牛壯偉，顏美秋，蘇 潔，汪晨興，韓麗萍，施夢琳，俞靜靜，陳素紅，呂圭源*

鐵皮石斛水提物對4T1乳腺癌荷瘤小鼠的抑瘤及免疫調(diào)節(jié)作用研究

牛壯偉1，顏美秋1，蘇 潔1，汪晨興1，韓麗萍1，施夢琳1，俞靜靜1，陳素紅2*，呂圭源1*

1. 浙江中醫(yī)藥大學藥學院，浙江 杭州 310053 2. 浙江工業(yè)大學，浙江 杭州 310014

研究鐵皮石斛水提物對4T1乳腺癌荷瘤模型小鼠的抑瘤及免疫調(diào)節(jié)作用，并進一步探討其作用機制。采用BALB/c雌性小鼠構(gòu)建4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型后，隨機分為模型組、鹽酸表柔比星組（8 mL/kg）和鐵皮石斛水提物低、中、高劑量（0.5、1.0、1.5 g/kg）組，另選10只正常BALB/c雌性小鼠作為對照組，給予相應(yīng)藥物進行干預，觀察小鼠生存狀態(tài)，每3天測量腫瘤直徑與短徑，連續(xù)給藥28 d后處死小鼠，稱定腫瘤質(zhì)量，計算抑瘤率；采用小動物活體成像儀和轉(zhuǎn)移灶計數(shù)觀察肺部腫瘤轉(zhuǎn)移情況；稱定小鼠脾臟、胸腺質(zhì)量，計算臟器系數(shù)；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腫瘤、肺部以及脾臟形態(tài)學變化；血液分析儀檢測荷瘤小鼠外周血中白細胞數(shù)目和淋巴細胞占比；ELISA法檢測血清中白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平；流式細胞術(shù)檢測外周血中T淋巴細胞比例；脾淋巴細胞增殖試驗檢測脾臟中T淋巴細胞、B淋巴細胞增殖能力；Western blotting檢測腫瘤組織中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路相關(guān)蛋白表達。與模型組比較，鐵皮石斛水提物組小鼠腫瘤生長趨勢放緩，腫瘤質(zhì)量減輕（＜0.01），腫瘤組織壞死細胞增多，腫瘤以及肺部轉(zhuǎn)移灶熒光強度顯著降低（＜0.05、0.01），肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)目減少（＜0.05、0.01）；脾臟、胸腺指數(shù)增加（＜0.05）；外周血中白細胞數(shù)目下降（＜0.01），淋巴細胞占比提高（＜0.05、0.01）；血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平增加（＜0.05、0.01）；外周血中CD3+T細胞占比升高（＜0.05），CD4+/CD8+值上升（＜0.01）；脾臟中T淋巴細胞、B淋巴細胞增殖能力提高（＜0.05）；腫瘤組織中PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達降低（＜0.05、0.01）。鐵皮石斛水提物可顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移，恢復荷瘤小鼠免疫功能，其機制可能與下調(diào)PI3K/Akt/mTOR通路表達相關(guān)。

鐵皮石斛；乳腺癌；免疫調(diào)節(jié)；T淋巴細胞；PI3K/Akt/mTOR信號通路

據(jù)國際權(quán)威癌癥研究中心最新發(fā)布數(shù)據(jù)表明，惡性腫瘤已成為造成人類死亡的首要原因。乳腺癌是其中發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，每年預估新發(fā)病例230萬人，且發(fā)病率呈低齡化、快增長的趨勢[1]。目前，臨床上對惡性腫瘤的治療方式常以放化療為主，但現(xiàn)有化療藥物在抑制腫瘤生長同時對機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不同程度的破壞，從而嚴重影響患者的生存質(zhì)量，在一定程度上限制了臨床應(yīng)用范圍和長期使用[2]。因此，尋找安全有效輔助抗腫瘤藥物亟為重要。

