劉佳莉，夏玉蘋，陳柳燕，劉舒寧，李健華，汝 梅*，李永華*

不同寄主植物桑寄生水提物對(duì)斑馬魚胚胎心臟發(fā)育毒性及機(jī)制研究

劉佳莉1, 2，夏玉蘋1，陳柳燕1，劉舒寧1，李健華3，汝 梅1*，李永華1*

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200 2. 廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200 3. 廣西梧州神農(nóng)良品農(nóng)業(yè)科技有限公司，廣西 梧州 543213

研究不同寄主植物桑寄生水提物對(duì)斑馬魚胚胎心臟發(fā)育毒性及其機(jī)制，為桑寄生用藥安全提供理論依據(jù)。以受精后6 h（6 h post fertilization，6 hpf）正常發(fā)育的斑馬魚胚胎為動(dòng)物模型，將桑樹、柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹6種寄主植物桑寄生水提物各設(shè)置低、中、高3個(gè)藥物濃度，分別處理斑馬魚胚胎，檢測(cè)72 hpf孵化仔魚的心臟形態(tài)、心率、心包面積、靜脈竇（sinus venosus，SV）和動(dòng)脈球（bulbus arteriosus，BA）間距、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性、心肌細(xì)胞的凋亡情況以及氧化應(yīng)激相關(guān)酶基因［、、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶2（glutathione S-transferase 2，）]、心臟發(fā)育相關(guān)基因[GATA結(jié)合蛋白5（GATA binding protein 5，）、NK2同源框5（NK2 homeobox 5，）、肌球蛋白重鏈6（Myosin，heavy chain 6，）]及心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因[B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，）]的表達(dá)水平。與空白組比較，除桑樹寄主桑寄生外，其他5種桑寄生水提物處理的斑馬魚胚胎均出現(xiàn)不同程度的心包水腫、心率降低、心包面積和SV-BA間距增大（＜0.05、0.01），SOD和CAT活性降低（＜0.05、0.01），、、、、、的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的上調(diào)或下調(diào)（＜0.05、0.01）。夾竹桃、苦楝和漆樹3種寄主桑寄生還觀察到心肌細(xì)胞凋亡，表達(dá)和/值明顯降低（＜0.05、0.01）。桑寄生對(duì)斑馬魚胚胎心臟發(fā)育毒性具有明顯的寄主相關(guān)性，除桑樹寄主桑寄生外，其他5種寄主桑寄生均表現(xiàn)出不同程度的心臟發(fā)育毒性，寄主植物不同，毒性機(jī)制也不同。

桑寄生；寄主；斑馬魚；心臟發(fā)育毒性；氧化應(yīng)激；凋亡

桑寄生為桑寄生科植物桑寄生(DC.) Danser的干燥帶葉莖枝，具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎元的功效，用于治療風(fēng)濕痹痛、腰膝酸軟、筋骨無力、崩漏經(jīng)多、妊娠漏血、安胎不動(dòng)、頭暈?zāi)垦５萚1]。桑寄生屬于半寄生植物藥材，其寄主植物種類具有復(fù)雜多樣性的生物特征，《中藥大辭典》記載其寄主植物種類有29科50余種[2]。朱開昕等[3]對(duì)廣西地區(qū)桑寄生寄主植物調(diào)查發(fā)現(xiàn)，廣西境內(nèi)的桑寄生寄主植物種類多達(dá)36科150多種。研究表明，寄主植物會(huì)通過向其桑寄生轉(zhuǎn)移屬于寄主植物的特征性成分從而對(duì)藥材質(zhì)量產(chǎn)生影響，包括轉(zhuǎn)移寄主植物有毒成分至桑寄生使藥材產(chǎn)生寄主樣毒性[4]?！吨袊幍洹吠ㄟ^對(duì)桑寄生進(jìn)行強(qiáng)心苷成分的排除性檢查，即僅排除可能來源于含強(qiáng)心苷的寄主植物的桑寄生，其他任何不含強(qiáng)心苷的寄主植物都有可能成為桑寄生藥材來源的寄主植物，桑寄生屬于多寄主植物種類來源的藥材。

