閆 巧，薛玉葉，李方琴，王 芳，秦祉劍，戴 博，袁海龍*

甘草酸新型離子液體微乳的制備及體外評(píng)價(jià)

閆 巧1, 2，薛玉葉2，李方琴2，王 芳2，秦祉劍2，戴 博2，袁海龍2*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137 2. 空軍特色醫(yī)學(xué)中心藥學(xué)部，北京 100142

采用親油性離子液體1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate，BMIMPF6）取代傳統(tǒng)微乳油相制備甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）離子液體微乳（ionic liquid microemulsion，IL-ME）（GA-IL-ME），以改善甘草酸的透皮吸收。通過(guò)溶解度實(shí)驗(yàn)、配伍實(shí)驗(yàn)和繪制偽三元相圖篩選微乳處方；利用D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)法以粒徑為考察指標(biāo)進(jìn)行處方優(yōu)化，并對(duì)最優(yōu)處方制備的微乳進(jìn)行理化性質(zhì)、穩(wěn)定性、體外透皮吸收以及細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。GA-IL-ME的最佳處方為BMIMPF6-聚山梨酯80-PEG400-蒸餾水（5.8∶32.4∶10.8∶51.0）；所得微乳為黃色澄清透明狀液體，透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）顯示GA-IL-ME呈均勻的球形或類(lèi)球形，平均粒徑為（10.61±0.63）nm，多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.130±0.022，ζ電位為（?10.29±0.22）mV；GA-IL-ME在高速離心、儲(chǔ)存穩(wěn)定性、高溫以及冷熱和凍融循環(huán)實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性；體外透皮結(jié)果顯示，GA-IL-ME在24 h內(nèi)單位面積累積滲透量為（310.37±33.65）μg/cm2，為甘草酸傳統(tǒng)水包油（O/W）型微乳的1.34倍，甘草酸水溶液的6.76倍；細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明GA-IL-ME毒性低，生物相容性良好。BMIMPF6能顯著增加甘草酸的溶解度，將其引入微乳體系制備新型水包離子液體型微乳，明顯增加了甘草酸的經(jīng)皮累積滲透量，可為中藥透皮給藥系統(tǒng)新劑型的開(kāi)發(fā)提供參考，同時(shí)為甘草酸的進(jìn)一步研究應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

甘草酸；離子液體；微乳；D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)；透皮吸收；細(xì)胞毒性；偽三元相圖

甘草酸（glycyrrhizic acid，GA），又稱(chēng)甘草甜素，是從豆科植物甘草中分離純化得到的一種三萜皂苷，具有抗炎、抗氧化、抑制黑色素沉著、抗腫瘤、抗紫外線(xiàn)輻射等多重藥理作用[1-3]，被廣泛用于各種皮膚病的治療如銀屑病、特應(yīng)性皮炎、光老化、皮膚癌以及黑色素瘤等[4-7]。目前，甘草酸的給藥途徑主要為口服與注射，前者生物利用度低，后者易產(chǎn)生水鈉潴留、高血壓、低血鉀、水腫等不良反應(yīng)。經(jīng)皮給藥具有無(wú)痛、避免首過(guò)消除、安全性好、患者順應(yīng)性好等特點(diǎn)，可有效解決以上問(wèn)題。但甘草酸存在水溶性差、相對(duì)分子質(zhì)量大（822.93）、透皮吸收差等問(wèn)題，嚴(yán)重制約了其在經(jīng)皮給藥方面的應(yīng)用和發(fā)展[8-9]。因此，需要尋找合適的藥物載體以改善甘草酸的透皮吸收，促進(jìn)其藥效的發(fā)揮。