《醫(yī)宗必讀》曰：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”。中醫(yī)學認為“正氣內(nèi)虛”是腫瘤發(fā)生的內(nèi)在病機[3]。因此，扶正補虛是中醫(yī)藥治療腫瘤的基本原則。扶助正氣，補益虛弱，可達到實現(xiàn)提高機體免疫功能、加強抵御和祛除病邪能力、抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展、改善患者臨床癥狀的目的。鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛Kimura et Migo的干燥莖，其主要活性成分為多糖、聯(lián)芐、黃酮、生物堿等化學成分?，F(xiàn)代藥理學研究表明，鐵皮石斛具有增強免疫、調(diào)節(jié)基礎(chǔ)代謝及輔助抗腫瘤等作用[4-7]。本研究以4T1乳腺癌荷瘤模型小鼠為研究對象，初步探討鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠的抑瘤作用及其免疫功能的影響，分析鐵皮石斛抗乳腺癌的分子機制，為其進一步應(yīng)用于腫瘤臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株

4T1-luc鼠源乳腺癌細胞株由浙江中醫(yī)藥大學高建莉研究員惠贈。用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1.2 動物

SPF級雌性BALB/c小鼠60只，體質(zhì)量（20±2）g，購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（浙）2020-0002。動物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物實驗室，室溫（25±2）℃，相對濕度（55±5）%，自然晝夜節(jié)律光照環(huán)境下自由進食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。動物實驗經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學實驗動物管理與倫理委員會批準（批準號ZSLL-2017-023）。

1.3 藥材

鐵皮石斛由浙江韻芝堂生物科技有限公司提供，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學黃真教授鑒定為蘭科植物鐵皮石斛Kimura et Migo的干燥莖。

1.4 藥品與試劑

注射用鹽酸表柔比星（批號DP2202）購自輝瑞制藥有限公司；Anti-Mouse CD3e（批號A20125）、Anti-Mouse CD45（批號A10734）、Anti-Mouse CD8a（批號A10843）、Anti-Mouse CD4（批號A10755）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）ELISA試劑盒（批號A202H11231）、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）ELISA試劑盒（批號A280H10842)、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號A282H11225）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；刀豆蛋白A（Con A，批號317T033）購自北京索萊寶科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批號21145395）購自北京蘭杰柯科技有限公司；電泳液（批號121120210422）、轉(zhuǎn)膜液（批號022021219719）購自碧云天生物技術(shù)研究所；磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抗體（批號42527P）、p-PI3K抗體（批號4228L）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（批號4691T）、p-Akt抗體（批號4060T）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抗體（批號2983P）購自美國CST公司；兔源β-actin抗體（批號B9901）購自美國Immuno Way公司；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號HP0119）購自杭州華安生物科技有限公司；D-熒光素鉀鹽（批號K903568）購自上海笛柏生物科技有限公司。

1.5 儀器

LSRFortessa流式細胞分析儀（美國BD公司）；UV-3600型紫外可見近紅外光譜儀（日本島津公司）；Aniview600型多模式動物活體成像儀（廣州博鷺騰生物科技有限公司）；XT-2000i型全自動血液分析儀（日本SYSMEX株式會社）；Tissue-TekVIP5Jr型自動脫水機（日本櫻花檢驗儀器株式會社）；MEIKOEC360型包埋機（德國MEIKO公司）；LeicaM2245型半自動切片機（德國Leica公司）；FLIR ONE Pro熱成像儀（美國FLIR公司）；Powerwave 340型酶標儀（美國Bio-Tek公司）；EPS300型電泳儀（上海天能科技有限公司）；QuickChemi5200型化學發(fā)光成像儀（杭州莫納生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 鐵皮石斛水提物的制備

取鐵皮石斛適量，加入12倍量水浸泡30 min，煎煮1 h，濾過；藥渣同法再煎煮1次，合并濾液，60 ℃減壓濃縮至0.1 g/mL。采用苯酚-硫酸法測定0.1 g/mL的鐵皮石斛水提物中總多糖含量，紫外檢測波長為488 nm。以葡萄糖標準品質(zhì)量濃度為橫坐標（），吸光度（）為縱坐標（），線性回歸方程為＝0.057 5－0.006 1（2＝0.998 1），計算得出鐵皮石斛水提物中總多糖質(zhì)量濃度為（14.93±0.40）mg/mL。臨用前用超純水稀釋至給藥劑量。

