Tabu算法。運(yùn)用Cytoscape軟件（V3.7.2）進(jìn)行分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制分析；PPI分析物種設(shè)置為人，PPI網(wǎng)絡(luò)置信度設(shè)置為0.4，度（degree）值設(shè)置為大于中位數(shù)，進(jìn)行關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選；基因本體論（gene ontology，GO）生物過程和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析按照≤0.01進(jìn)行關(guān)鍵通路篩選。運(yùn)用Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，并使用Pymol進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 納入人群和藥物統(tǒng)計(jì)

在數(shù)據(jù)集成倉庫中，共提取出黃疸的用藥人群1840例，其中治療結(jié)局為好轉(zhuǎn)或治愈人群共1557例。符合納排標(biāo)準(zhǔn)的聯(lián)用藥物共90種，包含中藥58種，化學(xué)藥32種。

2.2 藥物使用頻次統(tǒng)計(jì)

本研究篩選納入了使用頻次在10次及以上的藥物，共計(jì)53種。藥物使用頻次見表1，可見化學(xué)藥谷胱甘肽、甘草酸、抗壞血酸和中藥苦黃注射液、柴胡注射液、茵梔黃注射液使用頻次較高，是治療黃疸的常用藥物。

2.3 核心有效方案識別

2.3.1 藥物子群劃分 經(jīng)過測度分析，由53種中西藥構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)共劃分為12個(gè)子群，具體劃分結(jié)果見表2，其中方案組成中的藥物編號對應(yīng)藥物使用頻次統(tǒng)計(jì)表中的編號。

根據(jù)整體網(wǎng)絡(luò)密度、子網(wǎng)絡(luò)密度矩陣及關(guān)系矩陣，可以得出2、5、7、8、11、12的子群結(jié)構(gòu)之間有較緊密的結(jié)構(gòu)聯(lián)系，其中子群5、7與其他群的連邊數(shù)最多，表明它們與其他藥物子群聯(lián)系更為緊密，詳見圖1。

2.3.2 藥物子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 藥物子群展開網(wǎng)絡(luò)圖見圖2，其中藥物1-化學(xué)藥.谷胱甘肽、6-化學(xué)藥.亮菌甲素、15-化學(xué)藥.雙環(huán)醇與其他藥物的聯(lián)系較為緊密，是治療黃疸的核心藥物。

通過進(jìn)一步結(jié)合肝炎等與黃疸密切相關(guān)的疾病診療指南、現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[23-27]，以及這3種藥品的說明書，可以歸納得出茵梔黃顆粒治療黃疸的核心聯(lián)用優(yōu)效方案：（1）針對藥物性肝損傷導(dǎo)致的黃疸，可以聯(lián)用谷胱甘肽；（2）針對膽汁淤積導(dǎo)致的黃疸，可以聯(lián)用亮菌甲素；（3）針對病毒性肝炎導(dǎo)致的黃疸，可以聯(lián)用雙環(huán)醇。

表1 茵梔黃顆粒治療黃疸聯(lián)合藥物使用頻次

表2 中西藥物子群

圖1 藥物子群劃分網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制分析

2.4.1 藥物靶點(diǎn)收集 通過《中國藥典》2020年版獲得了茵梔黃顆粒組方中茵陳提取物、梔子提取物、黃芩提取物、金銀花提取物的有效成分，分別為羥基苯乙酮、梔子苷、黃芩苷、綠原酸，并通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查找這4種有效成分對應(yīng)的靶點(diǎn)。

圖2 藥物子網(wǎng)絡(luò)展開圖

經(jīng)查找共收集到梔子苷對應(yīng)靶點(diǎn)8個(gè)，分別是碳酸酐酶II（carbonic anhydrase II，CA2）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白（neuromodulin，GAP43）、膜相關(guān)磷脂酶B1（membrane-associated phospholipase B1，PLB1）、胰高血糖素（glucagon，GCG）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Mu-1（glutathione S-transferase Mu 1，GSTM1）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Mu-2（glutathione S-transferase Mu 2，GSTM2）；黃芩苷對應(yīng)靶點(diǎn)2個(gè)，分別是凝血因子Xa（coagulation factor Xa，F(xiàn)10）和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II（DNA topoisomerase II，TOP2A）。

