丁祥青， 畢遠洋， 陳佳婷， 向 雙， 練芳松， 李文芳， 吳麗君， 鄒雙全

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院，福建福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建福州 350002；3.福建省洋口國有林場，福建南平 353001； 4.福建省林業(yè)科學(xué)研究院，福建福州 350012)

金花茶隸屬于山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)金花茶組(sect.ChrysanthaChang)植物，是山茶花中唯一的珍稀金黃色花瓣類型[1]。花開時呈杯、壺或碗狀，花瓣呈亮麗的金黃色，十分奪目，花瓣蠟質(zhì)似半透明，晶瑩且油潤，觀賞價值極高，被譽為“植物界大熊貓”“幻想中的黃色山茶”，被列為我國一級或二級保護植物[2]。同時，金花茶的葉、花等器官中含有多種活性成分，如多酚、多糖、黃酮類、皂苷、氨基酸等，在食品或中藥中發(fā)揮重要作用。金花茶植物主要分布在我國南部亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)和越南北部熱帶季風(fēng)區(qū)，屬分布極為狹窄的植物種群，其狹窄棲息地的氣候差異大，導(dǎo)致金花茶的花、葉形態(tài)變異豐富，迄今為止已發(fā)掘金花茶植物42種5變種[3]。抱莖金花茶也稱越南黃抱莖金花茶，是一種重要的金花茶植物，因其葉子和莖相抱而得名，其造型獨特，花型優(yōu)美，近年來在園林和園藝界頗受關(guān)注。

葉綠體基因組起源于古老的誘捕事件，原始的真核生物捕獲并吞噬了古藍藻成為內(nèi)共生體，在漫長的進化過程中，藍藻基因組由于大量基因轉(zhuǎn)移到真核生物核基因組中導(dǎo)致其在遺傳上依賴于真核生物而成為一質(zhì)體基因組，真核生物也因此從異養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)。植物葉綠體基因組(chloroplast DNA，簡稱cpDNA)因進化極為保守通常為典型的環(huán)狀雙鏈四分體結(jié)構(gòu)[4-6]，具有1個大單拷貝區(qū)(large single copy，簡稱LSC)、1個小單拷貝區(qū)(small single copy，簡稱SSC)和1對反向重復(fù)區(qū)(inverted repeat，簡稱IR)。被子植物葉綠體基因組通?；蚪Y(jié)構(gòu)、基因順序和含量高度保守，加上結(jié)構(gòu)簡單、分子量小，具有易解析、極少發(fā)生重組和變異、母系遺傳、進化路線獨立等特點，在物種鑒定和親緣關(guān)系研究等方面具有獨特應(yīng)用價值和發(fā)展前景[7-8]。

前人對金花茶組植物的分類大都基于表型或者簡單的分子標記，表型分類易受環(huán)境影響，片段序列分子標記不能完全反映DNA相應(yīng)部位的堿基變異。此外，這些分析所涉及物種不夠全面，使得金花茶植物鑒定困難、親緣關(guān)系紊亂，給黃色山茶花種質(zhì)創(chuàng)新帶來巨大困難。現(xiàn)今山茶屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系尚存爭議，雖然此前有2項重要研究[9-10]揭示了部分山茶屬植物的葉綠體基因組，為山茶屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究提供了證據(jù)，但山茶屬系統(tǒng)發(fā)育的重建仍缺乏大量信息[11]。本研究首次利用Illumina測序數(shù)據(jù)對抱莖金花茶葉綠體全基因組進行了表征，抱莖金花茶葉綠體基因組序列的揭示將為山茶屬系統(tǒng)發(fā)育、金花茶植物分子鑒定等研究提供大量信息位點。

1 材料與方法

1.1 文庫構(gòu)建和測序

本研究試驗材料2020年采集于福建省洋口國有林場(117°48′54.18″E，26°47′30.16″N)。采用改良的十六烷基三甲溴化銨法(cetylrimethylammonium bromide，簡稱CTAB)從抱莖金花茶嫩葉中提取DNA，用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測DNA的濃度和質(zhì)量，將高質(zhì)量的DNA使用Covaris儀超聲波打斷，通過末端修復(fù)、DNA片段3′加A、連接接頭處理后，選取270 bp的DNA片段進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行引物二聚體去除后，用于構(gòu)建文庫。最后將質(zhì)量檢測合格的文庫在Illumina平臺進行測序。