2.2 荷瘤小鼠模型建立

在每只小鼠的右側(cè)倒數(shù)第二脂肪墊皮膚部位進行脫毛，在小鼠脫毛部位sc 0.1 mL 4T1-luc乳腺癌細胞（5×106個/mL），48 h后觀察接種部位若有2 mm×2 mm粉紅色小突起，即表明4T1乳腺癌荷瘤小鼠造模成功。隨機選取10只正常小鼠在相應(yīng)部位sc 0.1 mL生理鹽水作為對照組。

2.3 分組與給藥

4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型構(gòu)建成功后，根據(jù)小鼠體質(zhì)量和結(jié)節(jié)大小，隨機分為模型組、鹽酸表柔比星（EPI，8 mL/kg）組和鐵皮石斛低、中、高劑量（0.5、1.0、1.5 g/kg）組，每組10只。鐵皮石斛組ig鐵皮石斛水提物，對照組和模型組ig等體積純水，1次/d；EPI組ip藥物，1次/周，連續(xù)給藥28 d。給藥期間，觀察小鼠體質(zhì)量、精神狀態(tài)、毛發(fā)、行動等一般指征情況，通過FLIR-Tools熱成像儀觀察小鼠體表溫度。

2.4 檢測腫瘤生長體積和抑瘤率

從給藥第1天起，每3天用游標卡尺測量1次荷瘤小鼠的腫瘤長徑（）和短徑（），計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剝離腫瘤稱定質(zhì)量（），計算各給藥組抑瘤率。

腫瘤體積＝(×2)/2

抑瘤率＝1－給藥/模型

2.5 小動物活體成像和肺部轉(zhuǎn)移灶計數(shù)檢測肺部腫瘤轉(zhuǎn)移

給藥4周后，各組小鼠ip D-熒光素鉀鹽（150 mg/kg），使用異氟烷對小鼠進行麻醉，10 min后將其置于小動物活體成像儀中，檢測荷瘤小鼠肺部腫瘤轉(zhuǎn)移情況，使用Anview軟件對肺部轉(zhuǎn)移灶的熒光值進行定量評價。

末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，摘取小鼠肺臟，用生理鹽水沖洗表面血跡，10%福爾馬林溶液灌注固定24 h后，計算肺部表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。本研究采用的轉(zhuǎn)移灶評級為4級：I級，直徑＜0.5 mm；II級，0.5 mm≤直徑＜1 mm；III級，1 mm≤直徑＜2 mm；IV級，直徑≥2 mm。

總轉(zhuǎn)移數(shù)＝I級結(jié)節(jié)個數(shù)×1＋II級結(jié)節(jié)個數(shù)×2＋III級結(jié)節(jié)個數(shù)×3＋IV級結(jié)節(jié)個數(shù)×4

2.6 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腫瘤、肺部和脾臟組織病理變化

取各組小鼠腫瘤、肺部、脾臟組織放入10%福爾馬林溶液固定48 h后，脫水、包埋、切片、HE染色、封片，最后于顯微鏡下觀察形態(tài)學變化。

2.7 脾臟和胸腺指數(shù)測定

末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，摘取小鼠脾臟、胸腺，稱定質(zhì)量，計算臟器系數(shù)。

臟器系數(shù)＝臟器質(zhì)量/體質(zhì)量

2.8 血液分析儀檢測外周血中白細胞數(shù)目及淋巴細胞占比

給藥3周后，小鼠眼眶取血，置于EDTA抗凝管中，使用全自動血液分析儀測定小鼠外周血中白細胞數(shù)目及淋巴細胞占比。

2.9 ELISA法檢測血清中細胞因子水平

末次給藥24 h后，小鼠眼眶取血，3500 r/min離心15 min，分離血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-2、TNF-α和IFN-γ水平。