由于羥基苯乙酮和綠原酸在TCMSP中未查詢到對應(yīng)的靶點(diǎn)，因此本研究分別運(yùn)用SEA和Swiss Target Prediction網(wǎng)頁分析工具進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，SEA平臺(tái)預(yù)測結(jié)果以＜0.05篩選具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的靶點(diǎn)，Swiss Target Prediction平臺(tái)預(yù)測結(jié)果以概率值（probability）大于0為標(biāo)準(zhǔn)，篩選可能成為目標(biāo)藥物成分靶點(diǎn)的結(jié)果，然后將2個(gè)平臺(tái)的預(yù)測結(jié)果合并后去重，最終得到羥基苯乙酮對應(yīng)靶點(diǎn)101個(gè)，綠原酸對應(yīng)靶點(diǎn)64個(gè)。

在DrugBank數(shù)據(jù)庫中分別檢索后得到谷胱甘肽藥物靶點(diǎn)41個(gè)，刪除1個(gè)來源不確定是否為人類的靶點(diǎn)（glutathione peroxidase），最終獲得40個(gè)靶點(diǎn)。由于亮菌甲素和雙環(huán)醇在數(shù)據(jù)庫中未檢索到藥物靶點(diǎn)，因此本研究分別運(yùn)用SEA和Swiss Target Prediction平臺(tái)進(jìn)行預(yù)測，最終獲得亮菌甲素藥物靶點(diǎn)40個(gè)，雙環(huán)醇藥物靶點(diǎn)42個(gè)。以本研究中的用藥方案、藥物、成分、疾病、靶點(diǎn)為節(jié)點(diǎn)，其相互關(guān)系為邊，構(gòu)建“用藥方案-藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”圖，見圖3。

2.4.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)收集 在OMIM數(shù)據(jù)庫檢索得到黃疸相關(guān)靶點(diǎn)140個(gè)。GeneCards數(shù)據(jù)庫初步檢索得到黃疸相關(guān)靶點(diǎn)3400個(gè)，通過2次篩選相關(guān)性評分（relevance score）不小于中位數(shù)的靶點(diǎn)，篩選獲得黃疸相關(guān)靶點(diǎn)699個(gè)。將2個(gè)數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)合并后去重，最終獲得652個(gè)黃疸的相關(guān)靶點(diǎn)。

2.4.3 藥物干預(yù)疾病的靶點(diǎn) 分別將3種聯(lián)合用藥方案的藥物靶點(diǎn)與黃疸的相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得茵梔黃顆粒聯(lián)合谷胱甘肽（聯(lián)合用藥方案1）干預(yù)黃疸靶點(diǎn)25個(gè)，茵梔黃顆粒聯(lián)合亮菌甲素（聯(lián)合用藥方案2）干預(yù)黃疸靶點(diǎn)22個(gè)，茵梔黃顆粒聯(lián)合雙環(huán)醇（聯(lián)合用藥方案3）干預(yù)黃疸靶點(diǎn)25個(gè)，見表3～5。

2.4.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與拓?fù)鋵傩苑治?分別將上述3種聯(lián)合用藥方案干預(yù)黃疸的靶點(diǎn)映射至STRING數(shù)據(jù)庫（檢索時(shí)間：2022年6月12日），獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?。茵梔黃顆粒聯(lián)合谷胱甘肽干預(yù)黃疸的PPI網(wǎng)絡(luò)由24個(gè)節(jié)點(diǎn)和102條邊構(gòu)成，其關(guān)鍵靶點(diǎn)為HMOX1、白蛋白（albumin，ALB）、半胱天冬酶-3（Caspase-3，CASP3）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP9）、Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2），見圖4-a；茵梔黃顆粒聯(lián)合亮菌甲素干預(yù)黃疸的分子網(wǎng)絡(luò)由22個(gè)節(jié)點(diǎn)和69條邊構(gòu)成，其關(guān)鍵靶點(diǎn)為TLR2、CASP3、ALB、HMOX1、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，ELANE），見圖4-b；茵梔黃顆粒聯(lián)合雙環(huán)醇干預(yù)黃疸的分子網(wǎng)絡(luò)由23個(gè)節(jié)點(diǎn)和109條邊構(gòu)成，其關(guān)鍵靶點(diǎn)為TLR2、ALB、CASP3、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（proto-oncogene tyrosine-protein kinase，SRC）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），見圖4-c。

圖3 “用藥方案-藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

表3 茵梔黃顆粒聯(lián)合谷胱甘肽干預(yù)黃疸的靶點(diǎn)

表4 茵梔黃顆粒聯(lián)合亮菌甲素干預(yù)黃疸的靶點(diǎn)

