李明珠，劉增根

·綜 述·

組學(xué)技術(shù)在黑果枸杞資源研究中的應(yīng)用

李明珠1, 3，劉增根1, 2*

1. 中國科學(xué)院西北高原生物研究所青海省藏藥研究重點實驗室，青海 西寧 810001 2. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065 3. 煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005

黑果枸杞為我國西北特殊生境地區(qū)食藥兼用的生態(tài)經(jīng)濟植物，其漿果富含花色苷、花青素、多酚、多糖等物質(zhì)，是醫(yī)藥保健品、食品添加劑（天然色素）的主要成分和原料。隨著測序技術(shù)和各組學(xué)學(xué)科的不斷發(fā)展，組學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于黑果枸杞資源的各項研究中，尤其從單一的基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組、蛋白質(zhì)組到多組學(xué)聯(lián)合分析，對黑果枸杞品質(zhì)評價、耐鹽堿、果實發(fā)育機制以及花青素合成與積累等研究更加深入。綜述了近年來組學(xué)技術(shù)在黑果枸杞資源綜合評價、抗逆、次生代謝物生物合成代謝調(diào)控中的應(yīng)用，探討了資源品質(zhì)差異成因和生態(tài)環(huán)境適應(yīng)機制，為黑果枸杞資源的保護、種質(zhì)創(chuàng)新及合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

黑果枸杞；次生代謝物；花色苷；花青素；多組學(xué)；藥用資源

黑果枸杞Murray為茄科（Solanaceae）枸杞屬L.多棘刺灌木（圖1），其果實味甜多汁，民間常生食或榨汁做飲料，具有滋補強壯、明目及降壓作用，其根可以治咳嗽、哮喘、感冒和發(fā)燒，葉民間當(dāng)茶泡飲[1]。作為我國西北鹽堿、荒漠地區(qū)具有重要生態(tài)和經(jīng)濟價值的藥食兼用資源植物，黑果枸杞含有花色苷、花青素、多酚、黃酮、多糖、生物堿、氨基酸、礦質(zhì)元素、維生素等多種成分，具有補腎益精、養(yǎng)肝明目、生津止渴、潤肺止咳、補血安神等功效[2-3]，尤以其主要次生代謝物花青素類化合物已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健品、食品添加劑、化妝品等領(lǐng)域，并在我國傳統(tǒng)民族醫(yī)藥（藏藥、蒙藥、維藥）中占重要地位[4]。黑果枸杞所處的獨特生態(tài)地理環(huán)境，如生長環(huán)境緯度高、鹽堿化程度高、紫外線強、晝夜溫差大、日照時間長等，都有助于次生代謝產(chǎn)物（如花青素、多酚、黃酮、多糖等）的轉(zhuǎn)化與積累[2,5-7]。近年來，資源過度開發(fā)、質(zhì)量不穩(wěn)定、產(chǎn)地來源混亂和有效成分地理變異顯著等問題已經(jīng)明顯制約了黑果枸杞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[8-9]，因此亟待尋找黑果枸杞品質(zhì)差異形成原因以及構(gòu)建資源（道地性）生態(tài)環(huán)境評價體系。

圖1 黑果枸杞的花和果實

隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)、色譜/質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展以及分子生物學(xué)新方法的開發(fā)[10-11]，促進了以基因組學(xué)研究為基礎(chǔ)，涵蓋轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、相互作用組學(xué)和表型組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)研究模式和多組學(xué)研究方法的集成（圖2），將為現(xiàn)代藥用植物資源綜合評價、次生代謝物合成調(diào)控、種質(zhì)創(chuàng)新等研究領(lǐng)域帶來新的機遇[12-14]。因此，本文綜述了近年來組學(xué)技術(shù)在黑果枸杞資源評價、耐鹽堿、花青素合成與代謝、果實發(fā)育機制等研究中的應(yīng)用，為探索黑果枸杞品質(zhì)形成機制、解析資源生態(tài)環(huán)境適應(yīng)機制、科學(xué)發(fā)展人工種植奠定基礎(chǔ)，為國家特色民族資源保護與利用提供參考。

1 黑果枸杞資源及其綜合評價研究

黑果枸杞是一種多年生灌木，具棘刺，多分枝，漿果球形，成熟后為紫黑色，有很高的光合效率和較強抗逆性，是我國西北荒漠、鹽堿地區(qū)一種特有的藥食兼用的民族資源植物；在我國主要分布于內(nèi)蒙古西部、陜西北部、寧夏、甘肅、青海和新疆等地，中亞、高加索和歐洲等地區(qū)亦有分布[15-16]。黑果枸杞蒙名為“喬諾英-哈爾馬格”、藏藥名“旁瑪”，藏醫(yī)用它治療心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等病癥?！毒S吾爾藥志》記載，黑果枸杞果實及根皮常用于治療尿道結(jié)石、癬疥、齒齦出血等病癥。黑果枸杞果實味甜多汁且富含花色苷、花青素、生物堿、多酚、黃酮、維生素、有機酸及糖類，民間常生食或榨汁做飲料，可起到滋補強壯、明目、降血壓及預(yù)防心腦血管疾病的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞果實及葉提取物具有增強機體免疫、抗氧化、抗疲勞、調(diào)血脂、降尿酸、保肝護腎、抗動脈粥樣硬化等功效[1-2]。2017年2月6日，黑果枸杞被國家衛(wèi)生健康委員會正式批準(zhǔn)納入普通食品管理，從而進入更加廣闊的消費市場。近年來，黑果枸杞種植業(yè)發(fā)展迅猛，尤以青海、新疆等地的種植面積不斷擴大[17]。據(jù)青海省林草局統(tǒng)計，2018年青海省黑果枸杞種植面積達1.20萬hm2，干果產(chǎn)量約1.85萬t，產(chǎn)值達11.67億元；該產(chǎn)業(yè)帶動就業(yè)人數(shù)達3.25萬人，當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民每月人均增收3100多元，成為當(dāng)?shù)厝罕娒撠氈赂?、“鄉(xiāng)村振興”的富民產(chǎn)業(yè)[17-19]。