2.10 流式細胞術(shù)檢測外周血中T淋巴細胞的比例

給藥3周后，小鼠眼眶取血，取50 μL置于流式管中，設(shè)置空白管、單染管、樣本管?？瞻坠懿患涌贵w、單染管加入相對應(yīng)的抗體，樣本管加入抗體FITC-CD45、VF450-CD3、PE-cy7-CD4、Percp5.5-CD8混勻，4 ℃避光孵育15 min，加入1×Lysing Buffer，4 ℃避光孵育20 min，1500 r/min離心5 min，棄上清，加入350 μL PBS重懸后，上機檢測CD3+、CD4+、CD8+細胞，并計算CD4+/CD8+值。

2.11 脾臟淋巴細胞增殖實驗

無菌摘取各組小鼠1/3脾臟，過200目細胞篩，加入2 mL紅細胞裂解液，室溫裂解15 min，1500 r/min離心5 min，棄上清，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基清洗2次，調(diào)整脾細胞密度為5×106個/mL。設(shè)置ConA刺激組、LPS刺激組、空白組，分別加入含ConA（10 μg/mL）的RPMI 1640完全培養(yǎng)基、含LPS（20 μg/mL）的RPMI 1640完全培養(yǎng)基、RPMI 1640完全培養(yǎng)基100 μL，每組重復3次，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h，采用酶標儀于450 nm處檢測各孔值。小鼠淋巴細胞的增殖能力用刺激指數(shù)（SI）表示。

SI＝實驗/空白

2.12 Western blotting檢測腫瘤組織中PI3K/Akt/ mTOR通路相關(guān)蛋白表達

取各組小鼠凍存腫瘤組織，加入RIPA裂解液提取蛋白，經(jīng)BCA法測定蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后，分別加入p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、mTOR抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；PBST漂洗3次后，加入二抗，室溫搖床孵育2 h，PBST漂洗3次后，進行ECL顯色曝光，通過Image J軟件分析各目的條帶的灰度值。

2.13 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠體質(zhì)量和體溫的影響

如圖1-A所示，與對照組比較，模型組小鼠自第3天體質(zhì)量開始顯著下降（＜0.05、0.01），精神狀態(tài)及毛發(fā)欠佳；與模型組比較，EPI組小鼠第6天體質(zhì)量開始顯著下降（＜0.01），毛發(fā)干枯掉落、動作遲緩、精神萎靡，并出現(xiàn)死亡情況；鐵皮石斛水提物組小鼠體質(zhì)量無顯著差異，毛發(fā)無明顯改變、無死亡現(xiàn)象；與EPI組比較，鐵皮石斛水提物組小鼠體質(zhì)量顯著增加（＜0.01）。如圖1-B、C所示，Bx1區(qū)域為小鼠腹部區(qū)域，與對照組比較，模型組小鼠Bx1區(qū)域平均溫度升高；與模型組比較，各給藥組小鼠Bx1區(qū)域平均溫度均顯著降低（＜0.05、0.01）。

C-各組小鼠體表紅外熱感圖 DOE-鐵皮石斛水提物 與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01 *P＜0.05；與EPI組比較：△△P＜0.01，下圖同

3.2 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

如圖2所示，與模型組比較，各給藥組小鼠自第18天起腫瘤生長速度放緩，腫瘤體積明顯減??；給藥4周后，各給藥組小鼠腫瘤質(zhì)量較模型組顯著降低（＜0.01），鐵皮石斛水提物低、中、高劑量組平均抑瘤率分別為20.83%、23.32%、23.17%。

3.3 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠腫瘤組織病理變化的影響

如圖3所示，模型組小鼠腫瘤組織中腫瘤細胞數(shù)目豐富，排列無序且密集，腫瘤細胞呈實性片狀彌散性分布，胞質(zhì)嗜酸性，核大深染，基本無壞死灶；EPI組腫瘤細胞數(shù)量明顯減少，腫瘤細胞胞質(zhì)破裂、胞核溶解，腫瘤細胞壞死區(qū)域較大；鐵皮石斛水提物組小鼠中均發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞數(shù)目減少，排列稀疏，出現(xiàn)明顯細胞凋亡，組織結(jié)構(gòu)破損，可見大量壞死細胞。