臨床上強(qiáng)心苷通常用于慢性心力衰竭、心律失常等疾病治療，但其使用安全范圍十分狹窄并具有一定心臟毒性[5-6]?！吨袊幍洹?020年版要求對(duì)桑寄生進(jìn)行強(qiáng)心苷排除性檢查，其主要目的也是防范含強(qiáng)心苷寄主植物來源的桑寄生，尤其是將其作為安胎功效使用時(shí)，防范藥材可能發(fā)生胎兒心臟毒性。劉人源等[7]和柴子舒等[8]采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)來源于夾竹桃寄主的桑寄生和紅花寄生L.及其寄主夾竹桃進(jìn)行強(qiáng)心苷類化合物鑒定發(fā)現(xiàn)，夾竹桃寄主植物能將其特有的強(qiáng)心苷成分向桑寄生和紅花寄生轉(zhuǎn)移。周芳等[9]對(duì)來源于夾竹桃寄主紅花寄生對(duì)離體衰竭蛙心強(qiáng)心作用研究發(fā)現(xiàn)紅花寄生會(huì)表現(xiàn)出寄主樣的強(qiáng)心作用。本課題組前期采用桑樹、漆樹、油茶等6種寄主的桑寄生水提物對(duì)斑馬魚仔魚肝毒性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)除桑樹寄主桑寄生外，其他5種寄主桑寄生均表現(xiàn)出不同程度的肝臟毒性[10]。本研究對(duì)桑樹、柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生進(jìn)行斑馬魚胚胎心臟發(fā)育毒性研究，探討寄主對(duì)桑寄生心臟發(fā)育毒性影響及其機(jī)制，為規(guī)范寄主來源和保障桑寄生用藥安全提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

AB系野生型斑馬魚，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)中-加斑馬魚中藥篩選聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室提供，斑馬魚飼養(yǎng)及繁殖參照《》。將健康的雌雄AB系野生型斑馬魚成魚在28 ℃、光照14 h/黑暗10 h的條件下分開飼養(yǎng)，每天喂2次豐年蝦，實(shí)驗(yàn)前一晚，將健康的AB斑馬魚成魚，按雌雄1∶2放入底部有篩網(wǎng)的交配缸內(nèi)，用透明隔板隔開，次日清晨移除隔板，產(chǎn)卵1 h內(nèi)觀察產(chǎn)卵量并收集魚卵，用胚胎水沖洗數(shù)次，在體視顯微鏡下挑選受精發(fā)育正常的胚胎用于心臟發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥材

桑樹L.、柳樹L.、油茶Abel.、夾竹桃Mill.、苦楝L.和漆樹(Miq.) O. Kuntze 6種寄主桑寄生藥材，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)李永華研究員鑒定，其藥材基原植物為桑寄生科植物桑寄生(DC.) Danser，將采集的桑寄生樣品室溫陰干后再于45 ℃烘箱烘2 h，藥材密封保存，備用。樣品的采集信息見表1。

1.3 試劑

羧甲基纖維素鈉（批號(hào)20181113）購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；魚安定（批號(hào)212-956-8）購自常州桌燊醫(yī)藥化工材料有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)00422877）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Eastep?Super總RNA提取試劑盒（批號(hào)0000394772）、Go Taq?qPCR Master Mix（批號(hào)0000480098）購自普洛麥格生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號(hào)20200804）、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒（批號(hào)20200928、20200927）購自南京建成生物科技有限公司。

表1 不同寄主桑寄生藥材的樣品信息

1.4 儀器

Z-A-D5x型斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；EP64C型1/10萬電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；SZX2-ILLT型體視顯微鏡（日本Olympus公司）；M165FC型熒光立體顯微鏡（德國Leica公司）；SpecteaMax M5e型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices）；ST16R型低溫高速離心機(jī)、NanoDrop 2000型超微量分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Alpha 1-4LDplus型冷凍干燥機(jī)（上海博登生物科技有限公司）；Light Cycler 96型熒光定量PCR儀（Roche公司）。

2 方法

2.1 樣品制備

2.1.1 桑寄生水提物的提取與制備 分別稱取桑樹、柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹6種寄主桑寄生各75 g，分別加10、8、6倍量蒸餾水煎煮保持微沸狀態(tài)45 min，合并3次濾液，濃縮成為浸膏，冷凍干燥，分別得到桑樹、漆樹、油茶、柳樹、苦楝和夾竹桃寄主桑寄生水提物凍干粉末11.80、13.31、12.60、14.81、16.65、14.85 g。