圖2 多組學(xué)聯(lián)合分析在藥用植物資源研究中的應(yīng)用

Fig.2 Application of multiomics analysis in medicinal plant resources

目前，黑果枸杞因獨特的生物活性和巨大的生態(tài)經(jīng)濟價值使其成為國內(nèi)外學(xué)者競相研究與開發(fā)的對象[1-2]，在保健品、食品、化妝品等行業(yè)需求量較大，資源的過度利用正嚴(yán)重威脅其野生種質(zhì)資源。此外，隨著整個生態(tài)環(huán)境日趨惡化和人為過度采摘砍伐，野生資源正在大面積的減少，部分地區(qū)甚至出現(xiàn)枯竭[8]。因此，開展黑果枸杞居群遺傳多樣性和分子評價的研究有利于其野生種質(zhì)資源的保護和可持續(xù)利用，并為黑果枸杞的科學(xué)育種及種質(zhì)創(chuàng)新提供依據(jù)。劉增根[20]利用序列相關(guān)擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）分子標(biāo)記對我國青海、甘肅、寧夏和新疆的14個野生黑果枸杞居群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進行了研究與分析。應(yīng)用篩選出的31對SRAP引物組合對黑果枸杞基因組DNA進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增，共檢測到468個有效位點，其中多態(tài)性位點398個，多態(tài)位點百分率為85.04%。Nei基因多樣性和分子方差分析（molecular variation analysis of variance，AMOVA）顯示，總的遺傳變異中15.55%存在于居群間，84.45%存在于居群內(nèi)，表明遺傳分化主要存在于種群內(nèi)。居群間具有中等的遺傳分化（st＝0.215 5）；基因流（m）為1.819 9，表明各居群間有較高水平的基因流動，能有效防止基因空間異質(zhì)性。阿力同·其米克等[21]采用分子標(biāo)記技術(shù)（inter-simple sequence repeat，ISSR）對新疆南部黑果枸杞6個自然居群及甘肅2個自然居群共115個樣品進行了DNA多態(tài)性分析。從60個隨機引物中篩選出7個有效引物，共產(chǎn)生64條DNA片段，其中50條為多態(tài)性條帶，多態(tài)位點百分率為78.1%。黑果枸杞個體間非加權(quán)組平均法聚類結(jié)果表明，同一居群的個體不能完全聚在一起，來自新疆和甘肅2區(qū)域的黑果枸杞材料也不能完全分開。探討了可能造成上述居群遺傳結(jié)構(gòu)模式的主要因素，同時提出了今后對新疆南部黑果枸杞保護工作中需進一步解決的問題。

本課題組基于前期調(diào)查與研究發(fā)現(xiàn)，同一產(chǎn)區(qū)種植和野生黑果枸杞的主要成分（次生代謝物和營養(yǎng)成分）種類一致，且含量差異不顯著[3,9]，提示發(fā)展人工種植黑果枸杞可能是一種更好并值得推廣的方式，在保障與野生黑果枸杞品質(zhì)一致的情況下實現(xiàn)該資源的健康持續(xù)利用。然而，不同產(chǎn)區(qū)的黑果枸杞部分表型性狀及有效成分種類和含量差異明顯[3,9,22]（尤以花色苷、多糖、總多酚、總黃酮等次生代謝產(chǎn)物差異顯著），由于缺乏對其次生代謝物差異機制、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與控制、生境適宜性評價等多方面的綜合研究，導(dǎo)致出現(xiàn)種質(zhì)創(chuàng)新能力差、質(zhì)量不穩(wěn)定、市場秩序混亂、種源混雜等諸多問題[2-3,9,18-20]。因此，資源品質(zhì)差異明顯和適宜性評價體系缺乏嚴(yán)重制約了黑果枸杞產(chǎn)業(yè)發(fā)展，如何保護黑果枸杞資源并在保護的基礎(chǔ)上合理開發(fā)利用這筆寶貴的財富，同時探索資源品質(zhì)形成過程和生境適宜性評價與區(qū)劃研究，探究組學(xué)技術(shù)在資源研究中的應(yīng)用，以及科學(xué)發(fā)展人工種植緩解野生資源危機，已是從事黑果枸杞研究和開發(fā)人員所關(guān)注的重大課題。