3.4 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠肺部轉(zhuǎn)移的影響

小動物活體成像結(jié)果（圖4）顯示，與模型組比較，EPI組和鐵皮石斛水提物中、高劑量組小鼠肺部腫瘤轉(zhuǎn)移灶熒光強度顯著減弱（＜0.05、0.01）。肺臟轉(zhuǎn)移灶數(shù)（圖5）顯示，模型組小鼠表面白色隆起轉(zhuǎn)移灶直徑多為IV級，且轉(zhuǎn)移灶數(shù)目多；鐵皮石斛水提物組肺部表面白色隆起轉(zhuǎn)移灶數(shù)直徑多為II、III級，且轉(zhuǎn)移灶數(shù)目顯著減少（＜0.05、0.01）。

A-腫瘤體積 B-腫瘤重量 C-腫瘤形態(tài)學觀察

圖3 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠腫瘤組織病理變化的影響(HE, ×200)

圖4 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠腫瘤熒光強度的影響(, n = 3)

箭頭所指即為肺部表面轉(zhuǎn)移灶

3.5 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠肺部組織病理變化的影響

如圖6所示，模型組小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶成團狀增生，邊緣可見多個轉(zhuǎn)移的癌細胞灶，轉(zhuǎn)移面積大，肺部癌細胞浸潤較多；鐵皮石斛水提物組小鼠肺部腫瘤轉(zhuǎn)移灶區(qū)域面積減少，肺部癌細胞浸潤減少。

3.6 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組小鼠脾臟指數(shù)顯著升高（＜0.01），胸腺指數(shù)顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，EPI組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低（＜0.01），鐵皮石斛水提物各劑量組小鼠脾臟指數(shù)均顯著升高（＜0.05），鐵皮石斛水提物中劑量組胸腺指數(shù)顯著升高（＜0.05）；與EPI組比較，鐵皮石斛水提物各劑量組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著升高（＜0.01）。

3.7 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠脾臟組織病理變化的影響

如圖7所示，對照組小鼠脾臟組織紅髓與白髓分界清晰，可見較窄邊緣區(qū)，細胞排列整齊緊密；模型組小鼠脾臟組織白髓與紅髓邊緣分界不清，邊緣區(qū)增寬；與模型組比較，各給藥組小鼠脾臟組織紅白髓交界清楚。

圖6 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠肺部組織病理變化的影響(HE, ×40)

表1 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響()

與對照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：**＜0.01*＜0.05；與EPI組比較：△△＜0.01，下表同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group;△△< 0.01EPI group, same as below tables

圖7 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠脾臟組織病理變化的影響(HE, ×200)

3.8 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠白細胞數(shù)目和淋巴細胞占比的影響

如圖8所示，與對照組比較，模型組小鼠外周血中白細胞數(shù)量顯著升高（＜0.01），淋巴細胞占比顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組外周血中白細胞數(shù)量顯著降低（＜0.01），EPI組淋巴細胞占比顯著降低（＜0.01），鐵皮石斛水提物中、高劑量組淋巴細胞占比顯著升高（＜0.05、0.01）；與EPI組比較，鐵皮石斛水提物各劑量組小鼠外周血中白細胞數(shù)量和淋巴細胞占比均顯著升高（＜0.01）。

3.9 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠血清中細胞因子水平的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；與模型組比較，鐵皮石斛水提物各劑量組小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；與EPI組比較，鐵皮石斛水提物各劑量組小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平均顯著升高（＜0.01）。

圖8 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠外周血中白細胞數(shù)目和淋巴細胞占比的影響(, n = 8～10)

表2 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠血清中細胞因子水平的影響()