微乳是由水、油、乳化劑和助乳化劑以適當(dāng)比例自發(fā)形成的一種低黏度、透明或半透明、光學(xué)各向同性的熱力學(xué)穩(wěn)定體系[10]，具有增溶、促滲、易于制備等優(yōu)點(diǎn)，是經(jīng)皮給藥的常用劑型，但傳統(tǒng)微乳的增溶和促滲能力是有限的。離子液體是由大體積有機(jī)陽(yáng)離子和無(wú)機(jī)或有機(jī)陰離子構(gòu)成的熔點(diǎn)低于100 ℃的鹽，在室溫或室溫附近呈液態(tài)[11]，具有良好的溶解和促滲能力、熱穩(wěn)定性以及抗菌活性[12]。研究發(fā)現(xiàn)，將離子液體引入微乳體系制備的新型離子液體微乳（ionic liquid mircroemulsion，IL-ME）可以結(jié)合微乳和離子液體的雙重優(yōu)勢(shì)，在保持傳統(tǒng)微乳特性的基礎(chǔ)上，還可顯著提高其增溶和促滲能力以及熱穩(wěn)定性，克服傳統(tǒng)微乳無(wú)法溶解多種水不溶性藥物的缺陷，尤其是在水和有機(jī)溶劑中都不能溶解的藥物，部分離子液體還可作為微乳的抑菌劑[12-15]。Goindi等[16]以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（1- butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate，BMIMPF6）為油相制備了依托度酸IL-ME，發(fā)現(xiàn)BMIMPF6對(duì)依托度酸有一定的增溶作用，體外透皮結(jié)果顯示該IL-ME的累積經(jīng)皮滲透率大約為傳統(tǒng)水包油（O/W）型微乳的1.6倍；Salabat等[13]和Parsi等[17]同樣以離子液體BMIMPF6為油相制備了塞來(lái)昔布IL-ME，發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布在IL-ME的溶解度是傳統(tǒng)O/W型微乳的7.8倍，且前者經(jīng)皮滲透速率為后者的5.6倍。因此，本研究以甘草酸為原料藥，將離子液體BMIMPF6引入微乳組分中，制備具有雙重特性的甘草酸離子液體微乳（glycyrrhizic acid ionic liquid mircroemulsion，GA-IL-ME），以達(dá)到增加甘草酸溶解度、改善其透皮效果、提高藥物療效的目的，為甘草酸治療皮膚病提供一種有效的治療途徑和給藥方式。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AD型高效液相色譜儀，日本島津公司；Winner 802型納米激光粒度儀，濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司；BY-G20型高速離心機(jī)，北京白洋醫(yī)療器械有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海凌科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；BT125D型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；TP-6型智能透皮擴(kuò)散儀，天津市鑫洲科技有限公司；Tecnai G2 F30型場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡（TEM），美國(guó)FEI公司；MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱，日本三洋公司；Synergy H1型全功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2 藥材與試劑

甘草酸對(duì)照品，批號(hào)PS010448，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%，成都普思生物科技股份有限公司；甘草酸原料藥，批號(hào)190421，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95.0%，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；BMIMPF6（批號(hào)RH326318，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%）、橄欖油、蓖麻油、肉豆蔻酸異丙酯（isopropyl myristate，IPM）、辛癸酸甘油酯（caprylic capric triglycerride，GTCC）、聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH-40）、油酸，均購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；油酸乙酯，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚山梨酯80，四川金山制藥有限公司；蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-35），北京索萊寶科技有限公司；1,2-丙二醇、聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）400、丙三醇，均購(gòu)自江西益普生藥業(yè)有限公司；無(wú)水乙醇，天津福晨化學(xué)試劑有限公司；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技公司，其余試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞及動(dòng)物

人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（human immortal keratinocyte line，HaCaT）購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)。BALB/c小鼠，雌性，體質(zhì)量（20±2）g，SPF級(jí)，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理經(jīng)空軍特色醫(yī)學(xué)中心批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：空特（科研）第2022-187- PJ01。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草酸含量分析方法的建立

2.1.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制 精密稱(chēng)取甘草酸對(duì)照品10.00 mg于25 mL量瓶中，加入適量甲醇超聲使其溶解，甲醇稀釋至刻度線(xiàn)，搖勻，即得質(zhì)量濃度為400.00 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 供試品溶液的配制 精密移取GA-IL-ME 100 μL，加入適量甲醇，超聲（80 W，20 kHz）5 min，定容至10 mL，搖勻，即得供試品溶液。同法制備空白離子液體微乳溶液。

2.1.3 色譜條件 C18色譜柱為Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（40∶60）；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積20 μL。

2.1.4 專(zhuān)屬性考察 取甘草酸對(duì)照品溶液和經(jīng)“2.1.2”項(xiàng)下方法處理的GA-IL-ME、空白離子液體微乳溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，該色譜條件下，色譜峰分離度好，峰形穩(wěn)定，無(wú)干擾。

2.1.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密移取甘草酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，加甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為400.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 μg/mL的對(duì)照品溶液，濾過(guò)后按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（），甘草酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為＝15 887－53 186，2＝0.999 9，表明甘草酸在6.25～400.00 μg/mL與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為50 μg/mL的對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積，計(jì)算其RSD為0.27%，表明儀器精密度良好。