分別準(zhǔn)確稱取桑樹、漆樹、油茶、柳樹、苦楝和夾竹桃6種寄主桑寄生水提物凍干粉末0.16、0.18、0.17、0.20、0.22、0.20 g（相當(dāng)于生藥1.00 g），分別加入胚胎水，超聲溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，定容，得生藥質(zhì)量濃度為10 mg/mL的水提物貯備液母液，分裝，凍存，備用。

2.1.2 斑馬魚胚胎水溶液配制 按照斑馬魚國際資源中心（Zebrafish International Resource Center）養(yǎng)殖要求配制斑馬魚胚胎水，配制磷酸氫二鈉0.25 mol/L、氯化鈉0.14 mol/L、氯化鉀5.40 mol/L、無水氯化鈣1.30 mol/L、磷酸二氫鉀0.44 mol/L、無水硫酸鎂1.00 mol/L、碳酸氫鈉4.20 mol/L的水溶液。

2.2 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚胚胎心臟發(fā)育的毒性劑量研究

2.2.1 桑寄生水提物對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性影響預(yù)實(shí)驗(yàn) 在體視顯微鏡下選取受精后6 h（6 h post fertilization，6 hpf）發(fā)育正常的斑馬魚胚胎，并轉(zhuǎn)移至含有不同質(zhì)量濃度桑寄生水提物胚胎水的12孔板中，每孔10枚胚胎，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h更換1次含相應(yīng)桑寄生藥液質(zhì)量濃度的胚胎水，培育至72 hpf，統(tǒng)計(jì)不同寄主桑寄生的斑馬魚胚胎孵化和胚胎死亡情況，得出6種寄主桑寄生水提物的斑馬魚胚胎最小全致死濃度（LC100）和最大全不致死濃度（LC0）。

2.2.2 桑寄生水提物對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性影響研究 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別在不同寄主桑寄生水提物的LC100與LC0范圍內(nèi)設(shè)置6個(gè)梯度藥物質(zhì)量濃度組，其中桑樹寄主桑寄生6個(gè)藥物質(zhì)量濃度組為9.00、8.00、7.00、6.00、5.00、4.00 mg/mL，柳樹寄主桑樹寄生6個(gè)藥物質(zhì)量濃度組為6.00、5.20、4.40、3.60、2.80、2.00 mg/mL，油茶寄主桑寄生6個(gè)藥物質(zhì)量濃度組為5.00、4.12、3.24、2.36、1.48、0.60 mg/mL，夾竹桃寄主桑寄生6個(gè)藥物質(zhì)量濃度組為2.00、1.70、1.40、1.10、0.80、0.50 mg/mL，苦楝寄主桑寄生6個(gè)藥物質(zhì)量濃度組為2.00、1.70、1.40、1.10、0.80、0.50 mg/mL，漆樹寄主桑寄生6個(gè)藥物質(zhì)量濃度組為0.60、0.52、0.44、0.36、0.28、0.20 mg/mL，空白組為不含有任何桑寄生藥物的胚胎水。每孔10枚，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔體積為4 mL，每隔24 h更換1次含有相應(yīng)藥物質(zhì)量濃度的胚胎水，72 h統(tǒng)計(jì)各質(zhì)量濃度斑馬魚胚胎孵化率和死亡率。通過Graphpad prism 8.0軟件繪制量-毒曲線，計(jì)算出6種寄主桑寄生水提物的斑馬魚胚胎10%致死濃度（LC10）。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)得出的LC0和LC10，確定開展斑馬魚胚胎心臟發(fā)育毒性研究的不同寄主植物桑寄生藥物劑量。

2.3 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚心臟毒性的影響

將不同寄主桑寄生水提物分別以1/2LC10、LC0和LC10設(shè)置為桑寄生水提物低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度組，以觀察各劑量組的心臟毒性情況，以不含任何桑寄生藥物的胚胎水為空白組。在體視顯微鏡下挑選受精后發(fā)育正常6 hpf的斑馬魚胚胎，隨機(jī)分組移入6孔板中，每孔30枚，每孔體積為6 mL，給藥后置28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔24 h更換1次含有相應(yīng)藥物質(zhì)量濃度的胚胎水，培養(yǎng)至72 hpf時(shí)移除藥液，用胚胎水清洗3次，滴入0.05%的魚安定溶液將其麻醉，用3%甲基纖維素鈉固定斑馬魚仔魚，仔魚側(cè)臥，在體視顯微鏡下觀察和拍照，并錄像記錄1 min內(nèi)斑馬魚仔魚心跳次數(shù)，用Image-J軟件測(cè)量仔魚心包面積和靜脈竇（sinus venosus，SV）和動(dòng)脈球（bulbus arteriosus，BA）間距。