3.10 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠外周血中T淋巴細胞比例的影響

如圖9和表3所示，與對照組比較，模型組小鼠外周血中CD3+占比顯著下降（＜0.01），CD4+/CD8+呈下降趨勢；與模型組比較，EPI組CD4+占比和CD4+/CD8+均顯著降低（＜0.05、0.01），鐵皮石斛水提物中劑量組CD3+占比顯著上升（＜0.05），鐵皮石斛水提物各劑量組小鼠外周血中CD4+占比和CD4+/CD8+顯著上升（＜0.05、0.01），鐵皮石斛水提物低、中劑量組CD8+占比顯著下降（＜0.01）；與EPI組比較，鐵皮石斛水提物各劑量組CD4+占比和CD4+/CD8+顯著上升（＜0.01），CD8+占比顯著下降（＜0.01），鐵皮石斛水提物中劑量組CD3+占比顯著上升（＜0.01）。

3.11 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠脾淋巴增殖能力的影響

如圖10所示，與模型組比較，EPI組小鼠脾臟T、B淋巴細胞增殖能力顯著降低（＜0.05），鐵皮石斛水提物中劑量組小鼠脾臟T、B淋巴細胞增殖能力顯著升高（＜0.05）；與EPI組比較，鐵皮石斛水提物各劑量組小鼠T、B淋巴細胞增殖能力均顯著升高（＜0.01）。

3.12 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠腫瘤組織PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達的影響

如圖11所示，與模型組比較，鐵皮石斛水提物中劑量組小鼠腫瘤組織中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、mTOR蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖9 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠外周血中T淋巴細胞亞群的影響

表3 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠T淋巴細胞的影響()

圖10 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠脾臟淋巴增殖能力的影響()

圖11 鐵皮石斛水提物對荷瘤小鼠腫瘤組織PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

我國傳統(tǒng)醫(yī)學將腫瘤列入“癥瘕積聚”范疇，《華元化中藏經(jīng)》記載：“癥瘕由五臟六腑真氣失而邪氣并逐乃生焉”。中醫(yī)學認為機體正氣不足、氣血陰陽虧虛、臟腑功能失調(diào)是腫瘤發(fā)生的前提和決定因素[8]。其中“陰虛癌瘤”相關(guān)假說提出癌毒屬于陽邪，認為毒蘊陰虧是惡性實體腫瘤發(fā)生的根本病機，從“根”上糾正“陰虛”這一發(fā)病之“本”，可有效預防惡性實體腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[9-10]。鐵皮石斛具有滋陰清熱、益胃生津的功效，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載“石斛，除痹，下氣，補五臟虛勞贏弱，強陰”。因此，鐵皮石斛在臨床上也常被用作腫瘤患者的輔助用藥[11]。本研究結(jié)果顯示，鐵皮石斛水提物能顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長速度，減輕腫瘤質(zhì)量，誘導腫瘤組織細胞凋亡；并可降低荷瘤小鼠原位瘤及肺部部位的熒光強度，減少肺部轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目，縮小轉(zhuǎn)移灶面積，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。提示，鐵皮石斛水提物具有抗腫瘤、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

中醫(yī)一直重視正氣在疾病中起到的基礎(chǔ)性作用。《內(nèi)經(jīng)》中記載：“正氣存內(nèi)，邪不可干”等論述均強調(diào)了正氣在疾病中的作用?！锻庾C醫(yī)案匯編》則明確指出“正氣虛則成巖”，強調(diào)了正氣在腫瘤中的重要性[12]?，F(xiàn)代研究也表明，機體免疫功能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。化療作為惡性腫瘤綜合治療的重要手段，極易引發(fā)免疫抑制，影響治療效果及預后，降低患者生存質(zhì)量。中醫(yī)把化療后臨床表現(xiàn)歸為陰虛內(nèi)熱癥候，化療后會使機體傷津耗氣，損陰傷陽，祛邪傷正，不利于患者的康復[13]。因此，在腫瘤治療的同時，扶助正氣、調(diào)理陰陽，提高機體免疫功能是腫瘤治療的關(guān)鍵。中藥參與腫瘤免疫治療并非時直接殺死腫瘤細胞，而是通過激活細胞與體液免疫反應(yīng)，作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑來提高機體免疫功能，從而達到抑制腫瘤的目的。脾臟和胸腺作為機體最重要的免疫器官，是T、B等免疫細胞定居的場所，同時也是發(fā)生免疫應(yīng)答及合成免疫活性物質(zhì)的重要場所，在一定程度上反應(yīng)免疫功能的強弱[14]。