圖1 空白離子液體微乳(A)、甘草酸對(duì)照品(B)和GA-IL-ME樣品 (C) 的HPLC圖

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下的供試品溶液6份，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算甘草酸質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，甘草酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.50 mg/g，RSD值為0.15%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將同一批次供試品溶液室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h后，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果表明，甘草酸峰面積的RSD為0.30%，表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取已知質(zhì)量濃度的GA-IL-ME 9份，分別加入相當(dāng)于樣品中甘草酸含量80%、100%、120%的甘草酸對(duì)照品，每個(gè)比例3份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理后，依“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算得平均加樣回收率分別為98.27%、101.67%、100.66%，RSD分別為0.15%、0.36%、0.90%，表明該方法回收率良好。

2.2 甘草酸在各輔料中溶解度的測(cè)定

取待篩選的油相、乳化劑和助乳化劑（表1）各1 g至2 mL EP管中，加入過(guò)量甘草酸，渦旋混勻后超聲4 h，室溫下放置24 h，于10 000 r/min下離心10 min（離心半徑為8.5 cm），取上清液用甲醇適當(dāng)稀釋?zhuān)?.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后，采用“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定甘草酸含量。原則上選擇對(duì)甘草酸有較高溶解度的輔料作為微乳的組成成分，以達(dá)到對(duì)藥物的最大溶解能力，防止藥物在微乳儲(chǔ)存過(guò)程中析出結(jié)晶體[18]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）可知，甘草酸在離子液體BMIMPF6中的溶解度明顯高于其他油相，說(shuō)明BMIMPF6有一定的增溶作用；在所考察的乳化劑中，聚山梨酯80和EL-35對(duì)甘草酸的溶解能力更大；助乳化劑中，1,2-丙二醇、甘油和PEG400對(duì)甘草酸的溶解度均較高，無(wú)顯著差異。基于以上結(jié)果，最終選擇BMIMPF6為油相，聚山梨酯80和EL-35為乳化劑，甘油、1,2-丙二醇和PEG400為助乳化劑用于進(jìn)一步的處方篩選。

表1 甘草酸在各輔料中的飽和溶解度(, n = 3)

2.3 配伍實(shí)驗(yàn)

2.3.1 乳化劑的篩選 為了進(jìn)一步考察輔料的相容性，篩選出適宜的乳化劑，將BMIMPF6分別與乳化劑（聚山梨酯80、EL-35）以質(zhì)量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5渦旋混合均勻，于室溫下靜置，觀察是否分層。按如下方法進(jìn)行配伍實(shí)驗(yàn)：取空白微乳0.5 g，在100 r/min磁力攪拌下加入到50 mL 37 ℃的蒸餾水中，觀察乳化情況，根據(jù)表2的目測(cè)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行等級(jí)分類(lèi)[19]，因BMIMPF6的密度比水大，因此略做改動(dòng)。由相容性和配伍結(jié)果（表3）可知，乳化劑聚山梨酯80與BMIMPF6配伍后相容性和乳化性較好，所以最終選取聚山梨酯80作為乳化劑。

2.3.2 助乳化劑的篩選 分別將聚山梨酯80和助乳化劑甘油、PEG400、1,2-丙二醇以2∶1混勻后，再將BMIMPF6與上述混合物按質(zhì)量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5渦旋混合均勻，室溫下靜置，觀察是否分層，評(píng)測(cè)方法同“2.3.1”項(xiàng)。結(jié)果（表4）顯示，PEG400的乳化能力最優(yōu)，因此最終選擇PEG400為助乳化劑。

表2 乳化等級(jí)分類(lèi)

表3 不同油相與乳化劑的配伍實(shí)驗(yàn)

表4 油相與混合乳化劑的配伍實(shí)驗(yàn)

2.4 繪制偽三元相圖

通過(guò)繪制偽三元相圖確定乳化劑和助乳化劑的比例（m）以及成乳區(qū)域。將聚山梨酯80與PEG400分別以2∶1、3∶1、4∶1混合均勻形成混合乳化劑（Smix），然后將BMIMPF6與Smix按質(zhì)量比1∶9～9∶1混勻，37 ℃、100 r/min磁力攪拌下滴加蒸餾水至體系從澄清透明狀變?yōu)榈{(lán)色乳光或渾濁時(shí)，記錄加水量。通過(guò)Origin 2019b軟件繪制偽三元相圖，將能形成澄清或帶有藍(lán)色乳光的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)定為偽三元相圖中可形成微乳的處方點(diǎn)，這些點(diǎn)連接后與水相頂點(diǎn)形成的封閉區(qū)域，即為成乳區(qū)，結(jié)果見(jiàn)圖2。微乳區(qū)域面積越大，說(shuō)明微乳處方越穩(wěn)定，最終確定m為3∶1。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)最優(yōu)處方，采用D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)進(jìn)行處方優(yōu)化。