2 基因組學(xué)在黑果枸杞研究中的應(yīng)用

基因組學(xué)是一門研究生物基因組以及如何利用基因的學(xué)科[23]，主要通過對個體與群體的基因進行定性定量分析，挖掘基因型與表型之間的關(guān)系，揭示生物機體可能發(fā)生什么?；蚪M學(xué)研究方法有基因組從頭測序、重測序和簡化基因組測序，該研究主要分功能基因組學(xué)和結(jié)構(gòu)基因組學(xué)2個方面，后者的目標(biāo)是通過基因組測序與拼接獲得全基因組序列。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究包括遺傳作圖、基因組de novo測序、葉綠體和線粒體基因組、比較基因組學(xué)[24]。目前有關(guān)黑果枸杞結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究主要集中在葉綠體基因組學(xué)分析。

葉綠體是植物特有的細胞器，葉綠體基因組的特點是拷貝數(shù)高、進化速率適中、單親遺傳和不存在基因重組等。隨著現(xiàn)代測序技術(shù)和高通量、高分辨率技術(shù)平臺的不斷發(fā)展，葉綠體基因組分析在系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和物種親緣關(guān)系研究中得到廣泛應(yīng)用[25-26]。劉晶星[27]基于Illumina HiSeq 2 000測序平臺對黑果枸杞葉片基因組進行分析，獲得葉綠體基因組總長154 965 bp，GC含量為37.91%，基因區(qū)所占的比例接近60%；在130個注釋基因中，蛋白基因86個，rRNA基因8個，tRNA基因36個。另外，基因編碼乙酰輔酶A羧化酶的CT亞基，是乙酰輔酶A羧化酶表達水平的限制因子；而黑果枸杞的基因有3個位置的突變，造成其編碼的蛋白只有480 aa。而Yisilam等[28]學(xué)者測得整個葉綠體基因組的長度為154 996 bp，由2個反向重復(fù)區(qū)域（25 395 bp）、1個85 993 bp的大單拷貝區(qū)和1個18 213 bp的小單拷貝區(qū)組成?；蚪M的總體GC含量為37.90%。葉綠體基因組由111個獨特基因組成，包括30個tRNA基因、4個rRNA基因和77個蛋白質(zhì)編碼基因。黑果枸杞的序列與其他茄科葉綠體基因組一致，系統(tǒng)發(fā)育樹由MEGA6構(gòu)建，以旋花科（Convolvulaceae）物種為外群，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，黑果枸杞與茄科植物顛茄L.、馬尿泡Maxim.和(Dunn) Nakai聚在一起，具有密切的親緣關(guān)系。

Wang等[29]對寧夏植物園采集的黑果枸杞鮮葉進行完整葉綠體基因組測序，分析得到葉綠體基因組的大小為154 979 bp，包括2個反向重復(fù)區(qū)域（25 395 bp）、1個85 984 bp的大單拷貝區(qū)和1個18 205 bp的小單拷貝區(qū)組成。共預(yù)測了132個基因，包括37個tRNA、8個rRNA和86個蛋白質(zhì)編碼基因。此外，9個PcG基因具有單個內(nèi)含子，74個PcG基因沒有內(nèi)含子，另外3個基因具有2個內(nèi)含子，6個tRNA基因是單個內(nèi)含子；葉綠體基因組的總GC含量為37.90%。對黑果枸杞和其他23個完整的茄科物種葉綠體基因組進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，包括茄亞科和煙亞科以及旋花科的2個物種牽牛L、大星牽牛(Kunth) G. Don和另外2個物種(Lour.) Kuntze和Nakai為外群，用RAxML構(gòu)建的最大似然樹，系統(tǒng)發(fā)育分析進一步驗證了黑果枸杞歸入茄科植物。

Cui等[30]也獲得了黑果枸杞葉綠體基因長度（15 486 9 bp），總GC含量為37.90%。葉綠體基因組共編碼113個差異基因，包括蛋白編碼基因85個、tRNA 37個、rRNA 8個和假基因3個，基因在黑果枸杞中發(fā)生突變，且包含18個具有內(nèi)含子的基因。通過構(gòu)建最大似然法系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，寧夏枸杞L和中華枸杞Mill.有較近的親緣關(guān)系，與黑果枸杞聚為姐妹分支。上述葉綠體基因組的測序工作，豐富了黑果枸杞的基因組學(xué)數(shù)據(jù)，為黑果枸杞資源表型多元化、生態(tài)適宜性和種質(zhì)評價研究提供了科學(xué)依據(jù)。

3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在黑果枸杞研究中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從核酸水平研究特定細胞和組織在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和[31]，揭示生命機體正在發(fā)生什么。轉(zhuǎn)錄組的定義中包含時間和空間限定，通過測序分析可檢測所有正在表達基因的變化動態(tài)，并幾乎可獲得所有轉(zhuǎn)錄本，并闡明細胞或組織的生命活動狀態(tài)。高通量測序主要包括Roche 454測序技術(shù)、Illumina Sanger測序技術(shù)和ABI SOLID測序技術(shù)，目前應(yīng)用最廣泛的測序技術(shù)是由Illumina公司開發(fā)的MiSeq和HiSeq平臺，該技術(shù)測序具有通量高、準(zhǔn)確率高、速度快和成本低等特點[32-33]。