2.4 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚體內(nèi)SOD和CAT活性的影響

給藥方法同“2.3”項(xiàng)，培養(yǎng)至72 hpf，移除藥液，用胚胎水清洗3次，將仔魚轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，每管80尾，在?80 ℃下貯存。加入裂解液將仔魚勻漿，離心取上清液，按照試劑盒說明書檢測(cè)各藥物組仔魚體內(nèi)SOD和CAT活性。

2.5 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚仔魚心肌細(xì)胞凋亡的影響

采用吖啶橙（acridine orange，AO）熒光染色法檢測(cè)不同藥物質(zhì)量濃度組仔魚心肌細(xì)胞凋亡情況。給藥方法同“2.3”項(xiàng)，培養(yǎng)至72 hpf，移除藥液，用胚胎水清洗3次，吸除胚胎水后每孔加入2 mL AO染色溶液（2.5 μg/mL），避光，放置培養(yǎng)箱中孵育30 min，用胚胎水清洗3次，滴入0.05%的魚安定溶液，將仔魚麻醉，轉(zhuǎn)移至含有3%甲基纖維素鈉水溶液的培養(yǎng)皿中，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚心臟發(fā)育毒性相關(guān)基因表達(dá)的影響

給藥方法同“2.3”項(xiàng)，培養(yǎng)至72 hpf，移除藥液，用胚胎水清洗3次，將仔魚轉(zhuǎn)入1.5 mL無酶EP管中，每個(gè)藥物組收集尾斑馬魚仔魚，在?80 ℃下貯存。使用Eastep?Super RNA提取試劑盒提取仔魚總RNA，調(diào)整總RNA濃度后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將不同組的等量總RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)相關(guān)基因的定量引物，引物序列見表2，作為內(nèi)參，用Go Taq?qPCR Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析相關(guān)基因的表達(dá)情況，兩步PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃、2 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s，45個(gè)循環(huán)，結(jié)果采用2?ΔΔCt法計(jì)算氧化應(yīng)激相關(guān)酶基因[、、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶2（glutathione S-transferase 2，）]、心臟發(fā)育相關(guān)基因[GATA結(jié)合蛋白5（GATA binding protein 5，）、NK2同源框5（NK2 homeobox 5，）、肌球蛋白重鏈6（Myosin，heavy chain 6，）]及心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因[B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，）]的表達(dá)水平。

表2 引物序列

2.7 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 不同寄主桑寄生水提物的斑馬魚胚胎心臟發(fā)育毒性劑量確定結(jié)果

根據(jù)毒性實(shí)驗(yàn)中桑寄生各劑量組的斑馬魚仔魚孵化和胚胎死亡統(tǒng)計(jì)結(jié)果，用GraphPad Prism 8.0軟件繪制量-毒曲線，見圖1，計(jì)算不同寄主桑寄生水提物的LC10。結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到桑樹、柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物的LC100、LC10和LC0。從表3可以看出，依據(jù)LC100和LC10判斷，6種寄主桑寄生的毒性大小依次為漆樹、苦楝、夾竹桃、油茶、柳樹和桑樹寄主的桑寄生。根據(jù)不同寄主桑寄生水提物的LC0和LC10，分別以其1/2LC10、LC0、LC10值設(shè)置為各寄主桑寄生水提物的低、中、高劑量組，以觀察各劑量組的心臟毒性情況。不同寄主桑寄生水提物的低、中、高質(zhì)量濃度如表4所示。

圖1 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的量-毒曲線

表3 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚胚胎72 hpf的LC100、LC10和LC0

表4 不同寄主桑寄生水提物3個(gè)藥物質(zhì)量濃度

3.2 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚仔魚心率的影響

心率是直接反映斑馬魚心臟功能是否正常的重要指標(biāo)，斑馬魚仔魚在正常發(fā)育下心率約為120次/min[11]。如表5所示，空白組斑馬魚仔魚心率為（125.20±9.27）次/min，與文獻(xiàn)報(bào)道[11]基本一致。與空白組比較，桑樹寄主桑寄生水提物低、中、高質(zhì)量濃度組仔魚心率均沒有明顯變化；柳樹和油茶寄主桑寄生水提物高質(zhì)量濃度組仔魚心率均明顯降低（＜0.01），低、中質(zhì)量濃度組仔魚心率則沒有明顯變化；苦楝、夾竹桃寄主桑寄生水提物中、高質(zhì)量濃度組仔魚心率均明顯降低（＜0.01），低質(zhì)量濃度組仔魚心率沒有明顯變化；漆樹寄主桑寄生水提物低、中、高質(zhì)量濃度組斑馬魚仔魚心率均明顯降低（＜0.01）。結(jié)果表明，除桑樹寄主桑寄生外，柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物均具有降低斑馬魚仔魚心率的作用，并表現(xiàn)出寄主和劑量的相關(guān)性。