表5 茵梔黃顆粒聯(lián)合雙環(huán)醇干預(yù)黃疸的靶點(diǎn)

2.4.5 GO生物過程富集分析 運(yùn)用g:Profiler平臺(tái)分別對3種聯(lián)合用藥方案干預(yù)黃疸的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物過程富集分析，得到茵梔黃顆粒聯(lián)合谷胱甘肽干預(yù)黃疸的GO生物過程 25條，茵梔黃顆粒聯(lián)合亮菌甲素干預(yù)黃疸的GO生物過程15條，茵梔黃顆粒聯(lián)合雙環(huán)醇干預(yù)黃疸的GO生物過程30條，富集結(jié)果見圖5-a～c。可見，3種聯(lián)合用藥方案干預(yù)黃疸均主要參與機(jī)體的炎癥免疫、Toll樣受體信號通路傳導(dǎo)和細(xì)胞死亡負(fù)調(diào)控的生物過程。

2.4.6 KEGG信號通路富集分析 采用Matescape平臺(tái)對3種治療黃疸的聯(lián)合用藥方案的KEGG信號通路進(jìn)行富集分析，設(shè)置value cutoff為0.01，并繪制氣泡圖，見圖6～8。如圖顯示，茵梔黃顆粒聯(lián)用谷胱甘肽方案參與的關(guān)鍵信號通路有6條，茵梔黃顆粒聯(lián)用亮菌甲素、雙環(huán)醇的關(guān)鍵信號通路均各有5條；同時(shí)，3種干預(yù)方案的共有關(guān)鍵信號通路均與動(dòng)脈粥樣硬化、膽汁分泌有關(guān)。此外，聯(lián)用谷胱甘肽的用藥方案還包含谷胱甘肽代謝通路，聯(lián)用雙環(huán)醇的用藥方案還與上皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

2.5 分子對接驗(yàn)證

通過檢索ZINC及PubChem數(shù)據(jù)庫，分別獲取3種干預(yù)方案的有效成分黃芩苷、梔子苷、羥基苯乙酮、綠原酸及化學(xué)藥谷胱甘肽、亮甲菌素、雙環(huán)醇與關(guān)鍵靶點(diǎn)HMOX1、ALB、CASP3、MMP9、TLR2、ELANE、SRC、EGFR的三維分子結(jié)構(gòu)，利用Autodock Vina軟件進(jìn)行兩兩分子對接驗(yàn)證（表6），并將其中對接較好的組合使用Pymol進(jìn)行可視化展示（圖9、10）。由表6可知，除羥基苯乙酮和SRC組合之外，其他組合均可形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)（結(jié)合能＜?5.0 kcal/mol，1 kcal＝4.186 kJ）。由圖9、10可知，分子對接結(jié)果最好的成分依次是黃芩苷＞綠原酸＞梔子苷＞雙環(huán)醇＞亮甲菌素＞谷胱甘肽＞羥基苯乙酮，對接最好的靶點(diǎn)依次是ALB＞MMP9＞CASP3＞HMOX1＝EGFR＞ELANE＞TLR2＞SRC，對接最好的組合是ALB與黃芩苷的組合，其主要通過氫鍵和疏水口袋結(jié)合。

a-茵梔黃顆粒聯(lián)合谷胱甘肽 b-茵梔黃顆粒聯(lián)合亮菌甲素 c-茵梔黃顆粒聯(lián)合雙環(huán)醇 紅色圓形節(jié)點(diǎn)表示度值（degree）排名前5位的節(jié)點(diǎn)，即PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)；灰色線條代表各靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，線條粗細(xì)表示互作關(guān)系的綜合得分（combined score）大小

3 討論

目前國內(nèi)外尚無公認(rèn)的成人黃疸治療指南，對于黃疸的診治多從病因角度著手，常與肝病緊密聯(lián)系，其臨床優(yōu)效用藥方案仍在不斷探索中。茵梔黃顆粒作為臨床常用治療黃疸的中成藥，常與化學(xué)藥聯(lián)合使用。因此，在多中心、大樣本的電子病歷數(shù)據(jù)基礎(chǔ)之上，通過挖掘臨床常用的茵梔黃顆粒優(yōu)效聯(lián)合用藥方案，可以為黃疸的治療提供臨床實(shí)證經(jīng)驗(yàn)。本研究運(yùn)用Tabu搜索算法進(jìn)行聚類分析，并與現(xiàn)有肝病相關(guān)指南和文獻(xiàn)對比，識別出3種茵梔黃顆粒治療黃疸的核心聯(lián)用藥物方案：（1）針對藥物性肝損傷導(dǎo)致的黃疸，可以聯(lián)用谷胱甘肽；（2）針對膽汁淤積導(dǎo)致的黃疸，可以聯(lián)用亮菌甲素；（3）針對病毒性肝炎導(dǎo)致的黃疸，可以聯(lián)用雙環(huán)醇。