3.1 鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

目前，全世界超過1/3的農(nóng)業(yè)面積受到鹽堿化的影響。土壤鹽分是一個日益嚴(yán)重的全球性問題，它會影響植物生長和作物產(chǎn)量，給現(xiàn)代農(nóng)業(yè)帶來嚴(yán)重問題[34]。滲透脅迫伴隨著鹽分脅迫會導(dǎo)致氣孔迅速關(guān)閉，從而降低植物吸收二氧化碳的能力[35]。鹽脅迫已經(jīng)造成對枸杞屬物種光合作用和蒸騰作用的負面影響[36]。

Qin等[37]對黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，在高鹽度處理下，有141個基因差異表達，其中80個基因上調(diào)，61個基因下調(diào)。黑果枸杞鹽敏感基因主要富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的碳代謝和蛋白質(zhì)加工有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Chen等[38]利用對照和混合鹽堿處理黑果枸杞幼苗的mRNA構(gòu)建混合cDNA文庫，在優(yōu)化組裝后，共獲得68 063個獨特的轉(zhuǎn)錄序列，平均長度為877 bp；在這些序列中，4096個單基因在鹽堿混合處理后上調(diào)，4381個單基因在鹽堿混合處理后下調(diào)。

Mo等[39]開展了鹽脅迫處理黑果枸杞幼苗（21 d生，200 mol/L）和成年樹（3年生，300 mol/L）的生理表型分析，采用加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘與花青素合成、鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)的候選LrMYB112類轉(zhuǎn)錄因子，并對其調(diào)控花青素、鹽脅迫相關(guān)基因表達的功能進行了初步探究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫促進黑果枸杞花青素生物合成，啟動耐鹽脅迫的生理反應(yīng)機制，并證實了LrMYB78a、LrMYB78b和LrMYB112轉(zhuǎn)錄因子參與黑果枸杞花青素生物合成與響應(yīng)鹽脅迫。

3.2 果實發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

Ma等[40]通過研究與花青素積累相關(guān)的綠色成熟階段、表皮顏色變化階段和完全成熟階段的黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在43 573個組裝的單基因中，有12 734個在黑果枸杞的果實成熟過程中差異表達；鑒定出25個顯著差異表達的結(jié)構(gòu)基因（、、、、、、、、、、）可能與花青素生物合成相關(guān)。

Li等[41]基于Illumina HiSeq測序平臺對黑果枸杞5個不同發(fā)育階段果實顏色進行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)錄組中共鑒定出31 302個差異基因，72個關(guān)鍵候選基因?qū)⑴c類黃酮和花青素生物合成的14種酶產(chǎn)生直接影響。朱雪冰等[42]在黑果枸杞中測得1.167×108和9.695×107reads，篩選出了13個與花青素生物合成有關(guān)的基因，克隆黑果枸杞中基因的轉(zhuǎn)錄因子Sl AN2，該基因全長774 bp，編碼257個氨基酸，相對分子質(zhì)量為29 775.84，等電點為7.79。嚴(yán)莉等[43]基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析基因在黑果枸杞果實不同發(fā)育期的差異表達模式，結(jié)果表明，基因可能參與了果實不同發(fā)育時期花青素變化的調(diào)控，利用熒光定量PCR的差異表達數(shù)據(jù)進一步驗證了部分MYB轉(zhuǎn)錄因子在果實不同發(fā)育時期的花青素合成中可能起到調(diào)控作用；同時在黑果枸杞基因家族注釋得到83個MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因，為進一步研究MYB家族的基因結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

彭勇等[44]對黑果枸杞3個不同發(fā)育時期的果實進行轉(zhuǎn)錄組測序分析表明，京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集顯示亮氨酸生物合成途徑在變色期對比青果期有7個差異表達基因，黑熟期對比變色期有35個差異表達基因，且全部為上調(diào)表達；在糖酵解途徑中3個不可逆的反應(yīng)步驟限速酶基因在黑熟期均為上調(diào)表達。孟小偉等[45]對黑果枸杞果實不同發(fā)育過程進行轉(zhuǎn)錄組測序，共得到43 573條Unigene，有23 723條Unigene在基因本體（gene ontology，GO）、KEGG、真核同源群簇（euKaryotic orthologous groups，KOG）、非冗余蛋白（nonredundant protein，NR）和SwissProt 5個數(shù)據(jù)庫中得以注釋，篩選出與類黃酮生物合成有關(guān)的Unigene 45個，這為與黑果枸杞果實品質(zhì)有關(guān)基因篩選、克隆和功能分析等提供研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

3.3 花青素生物合成轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

包雪梅等[46]基于轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析，從黑果枸杞和白果枸杞（黑果變異）中共檢測到25 279個基因差異表達，其中12 381個基因在黑果枸杞表達上調(diào)，12 898個基因表達下調(diào)；KEGG富集結(jié)果顯示，共有571個差異表達基因參與植物次生代謝產(chǎn)物合成，尤其是在黃酮類和花青素生物合成代謝通路中差異最為明顯。黑果枸杞中共有8個參與花青素合成代謝的結(jié)構(gòu)基因的表達量均高于白果枸杞，表明花青素的生物合成可能與黑果枸杞黑果性狀相關(guān)。調(diào)控花青素生物合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子CL8159.Contig5_All的表達水平比白果枸杞增強了2 139.57倍，推測這個基因很有可能是控制黑果枸杞黑果性狀的候選基因。