3.3 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚仔魚心臟形態(tài)發(fā)育的影響

如圖2和表6所示，空白組仔魚心臟發(fā)育正常，心血管系統(tǒng)完好，未見心包水腫。與空白組比較，桑樹寄主桑寄生水提物低、中、高質(zhì)量濃度組仔魚心臟未出現(xiàn)心包水腫現(xiàn)象，心包面積和SV-BA間距沒有明顯變化；柳樹和夾竹桃寄主桑寄生水提物中、高質(zhì)量濃度組仔魚出現(xiàn)心包水腫現(xiàn)象，心包面積和SV-BA間距明顯增大（＜0.05、0.01），低質(zhì)量濃度組仔魚心包面積和SV-BA間距沒有明顯增大；苦楝寄主桑寄生水提物中、高質(zhì)量濃度組仔魚出現(xiàn)心包水腫現(xiàn)象，心包面積和SV-BA間距明顯增大（＜0.05、0.01），低質(zhì)量濃度組仔魚SV-BA間距明顯增大（＜0.01），但心包面積沒有明顯變化；油茶和漆樹寄主桑寄生水提物高質(zhì)量濃度組仔魚出現(xiàn)心包水腫，心包面積和SV-BA間距明顯增大（＜0.05、0.01），低、中質(zhì)量濃度組仔魚心包未出現(xiàn)心包水腫，心包面積和SV-BA間距沒有明顯變化。結(jié)果表明，除桑樹寄主桑寄生水提物外，柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚胚胎心臟發(fā)育表現(xiàn)出不同程度的毒性，出現(xiàn)心包水腫、心包面積和SV-BA間距增大，其毒性具有寄主和劑量的相關(guān)性。

表5 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚心率的影響 (, n = 10)

與空白組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

*0.05**0.01blank group, same as below tables

圖2 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚心臟形態(tài)的影響

表6 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚心包面積和SV-BA間距的影響(, n = 10)

3.4 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚仔魚SOD和CAT的影響

SOD和CAT是生物體內(nèi)抗氧化防御體系中的關(guān)鍵酶。如表7所示，與空白組比較，桑樹寄主桑寄生水提物低、中、高質(zhì)量濃度組仔魚SOD和CAT的活性沒有明顯變化；柳樹寄主桑寄生水提物低、中、高質(zhì)量濃度組仔魚SOD活性明顯降低（＜0.05、0.01），油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物中、高質(zhì)量濃度組仔魚SOD活性均顯著降低（＜0.05、0.01），但低質(zhì)量濃度組仔魚SOD的活性沒有明顯降低；柳樹、油茶和漆樹寄主桑寄生中、高質(zhì)量濃度組仔魚CTA活性明顯降低（＜0.01），低質(zhì)量濃度組仔魚體內(nèi)CAT活性沒有明顯降低；苦楝和夾竹桃寄主桑寄生水提物低、中、高質(zhì)量濃度組仔魚體內(nèi)CAT活性明顯降低（＜0.05、0.01）。結(jié)果表明，除桑樹寄主桑寄生外，柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物使斑馬魚SOD和CAT活性降低，也表現(xiàn)出寄主和劑量的相關(guān)性。

表7 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚SOD和CAT活性的影響(, n = 3)

3.5 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚仔魚心肌細(xì)胞凋亡的影響

AO染色30 min后在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚仔魚心肌細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果見圖3?？瞻捉M仔魚心肌細(xì)胞沒有觀察到片狀或點(diǎn)狀致密的黃綠色亮點(diǎn)，表明沒有存在心肌細(xì)胞凋亡。與空白組比較，桑樹、柳樹和油茶寄主桑寄生水提物低、中、高質(zhì)量濃度組仔魚心肌細(xì)胞未觀察到片狀或點(diǎn)狀致密的黃綠色亮點(diǎn)；夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物的中、高質(zhì)量濃度組仔魚心肌細(xì)胞觀察到片狀或點(diǎn)狀致密的黃綠色熒光亮點(diǎn)，低質(zhì)量濃度組仔魚心肌細(xì)胞觀察到稀疏點(diǎn)狀黃綠色熒光亮點(diǎn)。結(jié)果表明，桑樹、柳樹、油茶寄主桑寄生水提物不會(huì)導(dǎo)致斑馬魚仔魚心肌細(xì)胞凋亡，夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物導(dǎo)致斑馬魚仔魚心肌細(xì)胞凋亡。