2.5 D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)優(yōu)化微乳處方

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)是一種常用的混料設(shè)計(jì)方法，具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、預(yù)測(cè)精度高、多目標(biāo)同步優(yōu)化等特點(diǎn)。本研究以BMIMPF6的用量（1）、Smix的用量（2）和水的用量（3）為自變量（3相質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和始終為1），平均粒徑（）為因變量，采用D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)對(duì)微乳處方進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)偽三元相圖確定BMIMPF6、Smix、水的用量分別為2.6%～10%、37.8%～50%、47.3%～55.6%，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表5。按照表5中處方稱(chēng)取BMIMPF6、Smix，于37 ℃、100 r/min磁力攪拌5 min混勻后，加入甘草酸原料藥，磁力攪拌混勻，再加入處方量的蒸餾水，同等轉(zhuǎn)速下磁力攪拌1 h，即得GA-IL-ME，其中甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 mg/g。

圖2 不同Km (2∶1、3∶1、4∶1) 下的偽三元相圖

2.5.2 模型擬合及效應(yīng)面分析 用Design Expert 13軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差及2次多項(xiàng)式回歸擬合分析，得到粒徑的非線(xiàn)性回歸方程為＝33.861＋8.692＋9.493－26.7812－22.2413＋0.079 723，2＝0.989 1，＜0.000 1，失擬項(xiàng)＝0.449 4，擬合方程的相關(guān)系數(shù)較好，顯著性水平值＜0.05，失擬項(xiàng)值＞0.05，表明該模型與真實(shí)數(shù)據(jù)之間具有較高的擬合度，模型預(yù)測(cè)可信度良好，可用于最優(yōu)處方的分析及預(yù)測(cè)。

表5 D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)及結(jié)果(, n = 3)

根據(jù)回歸模型繪制等高線(xiàn)圖和3D響應(yīng)面圖（圖3），可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響以及最優(yōu)條件下各因素的取值。由圖可知隨著B(niǎo)MIMPF6用量的增加以及Smix用量的減少，微乳粒徑隨之增大，適當(dāng)?shù)臏p少BMIMPF6用量或增加乳化劑比例可以使粒徑減小。

2.5.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Design Expert 13軟件綜合評(píng)價(jià)后得微乳最優(yōu)處方（以粒徑最小為優(yōu)）：BMIMPF6-Smix-水5.8∶43.2∶51.0，在此條件下，粒徑的預(yù)測(cè)值為10.76 nm。根據(jù)最優(yōu)處方構(gòu)建目標(biāo)微乳，精密稱(chēng)取BMIMPF60.58 g、聚山梨酯80 3.24 g，PEG400 1.08 g，于37 ℃、100 r/min磁力攪拌5 min混勻后，加入甘草酸原料藥，磁力攪拌混勻，再加入5.10 g蒸餾水，同等轉(zhuǎn)速下磁力攪拌1 h，即得GA-IL-ME，處方中甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 mg/g。平行制備3份GA-IL-ME進(jìn)行處方驗(yàn)證。所制3份微乳粒徑分別為9.77、11.27、10.80 nm，平均粒徑為（10.61±0.63）nm，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)結(jié)果相近，說(shuō)明采用D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)優(yōu)化GA-IL-ME處方具有良好的預(yù)測(cè)性和重現(xiàn)性。

2.6 GA-IL-ME的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.6.1 外觀和形態(tài) 如圖4-A所示，在室溫下，GA- IL-ME外觀呈黃色澄清透明的均一狀液體，靜置不分層，具有良好的流動(dòng)性和丁達(dá)爾現(xiàn)象。取GA-IL- ME適量，蒸餾水稀釋10倍后取適量滴加到銅網(wǎng)上，待揮干后，2%磷鎢酸溶液負(fù)染10 min，晾干后，于TEM下觀察，結(jié)果如圖4-B、C所示，GA-IL-ME粒徑較小，大小分布均勻，呈均勻的球形或類(lèi)球形。