1.2 序列拼接及注釋

SOAPnuke 1.6.5 (https：//github.com/BGI-flexlab/SOAPnuke) 用于過濾原始數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量序列，過濾參數(shù)為-n 0.05-l 20-q 0.4-i-Q 2-G-M 2-A 0.5-d。本研究共獲得了19.03 Gb clean data。用 GetOrganelle 軟件[12]對clean data進行自動化組裝。組裝完成后用Bandage 軟件可視化，去除多余contig并編輯成環(huán)狀，環(huán)狀序列即為抱莖金花茶葉綠體全基因組序列。以凹脈金花茶(Camelliaimpressinervis)(NC022461)的全葉綠體基因組為參考，用 Plastid Genome Annotator軟件[13]對抱莖金花茶葉綠體全基因組序列進行預(yù)測基因注釋。用 Geneious 軟件可視化注釋結(jié)果并人工檢查編碼基因的起始密碼子和終止密碼子，得到抱莖金花茶全葉綠體基因組的最終注釋結(jié)果GenBank文件。組裝注釋好的抱莖金花茶葉綠體全基因組fasta文件和GenBank文件提交至 NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(訪問號為OL435568)，用Organellar Genome DRAW (OGDRAW) 軟件可視化抱莖金花茶葉綠體全基因組。

1.3 金花茶植物葉綠體基因組比較分析

從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫下載山茶(Camelliajaponica)等5個山茶屬植物的葉綠體基因組數(shù)據(jù)，用在線網(wǎng)站IRscope(https：//irscope.shinyapps.io/irapp/)進行IR邊界可視化分析。 從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫下載貴州金花茶(Camelliahuana)等9個金花茶植物的葉綠體基因組數(shù)據(jù)(其中顯脈金花茶Camelliaeuphlebia葉綠體基因組數(shù)據(jù)為筆者所在課題組測序組裝注釋并上傳)，用在線網(wǎng)站mVISTA(http：//genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml)進行葉綠體基因組比對可視化分析。使用本地mafft進行基因序列比對。

1.4 重復(fù)序列及SSR鑒定

用在線軟件REPuter鑒定抱莖金花茶cpDNA中的重復(fù)序列，包括正向重復(fù)(F)、反向重復(fù)(R)、互補重復(fù)(C)和回文重復(fù)(P)，最小重復(fù)設(shè)置為 30 bp，最小重復(fù)序列長度距離設(shè)置為3。用在線網(wǎng)站MISA(https：//webblast.ipk-gatersleben.de/misa/)進行簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，簡稱SSR)識別，將單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的最小重復(fù)數(shù)分別設(shè)置為8、5、4、3、3、3，2個SSR之間的最小距離設(shè)置為100 bp。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫下載大頭茶(Polysporaaxillaris)、長果大頭茶(Polysporalongicarpa)和18個金花茶植物的葉綠體基因組序列。用本地MAFFT進行多序列比對，以大頭茶(Polysporaaxillaris)和長果大頭茶(Polysporalongicarpa)為外類群用在線網(wǎng)站CIPRES(http：//www.phylo.org/)的RAxML-HPC2 on XSEDE構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用 Bootstrap method 進行自展值檢驗，設(shè)置1 000次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抱莖金花茶葉綠體基因組基本特征

抱莖金花茶葉綠體基因組為共價閉合的雙鏈環(huán)狀分子，全長156 591 bp，LSC為86 172 bp、 SSC為18 275 bp、IR為26 072 bp(圖1)。抱莖金花茶葉綠體基因組中共預(yù)測注釋到134個基因(表 1)，包括88個蛋白編碼基因，38個 tRNA 基因和8 個 rRNA 基因。88個蛋白編碼基因中包含29個與自我復(fù)制有關(guān)的基因，45個與光合作用有關(guān)的基因，6個其他編碼蛋白質(zhì)的基因和8個功能未知的基因。134個基因中有95個基因是獨特的，其余39 個基因位于反向重復(fù)區(qū)，位于反向重復(fù)區(qū)的基因包含17 個蛋白編碼基因(1 個rps19、1個ycf1，1個ycf68，2個rpl2、2 個rpl23、2個ycf2、2 個ycf15、2個ndhB、2 個rps7、2個rps12)，14 個 tRNA 基因(2 個trnI-CAU、2 個trnL-CAA、2 個trnV-GAC、2 個trnL-GAU、2 個trnA-UGC、2 個trnR-ACG、2 個trnN-GUU)和 8 個rRNA 基因(2 個rrn16、2 個rrn23、2個rrn4.5、2個rrn5)。抱莖金花茶葉綠體基因組中有16個基因含有1個內(nèi)含子，2個(clpP、ycf3)基因含有2個內(nèi)含子。抱莖金花茶全葉綠體基因組GC 含量為37.3%，AT 含量為62.7%。