圖3 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚心肌細(xì)胞凋亡的影響

3.6 不同寄主桑寄生水提物對(duì)斑馬魚胚胎心臟發(fā)育毒性相關(guān)基因表達(dá)的影響

3.6.1 對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響 如圖4所示，與空白組比較，桑樹寄主桑寄生水提物、、基因表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異；柳樹、夾竹桃和漆樹寄主桑寄生水提物、、基因表達(dá)明顯下調(diào)（＜0.05、0.01）；油茶寄主桑寄生水提物、基因表達(dá)明顯下調(diào)（＜0.05、0.01），基因表達(dá)明顯上調(diào)（＜0.01）；苦楝寄主桑寄生水提物、基因表達(dá)明顯下調(diào)（＜0.01），而基因表達(dá)沒有下調(diào)。結(jié)果表明，除桑樹寄主桑寄生水提物外，柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物導(dǎo)致斑馬魚出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)可能與、、基因表達(dá)有關(guān)，相關(guān)基因表達(dá)水平出現(xiàn)明顯的上調(diào)或下調(diào)，表現(xiàn)出具有寄主相關(guān)性。

與空白組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.6.2 對(duì)心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響 如圖5所示，與空白組比較，桑樹寄主桑寄生水提物、、基因表達(dá)沒有明顯差異；柳樹寄主桑寄生水提物基因表達(dá)明顯下調(diào)（＜0.05、0.01），、基因表達(dá)沒有明顯差異；油茶寄主桑寄生水提物基因表達(dá)明顯下調(diào)（＜0.01），、基因表達(dá)沒有明顯差異；夾竹桃寄主寄主桑寄生水提物、基因表達(dá)明顯下調(diào)（＜0.05、0.01），基因表達(dá)沒有明顯差異；苦楝寄主桑寄生水提物基因表達(dá)明顯下調(diào)（＜0.05、0.01），基因表達(dá)明顯上調(diào)（＜0.05），基因沒有明顯差異；漆樹寄主桑寄生水提物基因表達(dá)明顯下調(diào)（＜0.01），和基因沒有明顯差異。結(jié)果表明，除桑樹寄主桑寄生水提物外，柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物導(dǎo)致斑馬魚胚胎心臟發(fā)育異?？赡芘c、、基因表達(dá)有關(guān)，相關(guān)基因表達(dá)水平出現(xiàn)明顯的上調(diào)或下調(diào)，表現(xiàn)出具有寄主相關(guān)性。

圖5 不同寄主桑寄生組斑馬魚心臟發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)(, n = 3)

3.6.3 對(duì)心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 如圖6所示，與空白組比較，桑樹寄主桑寄生水提物組、基因表達(dá)上調(diào)（＜0.05、0.01），/值沒有明顯變化；柳樹和油茶寄主桑寄生水提物、基因表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異，/值沒有明顯差異；夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生基因表達(dá)下調(diào)（＜0.01），基因表達(dá)沒有明顯差異，/值明顯降低（＜0.05、0.01）。結(jié)果表明，除桑樹、柳樹、油茶寄主桑寄生水提物外，夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物誘導(dǎo)斑馬魚仔魚心肌細(xì)胞凋亡可能與、基因表達(dá)有關(guān)，相關(guān)基因表達(dá)水平或表達(dá)的比值出現(xiàn)明顯的下調(diào)或降低，表現(xiàn)出寄主相關(guān)性。

圖6 各寄生組斑馬魚心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)(, n = 3)