2.6.2 粒徑、PDI和ζ電位 取GA-IL-ME用蒸餾水稀釋10倍，納米粒度儀測(cè)定其粒徑及PDI，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。結(jié)果表明，GA-IL-ME的平均粒徑為（10.61±0.63）nm，PDI為0.130±0.022，粒徑分布見(jiàn)圖5；取上述微乳稀釋液用電位儀測(cè)得其ζ電位為（?10.29±0.22）mV。PDI值是反映微乳均一性的重要指標(biāo)，PDI越小，體系均一性越好，越易保持穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)所制備的微乳粒徑小且分布均勻；一般ζ電位控制在?20～?50 mV時(shí)體系較為穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)所制備的微乳ζ電位不在該界限范圍內(nèi)，但這并不能說(shuō)明GA-IL-ME不穩(wěn)定，有研究表明，ζ電位的測(cè)定對(duì)評(píng)價(jià)非離子型表面活性劑制備的乳劑穩(wěn)定性?xún)r(jià)值不大，此外，不少文獻(xiàn)制備的穩(wěn)定性微乳ζ電位也不高[20-23]。因此，從粒徑及粒徑分布初步分析GA-IL-ME具有較好的穩(wěn)定性。

圖3 配方變量對(duì)粒徑影響的等高線(xiàn)圖(A)和3D響應(yīng)面圖(B)

圖4 GA-IL-ME的外觀及丁達(dá)爾效應(yīng)圖(A)、TEM圖(100 nm, B; 20 nm, C)

圖5 GA-IL-ME的粒徑分布

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.7.1 高速離心穩(wěn)定性 取2 g微乳于5000 r/min離心30 min（離心半徑8.5 cm），離心后微乳外觀依然澄清透明，無(wú)沉淀和無(wú)分層現(xiàn)象。

2.7.2 儲(chǔ)存穩(wěn)定性考察 取GA-IL-ME 3份，分別于4 ℃、室溫（25 ℃）、40 ℃下儲(chǔ)存30 d，于第0、1、3、5、10、20、30天取樣，觀察微乳外觀性狀、粒徑及藥物含量的變化情況。結(jié)果表明，在儲(chǔ)存期間微乳外觀保持不變，未出現(xiàn)分層或沉淀；粒徑和藥物含量的變化如表6所示，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加，微乳粒徑略有增大，藥物含量略有下降，且溫度越高，越不利于微乳的儲(chǔ)存，相較于室溫和40 ℃，4 ℃低溫儲(chǔ)存更有利于保持微乳的穩(wěn)定性。

2.7.3 高溫實(shí)驗(yàn) 將3份等量微乳（與儲(chǔ)存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)同一批次）密封于西林瓶中，分別于70、80、90、100 ℃下水浴加熱30 min，室溫放置24 h后，考察微乳的外觀、粒徑及粒徑分布、ζ電位及藥物含量有無(wú)變化[18]。70～100 ℃處理后，外觀上微乳未出現(xiàn)分層、沉淀等現(xiàn)象；粒徑隨著溫度升高而增大，但PDI卻隨之減?。ū?），這可能是因?yàn)闇囟鹊纳呓档土吮砻婊钚詣┯H水性頭部基團(tuán)與水分子之間的氫鍵或水化作用，減小了界面曲率，導(dǎo)致團(tuán)聚體尺寸增大，從而使微乳粒徑變大[24]，同時(shí)熱處理可能使粒子對(duì)乳化劑的吸附作用減弱，乳膠粒周?chē)碾p電子層變薄，粒子聚集增多，從而使微乳的PDI減小[18]；此外，隨著溫度的升高，ζ電位從（?9.80±0.27）mV上升到（?7.59±0.34）mV，藥物含量略有下降。以上結(jié)果均表明GA-IL-ME體系對(duì)熱較穩(wěn)定。

表6 GA-IL-ME的儲(chǔ)存穩(wěn)定性(, n = 3)

表7 不同溫度對(duì)GA-IL-ME穩(wěn)定性的影響(, n = 3)

2.7.4 冷熱和凍融循環(huán)實(shí)驗(yàn)

（1）冷熱循環(huán)：將3份與儲(chǔ)存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)同一批次的GA-IL-ME密封于西林瓶中，置于4 ℃冰箱存放48 h后，再于45 ℃存放48 h，如此于4 ℃和45 ℃之間循環(huán)貯存6次。