Zeng等[47]采用Illumina Hiseq 2000平臺測定了黑果枸杞果實在5個不同發(fā)育階段花青素生物合成相關(guān)的基因序列，分離出參與黑果枸杞花青素生物合成的結(jié)構(gòu)基因（、、、、、和），從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中檢索到編碼、、、、、、、和的序列，并應(yīng)用Mega 4.0對相關(guān)基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析。上述基因在果實發(fā)育過程中的表達譜表明，在果實中轉(zhuǎn)錄豐度與花青素積累之間存在顯著的正相關(guān)；和或可能共同調(diào)控、、、和的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控黑果果實中花色苷的合成。此外，調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因的表達模式以及分支節(jié)結(jié)構(gòu)基因/的轉(zhuǎn)錄比率可能決定了黑果枸杞和寧夏枸杞果實之間花青素生物合成的表型差異。

Zong等[48]研究等位基因存在與果實顏色的關(guān)系，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果從黑果枸杞和寧夏枸杞中分離得到編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子的和。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，和與調(diào)節(jié)煙草花青素合成的關(guān)系密切，而的過度表達誘導(dǎo)煙草所有組織中花青素的生物合成，且明顯強于。此外，轉(zhuǎn)錄因子僅在黑果果實中檢測到，并在果實發(fā)育過程中增加，伴隨著花色苷的積累；而的功能多樣性和高表達水平可能是黑果枸杞果實花青素含量高的原因。上述研究結(jié)果為黑果枸杞資源改良與利用提供了重要基因資源，為花青素的生物合成與代謝提供了堅實的理論基礎(chǔ)。

4 蛋白質(zhì)組學(xué)在黑果枸杞研究中的應(yīng)用

蛋白組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對象，研究細胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學(xué)[49]，它主要利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法技術(shù)獲取某一時刻生物機體內(nèi)所有表達蛋白，揭示生物體已經(jīng)發(fā)生什么。蛋白組學(xué)是基因表達調(diào)控機制研究的一個重要工具。當(dāng)前，隨著高精確度、高分辨率、高靈敏度、高通量的生物質(zhì)譜儀器的快速發(fā)展，以及各物種基因數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的不斷完善，配合基于復(fù)雜算法的生物信息學(xué)工具，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容、研究方法和研究領(lǐng)域都發(fā)生了翻天覆地的變化[50]。目前的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法有雙向凝膠電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)、同位素的相對和絕對定量標(biāo)記技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)技術(shù)和免疫共沉淀等技術(shù)；其中，同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）、串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（tandem mass tags，TMT）是最常用的基于同位素標(biāo)記質(zhì)譜分析的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，可對多達16（8）個不同樣本進行蛋白定量比較，標(biāo)記效率和質(zhì)譜檢測靈敏度高，適用范圍廣泛[51]。

同一生物體在不同生長時間和生長環(huán)境下，基因表達情況并不完全相同，進行多器官、多時期、多維度、多水平的藥用植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究，建立藥用植物功能基因庫，可為藥用植物種質(zhì)資源評價、中藥材質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)建立、新品種選育、有效成分的合成生物學(xué)等領(lǐng)域提供分子基礎(chǔ)，推動藥用植物產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[52]。

目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在植物的研究領(lǐng)域使用廣泛，然而關(guān)于黑果枸杞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究較少。汪亞娟等[53]采用iTRAQ技術(shù)鑒定出862個黑果枸杞蛋白質(zhì)，經(jīng)100 mmol/L鹽處理7 d后黑果枸杞檢測出165個表現(xiàn)差異的蛋白質(zhì)，其中有72個蛋白質(zhì)上調(diào)，93個蛋白質(zhì)下調(diào)。并了解到鹽脅迫主要影響了黑果枸杞的能量代謝與離子運輸，其中參與離子運輸?shù)牟町惖鞍踪|(zhì)共4個，全都是上調(diào)的膜孔蛋白；參與能量代謝的差異蛋白質(zhì)共有13個，包括9個上調(diào)蛋白和4個下調(diào)蛋白。此外，黑果枸杞受到鹽脅迫時有利于黃酮類化合物的大量合成，并且以增加對香豆酸進入木質(zhì)素生物合成途徑的方式來促進黃酮類化合物的積累，從而緩解鹽脅迫帶來的氧化損傷。因此，體內(nèi)黃酮類化合物的積累可能是鹽生植物黑果枸杞對抗高鹽環(huán)境的機制之一，而且該研究鑒定出的一些有價值的蛋白質(zhì)，為進一步研究鹽生植物耐鹽機制和為作物耐鹽馴化提供了新的依據(jù)。

5 代謝組學(xué)在黑果枸杞研究中的應(yīng)用

代謝組學(xué)是對內(nèi)源性及外源性小分子代謝產(chǎn)物進行定性和定量檢測，并尋找與機體生命活動、病理變化相對應(yīng)的代謝物質(zhì)的研究方法[54]。代謝組學(xué)揭示了生命體活動事件確實發(fā)生了，它根據(jù)研究目的不同分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)，兩者各有各的優(yōu)勢和特點。靶向代謝組定性定量準(zhǔn)確，但對物質(zhì)的覆蓋率有限；而非靶向代謝組對物質(zhì)的覆蓋率廣泛，但缺乏絕對定性定量的數(shù)據(jù)[55]。