T淋巴細胞介導的特異性免疫反應(yīng)是腫瘤免疫的核心，其動態(tài)平衡是免疫系統(tǒng)穩(wěn)定的重要保障[15]。CD4+T細胞的減少可導致細胞因子分泌減少及B淋巴細胞活化率下降，使細胞免疫與體液免疫均受抑制[16]。CD8+T細胞可通過分泌抑制因子抑制細胞毒性T淋巴細胞和B淋巴細胞，起到負調(diào)節(jié)作用[17]。CD4+/CD8+值降低反映細胞免疫功能受到抑制。大量研究發(fā)現(xiàn)免疫缺陷及惡性腫瘤患者CD4+T細胞比例下降，CD8+T細胞比例升高，CD4+/CD8+比值降低[18]。此外，T淋巴細胞分泌的細胞因子也是衡量機體免疫功能的重要指標[19]。IL-2在機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，可以刺激T細胞生長，激活淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的活性[20]。TNF-α是抑瘤作用最強的細胞因子，能直接殺傷腫瘤細胞[21]。IFN-γ能直接抑制腫瘤的生長，并增強TNF的抑瘤作用[22]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，EPI組小鼠脾臟及胸腺指數(shù)顯著降低、CD4+T細胞比例及CD4+/CD8+值顯著下降、脾臟T、B淋巴細胞的增殖能力顯著降低，提示化療藥物EPI進一步破壞了荷瘤小鼠的免疫功能。與模型組和EPI組比較，鐵皮石斛水提物能顯著增加脾臟和胸腺指數(shù)，改善脾臟形態(tài)學結(jié)構(gòu)，提高脾臟Ｔ、B淋巴細胞的增殖能力，調(diào)節(jié)荷瘤小鼠外周血中異常的白細胞水平，提高外周血中淋巴細胞占比，使CD4+T細胞比例上升，CD8+T細胞比例下降，CD4+/CD8+比值上升，提高血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α細胞因子水平。提示鐵皮石斛水提物能調(diào)節(jié)荷瘤小鼠紊亂的免疫系統(tǒng)，提高免疫功能。

近些年來，研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR信號通路能夠調(diào)控多種惡性腫瘤細胞存活、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移的過程，已成為研究抗腫瘤藥物的熱門靶點通路之一[23-24]。當受到刺激被多種生長因子激活后的PI3K，可通過磷酸化細胞內(nèi)第二信使4,5-二磷酸磷脂酰肌醇活化下游效應(yīng)Akt，導致Akt分子構(gòu)象改變發(fā)生磷酸化，激活后的p-Akt通過調(diào)控其下游靶蛋白mTOR，從而參與調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等生物學行為[25-27]。研究表明，大多數(shù)免疫細胞的激活都受到PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響[28]。阻斷PI3K/Akt/mTOR信號通路可影響腫瘤免疫微環(huán)境，解除患者免疫抑制狀態(tài)，促進患者免疫功能恢復，并提高抗腫瘤固有的免疫反應(yīng)[29-30]。本研究結(jié)果顯示，鐵皮石斛水提物治療后可使荷瘤小鼠腫瘤組織中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、mTOR蛋白表達水平均有不同程度下降，其中鐵皮石斛水提取中劑量組具有顯著性差異。提示抑制PI3K/Akt/ mTOR信號通路的激活可能是鐵皮石斛水提物抗腫瘤和恢復免疫功能的重要機制之一。