（2）凍融循環(huán)：將3份GA-IL-ME密封于西林瓶中，置于?20 ℃存放48 h后，再于25 ℃存放48 h，如此于?20 ℃和25 ℃之間循環(huán)貯存3次[25]。觀察微乳在循環(huán)實(shí)驗(yàn)中是否發(fā)生相分離并測(cè)定其粒徑、PDI和藥物含量。結(jié)果表明，冷熱循環(huán)后微乳粒徑、PDI和藥物含量分別為（11.82±1.17）nm、0.143±0.013和（18.34±0.67）mg/g，凍融循環(huán)后分別為（12.15±0.96）nm、0.144±0.017和（17.43±0.15）mg/g。經(jīng)過(guò)冷熱和凍融循環(huán)實(shí)驗(yàn)后，GA-IL-ME外觀仍澄清透明，未出現(xiàn)沉淀、相分離等情況；粒徑和PDI略有增加，藥物含量略有下降，說(shuō)明該系統(tǒng)可以在升溫或冷凍后自我修復(fù)，進(jìn)一步證明了GA-IL-ME有較好的穩(wěn)定性。

2.8 GA-IL-ME體外透皮實(shí)驗(yàn)

2.8.1 實(shí)驗(yàn)皮膚的制備 小鼠實(shí)驗(yàn)前1 d用脫毛膏去除腹部毛發(fā)，靜養(yǎng)1 d后頸椎脫臼處死，剪下腹部皮膚，除去皮下脂肪和其他組織，再用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸去多余水分后于?20 ℃冰箱中保存，1周內(nèi)使用。

2.8.2 體外經(jīng)皮吸收實(shí)驗(yàn) 采用Franz擴(kuò)散池進(jìn)行體外透皮實(shí)驗(yàn)。取預(yù)先處理好的鼠皮，用生理鹽水浸泡30 min，濾紙吸干備用。鼠皮角質(zhì)層面向供給池，真皮層面向接收池并與接收液接觸，確保接收液和皮膚之間沒(méi)有氣泡，用鐵夾固定裝置。接收液為PBS緩沖液（pH 7.4），水浴溫度（32.0±0.5）℃，攪拌速度350 r/min。

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先打開(kāi)透皮擴(kuò)散儀，用接收液穩(wěn)定30 min，然后向供給池中分別加入的1 g的甘草酸水溶液、GA-IL-ME和甘草酸O/W型微乳液（該微乳油相為傳統(tǒng)油相中對(duì)甘草酸溶解能力最高的IPM，除油相種類(lèi)外其余均與GA-IL-ME保持一致，記為GA-IPM-ME）。分別于1、2、4、6、8、10、12、24 h從接收池中取出1 mL接收液，取樣后補(bǔ)充等量同溫的空白接收液。樣品經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)后HPLC進(jìn)樣分析測(cè)定藥物含量。按下列公式計(jì)算單位面積累積滲透量（Q）、滲透速率（s）和滲透系數(shù)（p）。

s＝dQ/d

p＝s/0

C為第個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物質(zhì)量濃度，0為接收池體積，C為第（＝－1）個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物質(zhì)量濃度，為取樣體積，為有效透皮面積，為取樣時(shí)間，0為藥物初始質(zhì)量濃度，本實(shí)驗(yàn)中，0＝15 mL，＝1 mL，＝3.14 cm2，0＝20 mg/g

體外透皮吸收曲線(xiàn)如圖6所示，相關(guān)滲透參數(shù)見(jiàn)表8。結(jié)果表明，GA-IL-ME的透皮滲透性能優(yōu)于GA-IPM-ME和甘草酸水溶液。GA-IL-ME的Q值為（310.37±33.65）μg/cm2，分別是GA-IPM-ME的1.35倍和甘草酸水溶液的6.76倍。表明將甘草酸制備成新型離子液體微乳（GA-IL-ME）能夠促進(jìn)甘草酸的經(jīng)皮滲透，同時(shí)，與普通的O/W型微乳（GA-IPM-ME）相比，離子液體的引入能明顯增加微乳的促滲活性。動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明，GA-IL-ME的透皮速率最快，GA-IPM-ME次之，甘草酸水溶液最慢。

2.9 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

CCK8法比較GA-IL-ME與GA-IPM-ME對(duì)HaCaT細(xì)胞的毒性大小。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀況良好的HaCaT細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，空白組加入等量無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基，37 ℃貼壁培養(yǎng)72 h[15]。取出96孔板，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，分別加入100 μL含甘草酸質(zhì)量濃度為3.125、6.250、12.500、50.000、100.000 μg/mL的GA-IPM-ME及GA-IL-ME培養(yǎng)基，對(duì)照組加空白培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含10% CCK8的無(wú)血清培養(yǎng)基，于37 ℃繼續(xù)孵育1 h后，用酶標(biāo)檢測(cè)儀于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度（）值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