同時(shí)，本研究進(jìn)一步運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對上述3種核心聯(lián)用藥物方案的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制進(jìn)行了初步探索。藥物性肝損傷臨床可表現(xiàn)為無癥狀的肝生化指標(biāo)升高、肝細(xì)胞性黃疸、肝功能衰竭、慢性肝炎等。當(dāng)出現(xiàn)肝細(xì)胞性黃疸時(shí)，藥物性肝損傷的死亡率高達(dá)10%[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，茵梔黃顆粒聯(lián)用谷胱甘肽治療藥物性肝損傷可能通過干預(yù)核心靶點(diǎn)HMOX1、ALB、CASP3、MMP9、TLR2發(fā)揮作用，參與氧化應(yīng)激、核受體元通路（nuclear receptors meta-pathway，NRM）、谷胱甘肽代謝等關(guān)鍵通路。因此，該方案對黃疸的干預(yù)作用主要與機(jī)體的炎癥免疫、Toll樣受體信號通路傳導(dǎo)、谷胱甘肽代謝通路和細(xì)胞死亡負(fù)調(diào)控的生物過程有關(guān)。其中，HMOX1具有抗氧化作用，通過與抗氧化劑反應(yīng)元件（anti-oxidant response element，ARE）結(jié)合而誘導(dǎo)基因表達(dá)[28]；CASP3和MMP9是中成藥抗藥物性肝損傷的潛在核心靶點(diǎn)，可能與肝再生過程的正調(diào)控密切相關(guān)[29]。

膽汁淤積的標(biāo)志性指標(biāo)是堿性磷酸酶升高。在黃疸患者中，堿性磷酸酶升高可能代表彌漫性肝細(xì)胞功能障礙或嚴(yán)重的膽管阻塞，從而阻礙了足夠的膽汁流動(dòng)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)茵梔黃顆粒聯(lián)用亮菌甲素治療膽汁淤積性黃疸，可能通過干預(yù)核心靶點(diǎn)HMOX1、CASP3、ALB、TLR2調(diào)控流體切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、膽汁分泌等關(guān)鍵通路發(fā)揮作用，表明動(dòng)脈粥樣硬化、膽汁分泌異?？赡芘c梗阻性黃疸的發(fā)病有一定關(guān)聯(lián)。有研究證明，患有嚴(yán)重動(dòng)脈粥樣硬化的患者可能出現(xiàn)多個(gè)內(nèi)臟假性動(dòng)脈瘤，包括肝動(dòng)脈假性動(dòng)脈瘤出血成大血腫，從而導(dǎo)致梗阻性黃疸和急性胰腺炎[31]。

a-茵梔黃顆粒聯(lián)合谷胱甘肽干預(yù)黃疸的GO分析氣泡圖 b-茵梔黃顆粒聯(lián)合亮菌甲素干預(yù)黃疸的GO分析氣泡圖 c-茵梔黃顆粒聯(lián)合雙環(huán)醇干預(yù)黃疸的GO分析氣泡圖；氣泡顏色由淺到深表示P值由大到小，顏色越深顯著富集的程度越大；氣泡大小表示富集的基因數(shù)量，氣泡越大，富集的基因數(shù)量越多

圖6 茵梔黃顆粒聯(lián)用谷胱甘肽用藥方案的關(guān)鍵信號通路

圖7 茵梔黃顆粒聯(lián)用亮菌甲素用藥方案的關(guān)鍵信號通路

圖8 茵梔黃顆粒聯(lián)用雙環(huán)醇用藥方案的關(guān)鍵信號通路

針對病毒性肝炎所致黃疸，茵梔黃顆粒聯(lián)用雙環(huán)醇可能主要通過干預(yù)SRC、EGFR等核心靶點(diǎn)調(diào)控上皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和癌癥相關(guān)的信號通路而發(fā)揮干預(yù)作用。從病毒性肝炎到肝硬化再到肝癌的不同階段，患者在臨床上均可見黃疸。EGFR編碼的酪氨酸蛋白激酶在肝細(xì)胞中充當(dāng)丙型肝炎病毒的受體并促進(jìn)其細(xì)胞進(jìn)入[32]；SRC編碼原癌基因酪氨酸蛋白激酶是調(diào)節(jié)肝癌發(fā)病的重要基因，進(jìn)而通過調(diào)控關(guān)鍵通路對黃疸的病理機(jī)制產(chǎn)生影響[33]。