4 討論

心臟是斑馬魚胚胎發(fā)育過程中最早發(fā)育和發(fā)揮功能的器官，發(fā)育5 hpf后心臟祖細(xì)胞出現(xiàn)，22 hpf后心臟開始跳動(dòng)，72 hpf后心臟發(fā)育完全[12]，且斑馬魚心臟結(jié)構(gòu)與人心臟結(jié)構(gòu)相似[13]。斑馬魚胚胎透明，能直接在顯微鏡下觀察到其心臟大小、形態(tài)、心率的變化，成為評(píng)價(jià)藥物心臟毒性的理想動(dòng)物模型[14-15]。對(duì)于可能以安胎功效入藥使用的桑寄生而言，是否具有胚胎發(fā)育毒性，是桑寄生藥材質(zhì)量控制需要解決的首要問題。對(duì)于具有復(fù)雜寄主植物來源的桑寄生，《中國藥典》2020年版通過對(duì)藥材進(jìn)行強(qiáng)心苷的排除性檢查，即排除來自于含強(qiáng)心苷寄主植物的桑寄生可能造成的藥材心臟毒性。但是，除了含強(qiáng)心苷寄主植物的桑寄生具有心臟毒性外，其他不含強(qiáng)心苷的寄主植物桑寄生是否也有心臟毒性，為本研究的主要目的所在。

采用柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝、漆樹和桑樹6種寄主桑寄生對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行心臟發(fā)育毒性與機(jī)制研究，除夾竹桃有強(qiáng)心苷成分相關(guān)報(bào)道外[7-8]，其他5種寄主植物均未有任何相關(guān)研究報(bào)道。從6種寄主桑寄生的LC100和LC10可以看出，不含強(qiáng)心苷成分寄主（漆樹、苦楝）的桑寄生比含有強(qiáng)心苷成分夾竹桃寄主的桑寄生毒性強(qiáng)。除桑樹寄主桑寄生組斑馬魚未觀察到心臟發(fā)育毒性外，其他不含強(qiáng)心苷成分寄主（柳樹、油茶、苦楝和漆樹）的桑寄生與含強(qiáng)心苷成分夾竹桃寄主的桑寄生在處理斑馬魚胚胎后，均觀察到心包水腫、心包面積和SV-BA間距增大以及心率降低等異?，F(xiàn)象，表現(xiàn)出不同程度的心臟發(fā)育毒性。提示《中國藥典》對(duì)桑寄生進(jìn)行強(qiáng)心苷成分的排除性檢查，還不足以對(duì)有毒桑寄生的全面排除，表明規(guī)范寄主植物來源是實(shí)現(xiàn)桑寄生安全用藥的重要途徑。

SOD能夠清除動(dòng)物體內(nèi)活性自由基，CAT可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過氧化氫[16-17]。本研究檢測(cè)到除了桑樹寄主桑寄生外，其他5種寄主植物桑寄生處理的斑馬魚仔魚體內(nèi)SOD和CAT活性均表現(xiàn)出不同程度的顯著降低，表明斑馬魚仔魚所受氧化損傷超出其自我修復(fù)能力，并引發(fā)明顯毒性，本研究結(jié)果與斑馬魚胚胎長時(shí)間暴露在有毒物質(zhì)硝酸鉈和抗腫瘤藥物卡培他濱的環(huán)境中實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[18-19]。

心肌細(xì)胞凋亡是藥物誘發(fā)心臟毒性的重要毒性機(jī)制[20]。進(jìn)一步對(duì)6種寄主植物桑寄生水提物處理的斑馬魚仔魚的心肌細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，夾竹桃、苦楝和漆樹3種寄主桑寄生水提物會(huì)導(dǎo)致斑馬魚仔魚心肌細(xì)胞凋亡，而柳樹和油茶樹寄主桑寄生水提物表現(xiàn)出具有心臟發(fā)育毒性，卻未觀察到斑馬魚仔魚心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

本研究選擇了、、、、、、、8個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)，其中、、與氧化應(yīng)激有關(guān)[21]，、、與心臟發(fā)育有關(guān)[22]，、與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)[20]。結(jié)果顯示，除了桑樹寄主桑寄生藥材外，其他5種寄主桑寄生水提物處理的斑馬魚胚胎，上述8種基因出現(xiàn)不同程度的表達(dá)水平異常，其中，與氧化應(yīng)激有關(guān)的基因、、在柳樹、油茶、夾竹桃、苦楝和漆樹5種寄主桑寄生處理的斑馬魚胚胎中表達(dá)異常，出現(xiàn)明顯的上調(diào)或下調(diào)，與這5種寄主植物桑寄生水提物處理的斑馬魚胚胎SOD和CAT活性降低、心包水腫和心率降低等結(jié)果一致，表明這5種寄主桑寄生心臟毒性可能與藥材造成的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。與心臟發(fā)育有關(guān)的基因、、在5種寄主植物桑寄生水提物處理的斑馬魚胚胎中也出現(xiàn)明顯的上調(diào)或下調(diào)，這5種寄主桑寄生可能會(huì)影響斑馬魚的心臟發(fā)育。與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因、在6種寄主桑寄生水提物處理的斑馬魚胚胎中，夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生水提物處理的斑馬魚胚胎基因表達(dá)明顯下調(diào)，/值明顯降低，而桑樹、柳樹和油茶樹桑寄生水提物處理的斑馬魚胚胎相關(guān)基因的表達(dá)則沒有表現(xiàn)出同樣的變化，心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)觀察到的心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象結(jié)果一致。