圖6 甘草酸水溶液、GA-IPM-ME、GA-IL-ME的體外透皮吸收曲線(xiàn)(, n = 3)

表8 滲透24 h后甘草酸水溶液、GA-IPM-ME和GA-IL- ME的Qn、Js和Kp(, n = 3)

與甘草酸水溶液比較：***＜0.001；與GA-IPM-ME比較：#＜0.05

***< 0.001GL aqueous solution;#< 0.05GA-IPM-ME

細(xì)胞存活率＝(樣品－空白)/(對(duì)照－空白)

不同質(zhì)量濃度的GA-IL-ME及GA-IPM-ME對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響結(jié)果如表9所示。結(jié)果表明，當(dāng)甘草酸質(zhì)量濃度在3.125～25.000 μg/mL時(shí)，GA-IL-ME和GA-IPM-ME均表現(xiàn)出良好的生物相容性，細(xì)胞存活率均大于90%；而當(dāng)甘草酸質(zhì)量濃度增大至50.000 μg/mL時(shí)，2種微乳均使HaCaT細(xì)胞的存活率下降至小于80%。上述結(jié)果表明，與傳統(tǒng)微乳制劑中常用油相IPM相比，將離子液體引入微乳并未對(duì)HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性作用。

3 討論

在微乳處方中，油相是微乳的重要載體，影響微乳的載藥量和乳化效果；乳化劑主要用來(lái)提供基本的微乳化特性；助乳化劑用于降低界面張力，增強(qiáng)乳化效果，穩(wěn)定乳滴，同時(shí)還具有很好的增溶作用[26]。因此，藥物的溶解度、處方的相容性以及微乳的穩(wěn)定性常常作為處方篩選的重要指標(biāo)。所以，本次研究通過(guò)溶解度實(shí)驗(yàn)、配伍實(shí)驗(yàn)和繪制偽三元相圖，選擇了溶解性能最優(yōu)的BMIMPF6作為油相；相容性良好的聚山梨酯80和PEG400作為乳化劑和助乳化劑，并通過(guò)偽三元相圖確定了兩者的最佳比例。在篩選油相時(shí)發(fā)現(xiàn)BMIMPF6對(duì)甘草酸有一定的增溶作用，這可能是由于BMIMPF6和甘草酸之間產(chǎn)生了氫鍵作用和范德華力[27]；繪制偽三元相圖時(shí)發(fā)現(xiàn)一些原本澄清透明的樣品放置2 h后底部會(huì)出現(xiàn)油滴，說(shuō)明這些體系不穩(wěn)定，所以在本次實(shí)驗(yàn)中將這些處方進(jìn)行了剔除，這提示在繪制偽三元相圖時(shí)，不能僅以微乳外觀作為評(píng)判指標(biāo)，還應(yīng)該考慮其穩(wěn)定性。

表9 不同質(zhì)量濃度GA-IL-ME、GA-IPM-ME對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響(, n = 3)

與GA-IPM-ME比較：***＜0.001

***< 0.001GA-IPM-ME

粒徑是衡量微乳質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，粒徑越小，微乳表面積越大，越有利于藥物的透皮吸收。有研究表明，當(dāng)微乳粒徑大于600 nm時(shí)，藥物主要停留在角質(zhì)層，無(wú)法到達(dá)皮膚深層；當(dāng)粒徑小于300 nm時(shí)可以有效地將藥物傳遞到皮膚的深層[28]。因此，本實(shí)驗(yàn)以粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)優(yōu)化處方，以最大程度的增加皮膚透過(guò)量。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，油相的減少和混合乳化劑的增加均有利于粒徑的減少，這主要是因?yàn)殡x子液體的濃度越高所形成的油滴越大，要在油滴周?chē)纬煞€(wěn)定的界面膜，需要更多的表面活性劑去調(diào)節(jié)[29]。

體外透皮結(jié)果顯示，GA-IL-ME的Q和s均高于GA-IPM-ME和甘草酸水溶液，其中水溶液最差。原因可能有以下幾個(gè)方面：①藥物納米化后，粒徑顯著減小，比表面積增大，增加了皮膚接觸面，利于甘草酸的透皮吸收；②微乳本身可以通過(guò)增溶、增加角質(zhì)層的水化作用以及破壞脂質(zhì)雙分子層來(lái)促進(jìn)藥物滲透；③GA-IL-ME的平均粒徑比GA-IPM- ME的平均粒徑（11.3±0.6）nm小，更有利于透皮吸收；④BMIMPF6具有增溶作用，同時(shí)其陽(yáng)離子基團(tuán)咪唑基具有促滲作用[30-31]。

