李 劍， 徐鵬飛， 葉十一， 陳紅心， 周啟立， 翁長江， 熊 濤

(1.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434000； 2.大北農(nóng)集團(tuán)湖北分公司，湖北武漢 430000；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱 150069)

禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)是一種直徑為60～90 nm的無囊膜雙股DNA病毒，分為3個群，Ⅰ群又分為A～E 5個種，12個血清型[1-2]。其中，禽腺病毒4型(FAdV-4)是引起雞肝炎-心包積液綜合征的病原體，1987年該病首次被發(fā)現(xiàn)于巴基斯坦的安卡拉，隨后在北美洲、南美洲和亞洲等地傳播[3-4]。2015年6月以來在我國多個省份呈爆發(fā)式傳播，病死率高達(dá)80%，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了極大的損害[5]。其中，以山東、山西、廣西和江蘇等地的毒株報(bào)道[6-10]最多，而湖北地區(qū)的毒株鮮有報(bào)道。所以，研究湖北地區(qū)禽腺病毒4型流行病學(xué)和遺傳進(jìn)化尤為重要。禽腺病毒的衣殼蛋白有Hexon、Penton和Fiber 3種主要結(jié)構(gòu)蛋白。其中，Hexon是衣殼含量最高的蛋白，攜帶主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇，基因序列較為保守，能用于禽腺病毒的進(jìn)化分析和類型區(qū)分[11]。Fiber分為Fiber1和Fiber2 2條蛋白，F(xiàn)iber2長度比Fiber1短，且Fiber2比Fiber1蛋白活性更好[12]。Fiber2蛋白具有型和亞群特異性抗原決定簇，能夠識別宿主細(xì)胞的特異受體并與受體相結(jié)合，從而介導(dǎo)病毒的感染，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒特異性中和抗體，在免疫反應(yīng)方面起重要的作用[13-14]。因此，F(xiàn)iber2蛋白可作為基因工程亞單位疫苗的候選者。田開月等成功在大腸桿菌中表達(dá)了禽腺病毒4型的Fiber2蛋白，而國內(nèi)學(xué)者對禽腺病毒4型的Fiber2蛋白在乳酸菌中表達(dá)研究較少[15]。本研究將采集于湖北省某養(yǎng)雞場的病變組織樣處理后接種雞肝癌細(xì)胞(LMH)，分離出2株禽腺病毒，對其進(jìn)行PCR鑒定和Hexon基因測序分析，并根據(jù)Hexon基因序列分析結(jié)果研究其遺傳進(jìn)化關(guān)系，并以其基因組DNA為模板擴(kuò)增出Fiber2基因，構(gòu)建乳酸菌重組表達(dá)系統(tǒng)，并對Fiber2蛋白進(jìn)行表達(dá)，以期為禽腺病毒4型口服疫苗的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及病料

細(xì)胞：LMH購自美國生物資源中心(ATCC)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代凍存。

病料：病死雞肝臟等病變組織樣，2020年9月10日無菌采集于湖北省荊州市某養(yǎng)雞場，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成及測序

引物合成及測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 主要試劑

Waymouth’s MB 752/1培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清、胰蛋白酶、青-鏈霉素雙抗、Gelatin，均購自Gibco公司；病毒基因組DNA提取試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD-18T 載體、HindⅢ和XbaⅠ限制酶，均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；pNZ 8148-MC 1061、MC 1061、NZ 9000菌種，均購自上海瑞楚生物科技有限公司；乳酸鏈球菌素(Nisin)，購自北京酷來搏科技有限公司；NC膜，購自北京欣華綠源科技有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG、小鼠抗 6His-tag 單克隆抗體，均購自Proteintech公司；Omni-ECL 基礎(chǔ)型化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.4 病料的處理

2020年9月13日于長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物安全實(shí)驗(yàn)室取收集到的病變組織按1 g ∶10 mL加入PBS緩沖液研磨，反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心20 min后取上清。過濾除菌后按1 ∶1 000體積比加入青-鏈霉素雙抗，-80 ℃保存待用。