表6 茵梔黃顆粒聯(lián)合用藥方案的有效成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對接結(jié)合能

此外，本研究還通過分子對接對3種核心干預(yù)方案的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制進(jìn)行了初步驗(yàn)證。結(jié)果顯示，3種干預(yù)方案的有效成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)構(gòu)成的三維分子結(jié)構(gòu)中，對接最好的組合是ALB與黃芩苷的組合。研究顯示，ALB編碼人體白蛋白，有助于提升氧結(jié)合活性、膽紅素結(jié)合活性，還參與細(xì)胞對饑餓的反應(yīng)，維持線粒體位置和凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié)[34]；同時(shí)，其與肝膽系統(tǒng)癌癥有關(guān)，為肝病的生物標(biāo)志物。黃芩苷是黃芩的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等作用[35]，因此黃芩苷可以對（病毒性）肝炎和黃疸有直接的干預(yù)作用。綜上，通過3種茵梔黃顆粒聯(lián)合用藥方案共有的活性成分黃芩苷調(diào)控分子對接結(jié)果最佳的ALB靶點(diǎn)，可有效將膽紅素從循環(huán)白蛋白中置換出來，使循環(huán)中的游離膽紅素水平升高，緩解黃疸的臨床癥狀。

圖9 茵梔黃顆粒聯(lián)合用藥方案的有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對接結(jié)合能聚類熱圖

綠色小分子為黃芩苷，藍(lán)色大分子為ALB靶點(diǎn)，黃色虛線為氫鍵

在方法學(xué)方面，本研究創(chuàng)新性地將真實(shí)世界HIS系統(tǒng)數(shù)據(jù)采用Tabu搜索算法進(jìn)行聚類分析，測度子群結(jié)構(gòu)關(guān)系，同時(shí)融合靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與分子對接對茵梔黃顆粒干預(yù)黃疸的3種干預(yù)方案的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制進(jìn)行了分析及初步驗(yàn)證。一方面，與其他算法相比，Tabu搜索算法的優(yōu)勢在于可以通過迭代出的密度矩陣測度指標(biāo)群之間的關(guān)系，并且能應(yīng)用合理的參數(shù)設(shè)置，對指標(biāo)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行若干次的劃分，完成指標(biāo)集群和群間關(guān)系測度的數(shù)據(jù)整合，避免劃分過度或劃分不足導(dǎo)致的指標(biāo)節(jié)點(diǎn)分配不均衡的問題。另一方面，鑒于中醫(yī)藥臨床數(shù)據(jù)的“混雜性”“整體性”和“相關(guān)關(guān)系性”，在數(shù)據(jù)挖掘的核心聯(lián)合用藥方案基礎(chǔ)上，使用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和分子對接方法對3種聯(lián)合用藥方案的有效性作用機(jī)制進(jìn)行分析和初步驗(yàn)證，可以更好地支撐和佐證茵梔黃顆粒臨床診療黃疸的聯(lián)合用藥規(guī)律，進(jìn)而探索新的研究方向并為臨床實(shí)際問題的解決提供指導(dǎo)和參考。

在診療用藥方面，本研究運(yùn)用Tabu算法聚類得出的子群結(jié)構(gòu)關(guān)系，結(jié)合現(xiàn)有相關(guān)指南、文獻(xiàn)報(bào)道將黃疸劃分為3類，并歸納出對應(yīng)的精準(zhǔn)茵梔黃顆粒聯(lián)合用藥方案，針對不同類型的黃疸進(jìn)行傾向性、個(gè)體化治療，符合中醫(yī)“方對證，藥對癥”原創(chuàng)思維[36]和“態(tài)靶辨證”[37]，不僅能達(dá)到更好的治療效果，也為臨床精準(zhǔn)用藥方案的制定提供參考，同時(shí)符合中醫(yī)發(fā)展的歷史需求。此外，臨床聯(lián)合用藥還應(yīng)關(guān)注其安全性，重視聯(lián)用藥物的劑量和頻次。因此，臨床實(shí)際應(yīng)用過程中，應(yīng)根據(jù)患者的疾病進(jìn)展情況，合理評估臨床聯(lián)合用藥方案的療效及安全性，注意用藥配伍禁忌。建議未來研究者基于本研究進(jìn)一步開展高質(zhì)量的真實(shí)世界臨床研究，在科學(xué)合理的頂層設(shè)計(jì)下獲得更高級別的循證證據(jù)。