代謝組學(xué)是對基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的補充，常見的分析手段包括液質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）、氣質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatograph mass spectrometer，GC-MS）、超高效液質(zhì)聯(lián)用（ultra performance liquid chromatography mass spectrometer，UPLC-MS）、毛細管電泳質(zhì)譜聯(lián)用（capillary electrophoresis mass spectrometer，CE-MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等，四極桿線性離子阱（quadrupole-trap，Q-Trap）、四極桿飛行時間（quadrupole-time of flight，Q-TOF）及離子阱飛行時間（ion trap-time of flight，IT-TOF）等串聯(lián)質(zhì)譜也被廣泛應(yīng)用。植物代謝物種類繁多（已超過20萬種），很多醫(yī)藥資源、食品及工業(yè)原料都是植物代謝產(chǎn)物，因此，代謝組學(xué)在植物研究領(lǐng)域的應(yīng)用尤為重要。通過植物代謝組學(xué)的定性和定量分析，可闡明不同生態(tài)地理環(huán)境下代謝物的變異規(guī)律、研究同一植物不同時期或不同部位或不同產(chǎn)區(qū)代謝物種類及含量的差異、推測相應(yīng)的合成與代謝途徑以及代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等，為藥用植物資源的品質(zhì)差異成因解析、物種鑒別以及活性成分合成分子機理研究提供理論依據(jù)[56]。目前，有關(guān)黑果枸杞代謝組學(xué)的研究主要集中在鹽脅迫和果實發(fā)育過程方面。

5.1 鹽脅迫代謝組學(xué)分析

Qin等[37]發(fā)現(xiàn)黑果枸杞在鹽脅迫下有69種代謝產(chǎn)物的表達水平發(fā)生了變化，其中34種表達上調(diào)，35種表達下調(diào)。研究還發(fā)現(xiàn)正常條件下黑果枸杞中的脫落酸含量顯著低于枸杞，而在鹽脅迫處理下黑果枸杞中的脫落酸含量急劇上調(diào)，但是枸杞中并未發(fā)生顯著變化。鹽脅迫在枸杞葉片中誘導(dǎo)的代謝物變化主要通過以下途徑富集：嘌呤代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝以及蛋白質(zhì)的消化和吸收；而在鹽度壓力下，黑果枸杞葉代謝產(chǎn)物差異主要集中于不同環(huán)境中的微生物代謝、嘌呤代謝、色氨酸代謝、苯丙烷類生物合成以及黃酮和黃酮醇生物合成代謝等途徑。此外，在正常條件下，黑果枸杞比枸杞含有更高的黃酮類化合物含量，提示黑果枸杞比枸杞更耐鹽。綜上，該研究表明脫落酸和黃酮類化合物在枸杞屬植物耐鹽中發(fā)揮重要作用，該研究結(jié)果對未來作物抗鹽育種和資源馴化有重要參考價值。

5.2 成熟漿果的代謝組學(xué)分析

Li等[41]采用LC-ESI-Q-Trap-MS/MS技術(shù)對黑果枸杞和白果枸杞黃酮代謝產(chǎn)物進行差異分析，研究鑒定出15種花青素，包括天竺葵素、矮牽牛素、錦葵素和飛燕草素等，在黑果枸杞果實中發(fā)現(xiàn)23種黃酮代謝物；2種漿果的代謝物在早期苯丙烷途徑上沒有差異，從黃酮類化合物合成代謝途徑開始差異顯著。黑果枸杞成熟果實主要積累飛燕草素衍生物，白果枸杞成熟果實中的黃酮醇含量是黑色果實的2～3倍；另外，黑果枸杞成熟果實具有更多的上游底物柚皮素查耳酮和柚皮素來產(chǎn)生下游黃酮化合物，且有更多的二氫楊梅素和二氫槲皮素來合成下游花青素。同時還發(fā)現(xiàn)了黑果枸杞漿果成熟過程中存在3種花青素轉(zhuǎn)運機制，即谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運、多耐藥相關(guān)蛋白和多藥和有毒化合物外排轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運以及膜囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運。

李麗等[57]采用UPLC-Orbitrap MS技術(shù)對植物乳桿菌GH-6發(fā)酵前后黑果枸杞漿的成分進行分析，共鑒定出61個代謝物。隨后，在發(fā)酵液、原漿以及添加蔗糖及乳清蛋白后的發(fā)酵液中篩選出22個差異性代謝物，其中2種糖類、3種有機酸類、3種嘌呤類、3種氨基酸類、4種花青素類和7種小肽類，這也說明乳桿菌GH-6發(fā)酵可顯著影響黑果枸杞漿中的代謝變化。Liu等[3,9]基于黑果枸杞植物化學(xué)成分（如飛燕草素、錦葵素、矮牽牛素及其花色苷類以及多糖、多酚、黃酮、生物堿等）的色譜和質(zhì)譜研究以及代謝組學(xué)分析，建立了有效成分測定與分析技術(shù)平臺；同時分析了不同產(chǎn)區(qū)及野生和種植的黑果枸杞花青素、花色苷、黃酮、酚酸、多糖等成分含量差異以及與生態(tài)環(huán)境因子的相關(guān)性，構(gòu)建了黑果枸杞化學(xué)指紋圖譜與有效成分定量分析相結(jié)合的化學(xué)多樣性評價體系。