綜上所述，桑寄生心臟發(fā)育毒性具有寄主相關(guān)性，除桑樹寄主桑寄生外，其他5種寄主桑寄生均表現(xiàn)出不同程度的心臟發(fā)育毒性，其中，柳樹和油茶寄主桑寄生的心臟發(fā)育毒性可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)、心臟發(fā)育異常有關(guān)，而夾竹桃、苦楝和漆樹寄主桑寄生的心臟發(fā)育毒性則可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)、心臟發(fā)育異常、心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cardiac developmental toxicity and mechanism of aqueous extracts offrom different hosts in zebrafish embryo

LIU Jia-li1, 2, XIA Yu-ping1, CHEN Liu-yan1, LIU Shu-ning1, LI Jian-hua3, RU Mei1, LI Yong-hua1

1. Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 2. Guangxi Key Laboratory of Efficacy Study on Chinese Materia Medica, Nanning 530200, China 3. Guangxi Wuzhou Shennong LiangpinAgricultural Technology Co., LTd., Wuzhou 543213, China

To study the cardiac developmental toxicity and mechanism of aqueous extracts of Sangjisheng () from different hosts in zebrafish embryo, and provide theoretical basis for drug safety of.The normally developed zebrafish embryos at 6 h post fertilization (6 hpf) was used as the animal model. Zebrafish embryos were treated with low-, medium-, high-concentrations of aqueous extracts offrom(mulberry, THM),(willow, THW),(THC),(oleander, THO),(neem, THN) and(hoggum, THH). Then, heart morphology, heart rate, pericardial area, and sinus venosus-bulbus arteriosus (SV-BA) spacing length, activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), and cardiomyocytes apoptosis of zebrafish at 72 hpf were observed and measured. The expression levels of oxidative stress-related genes [,, glutathione S-transferase 2 ()], cardiac development-related genes [GATA binding protein 5(), NK2 homeobox 5(), myosin heavy chain 6 ()] and cardiomyocyte apoptosis-related genes [B-cell lymphoma-2 (), Bcl-2-related X protein ()] were detected.Compared with control group, except for the zebrafish of THM, the other five groups all presented pericardial edema, decreased heart rate, increased SV-BA in varying degrees (< 0.05, 0.01), activities of SOD and CAT were all reduced (< 0.05, 0.01),,,,andexpression levels were significantly up- or down-regulated (< 0.05, 0.01)Cardiomyocytes appeared apoptosis in the groups of THO, THN and THH,expression and/were also significantly decreased (< 0.05, 0.01).Cardiac developmental toxicity ofto zebrafish embryos is obviously host-dependent. Except for THM, the others all show varying degrees of cardiac developmental toxicity. The toxicity mechanism is also dependent on the host plants.

; host; zebrafish; cardiac developmental toxicity; oxidative stress; apoptosis

R285.5

A

0253 - 2670(2023)01 - 0160 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.019

2022-10-10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82160754）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81960722）；廣西科技基地和人才專項(xiàng)（桂科AD19245087）；中藥學(xué)廣西一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（桂教科研[2022]1號(hào)）；中藥學(xué)廣西一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（2018XK027，2019XK091，2019XK097）；廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目（JGY2020102）；廣西食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)制定計(jì)劃項(xiàng)目（2022007）

劉佳莉（1998—），碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制與中藥資源開發(fā)。E-mail: 2360535705@qq.com

通信作者：李永華（1964—），博士，研究員，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制與中藥資源開發(fā)。E-mail: liyonghua185@126.com

汝 梅（1987—），博士，講師，研究方向?yàn)樗幱弥参镔Y源與開發(fā)。E-mail: rumei2015@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]