2.2 IR 邊界的擴張與收縮

通過比較6種山茶屬植物(山茶、毛瓣金花茶、貴州金花茶、離蕊金花茶、凹脈金花茶、抱莖金花茶)葉綠體基因組 IR 區(qū)與 LSC 和 SSC 區(qū)的邊界，發(fā)現(xiàn)山茶屬植物的葉綠體基因組較為保守，但總體上金花茶植物與山茶的葉綠體基因組邊界存在一定差異(圖2)。葉綠體基因組最長的為毛瓣金花茶，為156 993 bp；最短的為抱莖金花茶，為156 591 bp。其基因組長度的差異主要發(fā)生在 LSC區(qū)，相比于山茶，5種金花茶植物的IR區(qū)更長而SSC區(qū)更短，表明金花茶植物在進化過程中葉綠體基因組IR區(qū)可能有一定擴張。6個山茶屬植物的rps19基因均跨越 LSC 和 IRb 邊界；毛瓣金花茶和貴州金花茶的ndhF基因跨越 IRb 和 SSC，而其他4種植物的ndhF基因完全位于SSC；ycf1基因均跨越 SSC 和 IRa；trnH基因均位于位于LSC。

表1 抱莖金花茶葉綠體基因組注釋基因

2.3 重復(fù)序列和SSR分析

重復(fù)序列分析結(jié)果如圖 3所示，抱莖金花茶葉綠體基因組含36條重復(fù)序列，其中有21條回文重復(fù)(P)和15條正向重復(fù)(F)，重復(fù)序列長度范圍為30～64 bp。在抱莖金花茶葉綠體全基因組中檢測到67個SSRs位點，包含6種堿基重復(fù)類型，其中單堿基重復(fù)48個、二堿基重復(fù)4個、三堿基重復(fù)1個、四堿基重復(fù)11個、六堿基重復(fù)2個，混合型SSR 1個。67個SSR中有40個位于基因間區(qū)，10個位于內(nèi)含子，17個位于外顯子。

2.4 金花茶植物葉綠體基因組比較

以毛瓣金花茶(Camelliapubipetala)葉綠體基因組序列為參考，對9種金花茶植物的葉綠體基因組序列進行了可視化比對分析(圖4)。金花茶植物葉綠體基因組序列高度相似，表明其進化十分保守。但金花茶植物葉綠體基因組序列依然存在一些差異位點，且差異性表現(xiàn)為非編碼區(qū)>編碼區(qū)、LSC>SSC>IR。編碼區(qū)存在較高差異的序列為rps16和ycf3基因，非編碼區(qū)存在較高差異的序列為ycf4-cemA、ycf15-trnL-CAA和rrn5-trnR-ACG，這些高變異序列經(jīng)后續(xù)深入研究有望成為金花茶植物可靠的分子標記。隨后選取毛瓣金花茶和抱莖金花茶的ycf15-trnL-CAA序列進行比對(圖5)，這段序列長度為370 bp，在215 bp和306～309 bp的位置存在差異，可以有效區(qū)別毛瓣金花茶和抱莖金花茶，堿基差異可能是由于不同的生存環(huán)境造成。

2.5 系統(tǒng)進化分析

為了解析金花茶植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以大頭茶和長果大頭茶為外類群，利用19個金花茶物種的全葉綠體基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果(圖 6)表明，金花茶(NC024661)、小果金花茶、龍州金花茶、金花茶(NC039645)、顯脈金花茶組成的分支和抱莖金花茶的分支互為姊妹分支，具有較近的親緣關(guān)系，且自展支持率為68%。小黃花茶在金花茶組植物中形成一個基部分支，然后是抱莖金花茶。根據(jù)聚類結(jié)果，可以將所選金花茶植物歸為6個大類。第1類為小黃花茶；第2類為抱莖金花茶、顯脈金花茶這一分支；第3類為簇蕊金花茶；第4類為薄葉金花茶、小花進化茶、富寧金花茶、離蕊金花茶；第5類為凹脈金花茶、東興金花茶；第6類為頂生金花茶、毛瓣金花茶、貴州金花茶、崇左金花茶、四季金花茶。每一類的金花茶植物彼此間有較近的親緣關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