1.5 病毒的分離

LMH細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)后，待LMH細(xì)胞長滿80%時，棄去培養(yǎng)液并用PBS緩沖液洗2次，將待用病毒懸液按1 ∶10體積比接入LMH細(xì)胞，37 ℃孵育60 min，然后加入含1%胎牛血清的培養(yǎng)液，同時設(shè)正常的細(xì)胞陰性對照，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。每日觀察LMH細(xì)胞的病變情況，待LMH細(xì)胞出現(xiàn)80%病變反復(fù)凍融3次后，6 000 r/min 離心15 min收集病毒上清，-80 ℃保存。按照上述方法將病毒懸液盲傳3代。

1.6 PCR檢測

參考GenBank中登錄的FAdV-4的Hexon基因序列(登錄號為MK650194.1)，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)1對特異性鑒定引物：FAdV4-F：5′-C A A C T A C A T C G G G T T C A G G G-3′，F(xiàn)AdV-R：5′-G G T G G C G T T T C T C A G C A T-3′，擴(kuò)增片段長度為958 bp。采用病毒基因組DNA提取試劑盒提取第4代病毒懸液的基因組DNA，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 病毒含量測定

采用1%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液對病毒懸液進(jìn)行10倍倍比稀釋，取長滿80% LMH細(xì)胞的96孔板，棄去培養(yǎng)液并用PBS緩沖液洗2次，然后每孔接入 100 μL 病毒稀釋液，每個稀釋度8孔，并設(shè)立正常細(xì)胞陰性對照。37 ℃孵育60 min，再加入1%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。每日觀察并記錄病變情況，并用Reed-Muench法計(jì)算病毒含量。

1.8 Hexon基因的擴(kuò)增及測序

參考GenBank中登錄的FAdV-4的全基因組序列(登錄號為MG856954.1)，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)了覆蓋Hexon基因全部序列的引物：Hexon-F：5′-G T A T G T A T G T C G C G T T T C G-3′，Hexon-R：5′-G C A T C G C G T C G T A T T T A A-3′，擴(kuò)增片段長度為3 144 bp。以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測并回收?；厥债a(chǎn)物連接至pMD18-T載體，然后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落振蕩培養(yǎng)后用菌液進(jìn)行PCR鑒定，鑒定為陽性的菌液送公司測序。

1.9 Hexon基因的遺傳進(jìn)化分析

將測序結(jié)果用DNAstar 7.1.0中的SeqMan進(jìn)行拼接，得到的Hexon基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的FAdV參考毒株進(jìn)行BLAST比對，并使用MAGE X構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

1.10 Fiber2基因的克隆

參考GenBank中登錄的FAdV-4的Fiber2基因序列(登錄號為HQ709232.1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增Fiber2基因的引物，并插入酶切位點(diǎn)，6×His標(biāo)簽和保護(hù)堿基，F(xiàn)iber2-F：A T A T C T A G A A T G C T C C G G G C C C C T A A，F(xiàn)iber2-R：C G C A A G C T T A T G A T G A T G A T G A T G A T G T T A C G G G A C G G A G G C，擴(kuò)增片段長度為1 440 bp。以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測并回收?；厥债a(chǎn)物經(jīng)限制酶HindⅢ和XbaⅠ酶切，并對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收。

1.11 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

pNZ8148載體經(jīng)限制酶HindⅢ和XbaⅠ酶切后，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收。pNZ8148載體酶切產(chǎn)物和Fiber2基因酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶在16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MC1061感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氯霉素(10 μg/mL)的固體LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h，挑取單菌落振蕩培養(yǎng)后用菌液進(jìn)行PCR鑒定。提取陽性菌液的質(zhì)粒，雙酶切鑒定，鑒定為陽性的質(zhì)粒送公司測序，測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒保存待用。