盡管離子液體有眾多的優(yōu)點(diǎn)，但其毒性一直是人們關(guān)注的話(huà)題，所以，本實(shí)驗(yàn)選取HaCaT細(xì)胞株進(jìn)一步評(píng)價(jià)了GA-IL-ME的體外毒性。IPM無(wú)毒性和刺激性、保濕性好，是局部外用制劑和化妝品的常用輔料之一[32]，所以在細(xì)胞毒性試驗(yàn)中繼續(xù)將GA-IPM-ME作為參比制劑。結(jié)果顯示，GA-IL-ME和GA-IPM-ME對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響基本一致，其中GA-IL-ME的毒性略大于GA-IPM-ME。說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)的使用劑量下，GA-IL-ME與GA- IPM-ME的安全性基本一致，可以用于透皮給藥。

綜上所述，本研究制備的GA-IL-ME粒徑均一，具有較好的穩(wěn)定性、經(jīng)皮促滲能力以及生物相容性，證明IL-ME對(duì)甘草酸的溶解和透皮吸收具有促進(jìn)作用，為提高甘草酸藥效奠定了基礎(chǔ)。后期將繼續(xù)開(kāi)展皮膚刺激性和藥效學(xué)評(píng)價(jià)研究，以期為GA-IL- ME提供更為全面的研究資料，為甘草酸新制劑研究開(kāi)發(fā)提供有價(jià)值的參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation andevaluation of a novel ionic liquid microemulsion of glycyrrhizic acid

YAN Qiao1, 2, XUE Yu-ye2, LI Fang-qin2, WANG Fang2, QIN Zhi-jian2, DAI Bo2, YUAN Hai-long2

1. College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Department of Pharmacy, Air Force Medical Center, PLA, Beijing 100142, China

Glycyrrhizic acid ionic liquid microemulsion (GA-IL-ME) was prepared by replacing the traditional microemulsion oil phase with the lipophilic ionic liquid 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate (BMIMPF6) to improve the transdermal absorption of glycyrrhizic acid (GA).The formulation of the microemulsion were screened by solubility investigation, compatibility test and pseudo-ternary phase diagrams, and the formulation were further optimized by D-optimal mixture design with the particle size as the evaluation index. Then the physicochemical properties, stability,transdermal absorption and cytotoxicity of the optimized microemulsion were evaluated.The optimized formulation was composed of 5.8% BMIMPF6, 32.4% Tween-80, 10.8% PEG400 and 51.0% water. The prepared microemulsion was a yellow clear transparent liquid. GA-IL-ME was observed to be spherical or nearly spherical by transmission electron microscopy (TEM) and distributed evenly, with an average particle size of (10.61 ± 0.63) nm, a polydispersity index (PDI) of 0.130 ± 0.022 and an average ζ potential of (?10.29 ± 0.22) mV. GA-IL-ME showed good stability in high-speed centrifugation, high-temperature, heating-cooling and freeze- thaw cycles, and storage stability experiments. Results oftransdermal experiments showed that the cumulative permeation per unit area in 24 h of GA-IL-ME was (310.37 ± 33.65) μg/cm2, which was 1.34 times that of glycyrrhizic acid traditional oil in water (O/W) microemulsion and 6.76 times that of glycyrrhizic acid aqueous solution. Cytotoxicity experiments showed that GA-IL- ME had low toxicity and good biocompatibility.BMIMPF6can significantly increase the solubility of GA. Introducing it into microemulsion system to prepare a new ionic liquid in water microemulsion significantly increased the transdermal permeability of GA, which could provide a reference for the development of new dosage forms of traditional Chinese medicine transdermal delivery system and lay a foundation for further research and application of GA.

glycyrrhizic acid; ionic liquid; mircroemulsion; D-optimal mixture design; transdermal absorption; cytotoxicity; pseudo ternary phase diagram

R283.6

A

0253 - 2670(2023)01 - 0062 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.009

2022-07-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81873092）

閆 巧（1998—），女，碩士研究生，主要從事中藥新型給藥系統(tǒng)研究。Tel: 18751921376 E-mail: 1833306142@qq.com

通信作者：袁海龍，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥新型給藥系統(tǒng)研究。Tel: (010)66928505 E-mail: yhlpharm@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]