彭玉嬌等[58]采用LC-MS非靶向代謝組技術(shù)對黑果枸杞和寧夏枸杞漿果進行代謝物差異分析，共檢測出6982種代謝物并獲得501種差異代謝物，黑果枸杞中表達上調(diào)的差異代謝物有240種，表達下調(diào)的代謝物有261種，前50的差異代謝物中有6種是氨基酸和多肽類物質(zhì)、7種是黃酮類化合物。對總黃酮的含量分析發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞總黃酮含量較高，有5種差異代謝物參與到黃酮合成代謝途徑中，另有15種差異代謝物參與4個氨基酸代謝相關(guān)通路，提示這些代謝物的差異表達可能導(dǎo)致寧夏枸杞與黑果枸杞氨基酸的差異。該研究為深入了解兩枸杞物種中的氨基酸代謝以及對它們的差異利用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

6 多組學(xué)聯(lián)合分析在黑果枸杞研究中的應(yīng)用

多組學(xué)聯(lián)合分析方法將基因、mRNA、調(diào)控因子、蛋白、代謝等不同層面之間信息進行整合，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深層次理解各個分子之間的調(diào)控及因果關(guān)系，從而更深入探索和認(rèn)知機體生長發(fā)育進程和抵御逆境過程中復(fù)雜性狀的分子機制和遺傳基礎(chǔ)[12-13,59]。因此，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析，有助于解析黑果枸杞中代謝物合成的表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及代謝網(wǎng)絡(luò)，為挖掘到與類黃酮（花青素）生物合成和抗逆（耐鹽堿）相關(guān)的關(guān)鍵酶基因提供支撐。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的聯(lián)合分析顯示，正常條件下黑果枸杞中黃酮和類黃酮含量較高，相比于黑果枸杞鹽脅迫顯著提高了枸杞中的黃酮和類黃酮含量；另外，結(jié)果還表明枸杞中的鹽響應(yīng)基因主要富集在絲裂原活化蛋白激酶信號、氨基糖和核苷酸糖代謝、碳代謝和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而黑果枸杞中的鹽響應(yīng)基因主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的碳代謝和蛋白質(zhì)加工有關(guān)[37]?；谵D(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，證實花青素類化合物在黑果枸杞成熟漿果中的含量要明顯高于其他枸杞物種中的含量，而花青素生物合成相關(guān)基因在黑果枸杞中的表達量也要顯著性高于其他枸杞物種[41,47]。

此外，基于枸杞屬植物中的轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)，通過組裝、拼接、比對等分析發(fā)現(xiàn)在黑果枸杞中存在一個調(diào)控花色苷合成代謝的MYB轉(zhuǎn)錄因子，其表達量隨果實的發(fā)育而增加，類黃酮物質(zhì)含量也隨之增加，而該基因在寧夏枸杞中幾乎不表達[9,48]。自然群體中的等位變異與黑色果實性狀緊密關(guān)聯(lián)，在煙草里過量表達，除根部外，其他組織部位均表現(xiàn)出紫黑色。通過多組學(xué)聯(lián)合分析，初步發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草中185個基因（146上調(diào)、39個下調(diào)）產(chǎn)生差異表達，其中類黃酮生物合成代謝途徑差異最顯著。

代謝組學(xué)可以批量獲得基因表達的最終產(chǎn)物，反映了基因和蛋白表達的微小變化以及機體系統(tǒng)的生理和病理狀態(tài)；蛋白質(zhì)組學(xué)能夠動態(tài)地描述基因調(diào)節(jié)，可獲取某一時刻機體內(nèi)所有表達蛋白。因此，將蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)進行關(guān)聯(lián)分析，對基因表達的蛋白質(zhì)和代謝物進行定量測定和差異比較，有助于進一步揭示基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和次生代謝物的生物合成代謝機制。在黑果枸杞耐鹽機制研究中，學(xué)者利用蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析方法，分析了黑果枸杞愈傷組織在不同濃度鹽脅迫下的蛋白質(zhì)和化學(xué)成分，闡釋了差異性蛋白質(zhì)基因表達主要富集于離子運輸和能量代謝途徑，并且鹽脅迫有助于植株黃酮類化合物的合成與積累，緩解逆境帶來的氧化損傷[53]。

盡管目前組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在黑果枸杞中得以廣泛應(yīng)用，尤其集中在抗逆（耐鹽）和果實發(fā)育過程中的花青素合成代謝（表1），但是研究學(xué)者們對其進行的多組學(xué)聯(lián)合研究還為之甚少。顯然，單憑一種組學(xué)技術(shù)已經(jīng)無法滿足黑果枸杞適應(yīng)與進化、花色苷差異成因解析等相關(guān)深層次的研究，因此，基于多組學(xué)聯(lián)合分析闡明黑果枸杞次生代謝物（花青素、黃酮、生物堿等）合成調(diào)控機制、揭示黑果枸杞耐旱和抗鹽堿機制將是今后枸杞屬植物資源的研究重點。

表1 組學(xué)技術(shù)在黑果枸杞資源研究中的應(yīng)用

a-葉綠體基因組 b-逆境脅迫（鹽脅迫） c-果實發(fā)育涉及的花青素生物合成

a-chloroplast genome b-stress (salt stress) c-anthocyanin biosynthesis in fruit development