1.12 Fiber2蛋白的表達(dá)及鑒定

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pNZ8148-Fiber2電轉(zhuǎn)化至乳酸菌NZ 9000感受態(tài)細(xì)胞并涂布于含氯霉素(10 μg/mL)的固體GM17平板，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d。挑取單菌落于30 ℃靜置培養(yǎng)后用菌液進(jìn)行PCR鑒定。將鑒定為陽性的菌液按1 ∶100體積比接種于40 mL含氯霉素(10 μg/mL)的液體GM17培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)至菌液D600 nm達(dá)到0.4～0.6時，加入Nisin，使之終濃度為0、10、50、100 ng/mL，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng) 12 h。8 000 r/min離心15 min收集菌體沉淀，沉淀用PBS緩沖液洗2次后重懸，加入終濃度為 1 mg/mL 溶菌酶37 ℃孵育20 min。然后在超聲波下裂解，4 ℃條件下12 000 r/min離心 20 min 后分別取上清和沉淀，沉淀用等量PBS緩沖液重懸，分別取 30 μL 加蛋白上樣緩沖液煮沸后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析蛋白的表達(dá)方式。蛋白樣經(jīng)SDS-PAGE分析后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素(NC)膜上，采用TBST溶液洗滌后，加入含5%脫脂奶粉的TBST溶液于室溫封閉 2 h，采用一抗稀釋液(6His-tag單克隆抗體，稀釋比為1 ∶5 000)4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗滌后用二抗稀釋液(HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG，稀釋比 1 ∶2 500)室溫孵育2 h，TBST洗滌后ECL顯影觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離

由圖1可知，將處理后的病毒懸液無菌接種到LMH細(xì)胞盲傳至第3代96 h后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞間隙變大、形態(tài)皺縮，而對照組細(xì)胞生長良好、形態(tài)正常，未出現(xiàn)細(xì)胞病變。

2.2 PCR鑒定

由圖2可知，對鑒定引物擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行電泳檢測，得到的片段大小為958 bp，與目的片段大小一致。

2.3 病毒含量測定

以5 d的觀察結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，通過計(jì)算得出第6代病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)為10-3.1/mL。

2.4 Hexon基因的擴(kuò)增及測序

由圖3可知，對擴(kuò)增DNA片段進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果得到3 144 bp大小的片段，與預(yù)期片段大小一致。經(jīng)過克隆測序后，利用DNA Star對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到長度為2 814 bp的Hexon基因序列。

2.5 病毒Hexon基因的遺傳進(jìn)化分析

將測序后拼接得到的Hexon基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的FAdV參考毒株進(jìn)行BLAST比對，與FAdV-4同源性高達(dá)99.86%，說明成功分離了2株禽腺病毒4型，并分別命名為HBJZ2021A(病毒1)和HBJZ2021B(病毒2)。由圖4可知，將Hexon基因序列與數(shù)據(jù)庫中的34個 FAdV參考毒株的基因序列利用鄰接(Neighbor-Joining)法序列比對后構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)HBJZ2021A株和HBJZ2021B株病毒的親緣關(guān)系很近，處于同一小分支；而與國內(nèi)山東、浙江和北京等地區(qū)的毒株親緣關(guān)系較近，處于同一分支；與國外巴基斯坦、奧地利、墨西哥等國家的毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，處于不同的分支。

2.6 Fiber2基因的擴(kuò)增

由圖5可知，以病毒全基因組為模板擴(kuò)增的Fiber2基因產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢測得到1 440 bp大小的片段，與預(yù)期片段大小一致。

2.7 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

由圖6可知，以隨機(jī)挑取單菌落過夜培養(yǎng)的菌液為模板，采用pNZ8148載體的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，提取陽性菌液的質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)限制酶HindⅢ和XbaⅠ雙酶切，獲得2條特異性條帶。其中，一條為Fiber2基因片段(1 440 bp)，另一條為pNZ8148載體片段(3 167 bp)，與預(yù)期結(jié)果一致。重組質(zhì)粒送公司測序，分析測序結(jié)果正確，表明成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pNZ8148-Fiber2。