綜上所述，“滋陰清熱”中藥鐵皮石斛可抑制4T1乳腺癌荷瘤模型小鼠腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，同時能調(diào)節(jié)荷瘤小鼠紊亂的免疫系統(tǒng)，恢復其免疫功能；其機制可能與其下調(diào)腫瘤組織中PI3K/Akt/mTOR信號通路表達有關(guān)。本研究為鐵皮石斛用于腫瘤輔助治療的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，并為未來臨床治療惡性腫瘤提供一定科研參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Anti-tumor and immunomodulatory effects ofwater extract on 4T1 breast cancer bearing mice

NIU Zhuang-wei1, YAN Mei-qiu1, SU Jie1, WANG Chen-xing1, HAN Li-ping1,SHI Meng-lin1, YU Jing-jing1, CHEN Su-hong2, LYU Gui-yuan1

1. School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China 2. Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China

To investigate the anti-tumor and immunomodulatory effects ofwater extract on 4T1 breast cancer model mice, and further explore its mechanism.BALB/c female mice were successfully used to establish a 4T1 breast cancer tumor-bearing mouse model. The mice were randomly divided into model group, epirubicin hydrochloride (8 mL/kg) group andwater extract low-, medium-, and high-dose (0.5, 1.0, 1.5 g/kg) groups, and 10 normal BALB/c female mice were selected as control group. Corresponding drugs were given to intervene, survival state of mice was observed. The tumor diameter and short diameter were measured every three days. After continuous administration for 28 d, mice were sacrificed, tumor weight was weighed, and tumor inhibition rate was calculated. Lung tumor metastasis was observed by living animal imager and counting of metastases. Spleen and thymus were weighed and organ coefficients were calculated. HE staining was used to observe the morphological changes of tumor, lung and spleen. The number of white blood cells and proportion of lymphocytes in peripheral blood of tumor-bearing mice were detected by hematology analyzer. The levels of interleukin-2 (IL-2), γ interferon (IFN-γ) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in serum were detected by ELISA. The proportion of T lymphocytes in peripheral blood was detected by flow cytometry. Splenic lymphocyte proliferation test was used to detect the proliferation of T lymphocytes and B lymphocytes in spleen. The expressions of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt)/mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway related proteins in tumor tissues were detected by Western blotting.Compared with model group, tumor growth trend ofwater extract group was slowed down, tumor weight was reduced (< 0.01), necrotic cells in tumor tissues were increased, fluorescence intensity of tumor and lung metastases was significantly decreased (< 0.05, 0.01), and number of lung metastases was decreased (< 0.05, 0.01). Spleen and thymus index were increased (< 0.05). The number of white blood cells in peripheral blood was decreased (< 0.01), and proportion of lymphocytes was increased (< 0.05, 0.01). The levels of IL-2, IFN-γ and TNF-α in serum were increased (< 0.05, 0.01). CD3+T lymphocytes in peripheral blood was increased (< 0.05), CD4+/CD8+ratio was increased (< 0.01); Proliferation ability of T lymphocytes and B lymphocytes in spleen were increased (< 0.05). The expressions of PI3K/Akt/mTOR pathway related proteins in tumor tissues were decreased (< 0.05, 0.01).water extract can significantly inhibit tumor growth and metastasis in tumor-bearing mice, and restore immune function in tumor-bearing mice, which may be related to down-regulation of PI3K/Akt/mTOR pathway expression.

Kimura et Migo; breast cancer; immunomodulatory; T lymphocyte; PI3K/Akt/mTOR pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)01 - 0131 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.016

2022-09-23

國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFC1702203）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2022ZB095）；浙江省省級重點實驗室項目（2012E10002）

牛壯偉（1995—），男，碩士研究生，研究方向為中藥藥理學。Tel: 15339951147 E-mail:1585172156@qq.com

通信作者：陳素紅，研究員，博士生導師，主要從事中藥藥理與新產(chǎn)品開發(fā)研究。E-mail: chensuhong@zjut.edu.cn

呂圭源，教授，博士生導師，主要從事中藥藥理與新產(chǎn)品開發(fā)研究。E-mail: lv.gy@263.net

[責任編輯 李亞楠]