本研究采用雙末端測序策略對抱莖金花茶進行了基因組重測序，組裝并注釋了抱莖金花茶的全葉綠體基因組，這為金花茶植物的物種鑒定和親緣關(guān)系等研究提供了數(shù)據(jù)支持。抱莖金花茶全葉綠體基因組大小、結(jié)構(gòu)、基因組成和順序、CG含量等均與山茶屬其他已報道的植物(山茶、浙江紅花油茶、凹脈金花茶等)相似。分析發(fā)現(xiàn)，抱莖金花茶葉綠體基因組ndhD具有非標準起始密碼子ACG。一些山茶屬植物atpB和atpE有3 bp的重疊區(qū)域，psbC和psbD有52 bp的重疊區(qū)域[10]，而在抱莖金花茶中atpB和atpE的重疊區(qū)域為4 bp，psbC和psbD的重疊區(qū)域為52 bp。此外，在抱莖金花茶中trnP-GGG和trnP-UGG重疊，這與油茶結(jié)論[14]一致。值得注意的是，大多數(shù)山茶屬植物葉綠體全基因組GC含量均為37.3%，基因組的 GC 含量是判斷物種間親緣關(guān)系的重要指標[15]；在被子植物的很多類群中infA和rps16常從葉綠體基因組中丟失[16]，而在山茶屬葉綠體基因組中這些基因依然保留；相比于禾本科(132 bp)和豆科(287 bp)[10]，抱莖金花茶的重復(fù)序列長度較短(30～64 bp)且數(shù)量相對較少，種種跡象均表明，山茶屬植物葉綠體基因組的進化可能是緩慢而保守的。

簡單重復(fù)序列(SSR)是指分布在整個基因組中 1～6 bp 的重復(fù)序列，是一種高效分子標記[7，17]。在抱莖金花茶 cpDNA 中發(fā)現(xiàn) 67 個 SSR位點，出現(xiàn)最多的 SSR為單堿基重復(fù)，全部由 A/T 組成，而在二至六堿基重復(fù)中也有明顯的A/T堿基偏好性。在抱莖金花茶中檢測到的SSR包含6種堿基重復(fù)類型，而在紅花油茶中僅鑒定出了A/T 單堿基重復(fù)類型[4]，表明同為山茶屬的抱莖金花茶和紅花油茶的葉綠體基因組序列存在較大差異。近年來，基于葉綠體基因組篩選DNA 條形碼進行物種鑒定的技術(shù)日趨成熟[18-19]，陳瑩等在進行金花茶組種間鑒別研究中發(fā)現(xiàn)rpl16系列和psbA-tmH序列能準確鑒別毛瓣金花茶[20]，本研究鑒定了rps16、ycf3、ycf4-cemA、ycf15-trnL-CAA和rrn5-trnR-ACG等高變異序列，這些序列的揭示能夠為金花茶植物DNA 條形碼的開發(fā)提供大量信息位點。

金花茶首次在我國廣西發(fā)現(xiàn)，其金黃色、蠟質(zhì)光澤的花瓣填補了山茶家族沒有金黃色花的空白。研究者經(jīng)過30多年的努力，明確了最適作為培育黃色系山茶花品種的雜交父母本分別為金花茶植物和山茶植物[2]。由于金花茶植物表型、生境相似，難以分辨，大量雜交種存在鑒定困難、親本不明、親緣關(guān)系紊亂等問題，嚴重滯緩了黃色山茶花新品種的培育進程。因此，明確金花茶植物間的親緣關(guān)系對于黃色山茶花的培育具有重要價值。肖麗梅通過對金花茶植物花粉形態(tài)聚類分析認為，毛籽金花茶與東興金花茶的親緣關(guān)系較近[21]；覃冬梅通過對金花茶葉片形態(tài)進行聚類分析認為，檸檬黃金花茶和四季金花茶親緣關(guān)系較近[22]；劉付永清利用葉綠體小單拷貝序列對金花茶植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行研究，認為地理分布相近的金花茶植物親緣關(guān)系也較近[23]。本研究結(jié)果表明，抱莖金花茶和金花茶(NC024661)、小果金花茶、龍州金花茶、金花茶(NC039645)、顯脈金花茶等親緣關(guān)系較近，為雜交育種培育黃色山茶花奠定了相關(guān)理論基礎(chǔ)。