本研究是基于真實(shí)世界HIS數(shù)據(jù)庫的回顧性研究，運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)獲得的核心聯(lián)用藥物方案的有效性僅供臨床用藥參考。受限于回顧性研究的設(shè)計(jì)類型及HIS系統(tǒng)的樣本量，結(jié)果仍需進(jìn)一步前瞻性多中心、大樣本的臨床研究加以驗(yàn)證。同時(shí)，本研究的分子機(jī)制結(jié)果可能由于靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫的權(quán)重分配和混雜性存在一定的偏倚，因此結(jié)果的查全性和準(zhǔn)確性尚需指紋圖譜研究、基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)或生物樣本的高通量測序等方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Combination medication regimen and molecular mechanism analysis of Yinzhihuang Granule in treatment of jaundice based on real world and target network clustering

CUI Xin1, ZHANG Cheng1, XI Jun-yu1, XIE Yu-ting2, LIU Yi1, XIE Yan-ming1

1. Institute of Clinical Basic Medicine of Traditional Chinese Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China 2. School of Statistics, Renmin University of China, Beijing 100872, China

To mine the clinical application rules of Yinzhihuang Granule (茵梔黃顆粒) combined with drug regimen in the treatment of jaundice, so as to provide reference for exploring different clinical diagnosis and treatment ideas, medication experience and improving the evidence-based level of clinical evidence of traditional Chinese medicine.Based on the medication data of jaundice patients from 39 hospital information system (HIS) in China, the Tabu search algorithm was used to retrospectively analyze the combination medication of Yinzhihuang Granule in the treatment of jaundice in the real world. At the same time, the molecular network mechanism of the core drug combination regimen was analyzed by the target network, and the mechanism was verified by molecular docking technology.According to the results of Tabu search algorithm cluster analysis, combined with liver disease related guidelines and literature, three core combined drug schemes for Yinzhihuang Granule in the treatment of jaundice were identified: (1) For jaundice caused by drug-induced liver injury, glutathione could be combined; (2) For jaundice caused by cholestasis, armillarisin A could be combined; (3) For jaundice caused by viral hepatitis, bicyclol could be combined. The molecular network mechanism of the three regimentsall had the characteristics of multi-component, multi-target and multi-pathway. The molecular network mechanism of Yinzhihuang Granule combined with glutathione in the treatment of jaundice was mainly related to the body’s inflammation and immunity, Toll-like receptor signaling pathway, glutathione metabolism pathway and the biological process of negative regulation of cell death. The molecular network mechanism of Yinzhihuang Granule combined with armillarisin A in the treatment of jaundice was mainly related to key pathways such as atherosclerosis and bile secretion. The molecular network mechanism of Yinzhihuang Granule combined with bicyclol in the treatment of jaundice was mainly related to epithelial cell signal transduction pathway and cancer related signal pathway.The core drug combination regimen of Yinzhihuang Granule in this study basically conforms to the relevant guidelines and diagnosis and treatment norms, and its mechanism was explored, which provides certain guidance and reference for optimizing clinical drug combination and rational drug use. It is suggested that the efficacy and safety of clinical combined drug regimen should be reasonably evaluated according to the disease progression of jaundice in clinical practice, and the contraindications of medication compatibility should be paid attention.

Yinzhihuang Granule; jaundice; real world study; combination of drugs; glutathione; armillarisin A;bicyclol; baicalin; gardenin; hydroxy-ethyl ketone; chlorogenic acid

R285.64

A

0253 - 2670(2023)01 - 0210 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.023

2022-08-21

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC1707400）

崔 鑫，博士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥臨床評價(jià)方法學(xué)研究。E-mail: Xinroberttcm@hotmail.com

通信作者：劉 毅，醫(yī)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥臨床評價(jià)方法學(xué)研究。E-mail: 709473245@qq.com

謝雁鳴，首席研究員，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥臨床評價(jià)方法學(xué)研究。E-mail: ktzu2018@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]