2.8 Fiber2蛋白的表達(dá)與鑒定

由圖7可知，設(shè)置Nisin濃度梯度對重組質(zhì)粒乳酸菌NZ 9000誘導(dǎo)表達(dá)，對誘導(dǎo)所得蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測， 約49 ku處出現(xiàn)1條特異性蛋白條帶，與預(yù)期蛋白大小一致，重組Fiber2蛋白成功在上清液中表達(dá)，同時在Nisin誘導(dǎo)濃度為 50 ng/mL 時表達(dá)量最大。經(jīng)Western-Blot鑒定，由圖8可知， 結(jié)果顯示在49 ku處出現(xiàn)1條特異性印跡，進(jìn)一步說明Fiber2蛋白表達(dá)成功。

3 討論與結(jié)論

禽腺病毒在LMH細(xì)胞上能夠穩(wěn)定傳代并增殖，且病毒含量高[16]。在對LMH細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，禽腺病毒不易貼壁、生長緩慢，參考ATCC官網(wǎng)上對LMH細(xì)胞培養(yǎng)方法的建議，采用 0.1% Gelatin溶液于4 ℃覆蓋處理細(xì)胞瓶內(nèi)壁的方法有助于其貼壁。

根據(jù)遺傳進(jìn)化樹可知，國內(nèi)禽腺病毒毒株多為4型，其他型主要分布在國外，HBJZ2021A株和HBJZ2021B株與國內(nèi)山東、浙江、北京、四川、上海、江蘇、黑龍江等地區(qū)的毒株親緣關(guān)系較近，處于同一個分支上。這與我國Ⅰ群禽腺病毒主要以血清4型為主，呈散發(fā)性流行[17]有關(guān)。2015年，禽腺病毒4型于山東地區(qū)暴發(fā)，隨后迅速傳播至周邊多個地區(qū)[16]。遺傳進(jìn)化樹顯示，國內(nèi)以山東地區(qū)毒株報(bào)道最多，其他地區(qū)多為零散報(bào)道，同時，部分山東地區(qū)毒株與巴基斯坦、墨西哥和加拿大等國外毒株親緣較近。這些側(cè)面說明了禽腺病4型是從山東地區(qū)傳入國內(nèi)并傳播至湖北地區(qū)的，為我國湖北地區(qū)禽腺病4型流行病學(xué)情況提供了理論依據(jù)。

乳酸菌是一類在自然界和生物體中廣泛存在的革蘭氏陽性細(xì)菌，有多個分屬，是公認(rèn)的綠色安全級微生物[18]。21世紀(jì)初，國內(nèi)外學(xué)者致力于以乳酸菌作為基因工程受體菌對抗原、抗體、酶類、細(xì)胞因子等外源蛋白進(jìn)行重組表達(dá)的研究[19-20]。乳酸菌可作為活載體疫苗菌株，具有以下突出優(yōu)點(diǎn)：乳酸菌是無強(qiáng)抗原性的食品級菌種；自身分泌蛋白較少，降低了對外源重組蛋白的干擾；不會產(chǎn)生蛋白酶到胞外，使外源重組蛋白不易發(fā)生降解[21]。段欣強(qiáng)等將犬細(xì)小病毒VP2基因成功克隆至PMG36e載體，電轉(zhuǎn)至乳酸菌MG1363，成功表達(dá)了VP2蛋白，該研究為乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)病毒衣殼蛋白提供了依據(jù)[22]。Nisin可誘導(dǎo)含有nisI基因的乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)，可提高外源蛋白的表達(dá)量，且誘導(dǎo)效率是無誘導(dǎo)的1 000倍以上[23]。試驗(yàn)采用不同濃度梯度Nisin對重組表達(dá)載體pNZ8148-Fiber2進(jìn)行誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)，加入Nisin可提高重組Fiber2蛋白的表達(dá)量，并且在Nisin誘導(dǎo)濃度為50 ng/mL時，表達(dá)量最大。本研究為禽腺病毒4型湖北地區(qū)的流行情況及其口服疫苗的開發(fā)提供了參考依據(jù)。