7 結(jié)語及展望

隨著多組學(xué)和相應(yīng)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與滲透，藥用植物資源品質(zhì)形成的探索不論在生態(tài)環(huán)境等外在因素，還是基因、蛋白質(zhì)與遺傳分化的分子水平都有了一定的推進[12,60-61]。基于多組學(xué)聯(lián)合分析是藥用植物次生代謝產(chǎn)物合成途徑和資源品質(zhì)差異成因研究的重要技術(shù)[62-63]。在進入大數(shù)據(jù)時代的背景下，基于系統(tǒng)生物學(xué)研究模式和多組學(xué)研究思路，能夠為藥用植物次生代謝物生物合成代謝調(diào)控、資源品質(zhì)綜合評價以及種質(zhì)創(chuàng)新等相關(guān)科學(xué)問題的解決打下堅實的理論基礎(chǔ)。

從已有的研究成果可以看出，各組學(xué)應(yīng)用在黑果枸杞資源研究中已經(jīng)取得了一定進展，為資源的品質(zhì)差異、次生代謝產(chǎn)物合成途徑、有效成分確定以及生境適宜性等研究提供了重要參考。然而，有關(guān)黑果枸杞資源評價、組學(xué)研究、品質(zhì)差異及其與生態(tài)環(huán)境關(guān)系方面的研究仍然存在一些不足。主要表現(xiàn)在：（1）很少有研究關(guān)注不同產(chǎn)區(qū)黑果枸杞次生代謝產(chǎn)物差異機制及生態(tài)環(huán)境對有效成分合成積累的影響，資源生境適宜性系統(tǒng)評價和區(qū)劃研究基本處于空白。（2）前期有關(guān)黑果枸杞組學(xué)研究主要集中在葉綠體基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)，缺乏蛋白質(zhì)組和代謝組及其組學(xué)間的整合分析，組學(xué)間數(shù)據(jù)交集的挖掘深度不夠，且未實現(xiàn)多組學(xué)的真正融合。

綜上所述，隨著后續(xù)黑果枸杞全基因組數(shù)據(jù)的公布，并基于化學(xué)生物學(xué)分析和多組學(xué)聯(lián)合應(yīng)用，鑒定黑果枸杞次生代謝物生物合成過程中的關(guān)鍵酶和調(diào)控因子，深入解析主要有效成分花色苷合成調(diào)控機制（圖3），結(jié)合生態(tài)環(huán)境因子的相關(guān)性分析，將對探究黑果枸杞花色苷差異成因、資源品質(zhì)形成過程和生境適宜性區(qū)劃評價具有重要的理論指導(dǎo)作用，從而促進黑果枸杞資源健康可持續(xù)開發(fā)與利用。

PAL-苯丙氨酸裂解酶 C4H-肉桂酸-4-羥化酶 4CL-4-香豆酰CoA連接酶 CHS-查耳酮合成酶 CHI-查耳酮異構(gòu)酶 F3H-黃烷酮-3-羥化酶 F3′H-類黃酮-3′-羥化酶 F3′5′H-類黃酮-3′,5′-羥化酶 DFR-二氫黃酮醇還原酶 ANS-花青素合成酶 3GT-3-糖基轉(zhuǎn)移酶 UFGT-類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶 MT-甲基轉(zhuǎn)移酶 AT-酰基轉(zhuǎn)移酶

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Application of omics technology inresources

LI Ming-zhu1,3, LIU Zeng-gen1, 2

1. Key Laboratory of Tibetan Medicine Research of Qinghai Province, Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences, Xining 810001, China 2. School of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China 3. School of Life Science, Yantai University, Yantai 264005, China

is an edible and medicinal fruit tree, which widely distributes in the arid desert and saline-alkali region of Northwest China.berries have rich secondary metabolites (such as anthocyanins, anthocyanidins, polyphenols, and polysaccharides) and high economic and ecological values, which were widely used in the field of nutritional foods, biochemical drugs, and food additives. With the continuous development of sequencing technology and omics, omics technology (genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics) and integrative multi-omics approach have become important means for the research ofresources (especially in the areas of quality evaluation, saline-alkali resistance, fruit development, and synthesis and accumulation of anthocyanins). The application of omics in recent years in comprehensive evaluation of, stress resistance, and biosynthesis and regulation of secondary metabolites was reviewed in this paper. The causes of differences in theresource quality and ecogeographic adaptation mechanism were also investigated, which provide scientific basis for theconservation, germplasm improvement and innovation and rational development and utilization of.

Murray; secondary metabolites; anthocyanin; anthocyanidin; multi-omics; medicinal resources

R282.71

A

0253 - 2670(2023)01 - 0272 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.029

2022-10-09

國家自然科學(xué)基金面上項目（32170394）；中國科學(xué)院西部之光青年學(xué)者A類項目（2019）

李明珠，碩士研究生，研究方向為中藥資源化學(xué)及品質(zhì)綜合評價。E-mail: lmz1559725@163.com

通信作者：劉增根，副研究員。Tel: (0971)6143747 E-mail: lzg2005sk@126.com

[責(zé)任編輯 崔艷麗]