陳和平 李波 姜黎 曾洪燕 袁呈山

【摘要】探討用代謝組學(xué)結(jié)合GC-MS法對薰衣草水提液保護(hù)心肌代謝產(chǎn)物提取方法的比較研究。通過比對三種不同淬滅方法：60%甲醇/H2O，80%甲醇/H2O，以及80%甲醇/甘油，并以細(xì)胞內(nèi)腺苷酸濃度（ATP、ADP和AMP）為標(biāo)準(zhǔn)來評估淬滅效率；采用氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）對沸乙醇提取法（BE），新式提取法（NE），凍融甲醇提取法（FTM）代謝成分的多少進(jìn)行比較分析。對細(xì)胞外代謝物比較顯示，NE法可以提取出更多數(shù)量的細(xì)胞外代謝物。淬滅方法評估結(jié)果顯示，80%甲醇/甘油的淬滅方法中ATP泄漏量最小。薰衣草水提液濃度及其對心肌功能的保護(hù)作用結(jié)果顯示，60mg/L的薰衣草提取液（LAD）時(shí)流出液中CK和LDH的水平顯著降低，對心臟有最佳保護(hù)作用。大鼠血液成分分析結(jié)果顯示，經(jīng)LAD處理后的血液成分在RT（實(shí)時(shí)12.71min）處有明顯不同，C17H23NO2豐度最高。

【關(guān)鍵詞】薰衣草水提液；心肌保護(hù)作用；淬滅提取；GC-MS；ATP；回收率

A comparative study on the extraction of cardioprotective metabolites from Lavandula augustifolia aqueous extracts based on metabolomics combined with GC-MS

Chen Heping1， Li Bo1， Jiang Li1， Zeng Hongyan2， Yuan Chengshan3

1.The 3rd Afficiated Hospital of Chengdu Medical College（Pidu District Peoples Hospital）Chengdu， Sichuan 611730， China；2.Chengdu Pidu District Hospital of TCM， Chengdu， Sichuan 611730， China；3.State Key Laboratory of Applied Organic Chemistry， Lanzhou University， Lanzhou Gansu 730000， China

【Abstract】 To investigate the comparative study on the extraction of cardioprotective metabolites from the Lavandula augustifolia aqueous extract by metabolomics combined with GC-MS. The quenching efficiency was evaluated by comparing three different quenching methods： 60% methanol/H2O， 80% methanol/H2O， and 80% methanol/glycerol， and using intracellular adenosine concentrations （ATP， ADP， and AMP） as the standard. The results were compared with those of the extracellular metabolites. A comparison of the extracellular metabolites showed that the NE method could extract a higher amount of extracellular metabolites. The evaluation of quenching methods showed that the quenching method with 80% methanol/glycerol had the least amount of ATP leakage. The results of Lavandula augustifolia aqueous extract concentration and its protective effect on myocardial function showed that the levels of CK and LDH in the effluent were significantly reduced at 60 mg/ L of Lavandula augustifolia extract （LAD）， which had the best protective effect on the heart. The results of blood composition analysis in rats showed that the blood composition after LAD treatment was significantly different at RT （12.71 min in real time） with the highest abundance of C17H23NO2.

【Key Words】Lavandula augustifolia； Quenching； extraction； GC-MS； ATP； Recovery

薰衣草作為我國民族藥物，主要制成揮發(fā)性制劑和傳統(tǒng)藥物，用于腹脹、頭暈、頭痛、心悸、氣短和關(guān)節(jié)痛等癥狀的治療[1]。早期研究表明，不僅薰衣草精油對大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)具有松弛作用，對冠狀動(dòng)脈結(jié)扎所致的心肌缺血或心律不齊具有明顯保護(hù)作用，而且薰衣草水提液中含有保護(hù)心臟的有效成分[2]，近年來，隨著代謝物譜分析技術(shù)的發(fā)展，代謝組學(xué)平臺(tái)（綜合性代謝物分析）在功能基因組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[3-4]。但目前用于對薰衣草水提液保護(hù)心肌代謝產(chǎn)物的研究較少。

1 儀器與試藥

氣質(zhì)聯(lián)用儀GC-MS-QP2010，日本島津公司生產(chǎn)，薰衣草由寧波芳香碼頭生物科技有限公司提供，肌酸激酶（CK）試劑盒和乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒均購自中國南京生物工程研究所，2， 3， 5-三苯基氯化四氮唑（TTC）和均勻藍(lán)均購自Sigma-Aldrich公司。

健康雄性大鼠（Wistar， SPF級(jí)），體重250～300g，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 薰衣草水提液的制備

將100 g薰衣草花放入圓底燒瓶中，加入300 mL蒸餾水浸泡30min，加入200 mL蒸餾水回流1h，過濾收集濾液，重復(fù)1次。之后將200 mL蒸餾水再加入回流混合液中0.5h，經(jīng)三層過濾器收獲濾液， 55 ℃真空濃縮，制備薰衣草水提液（LAD）。

2.2 LAD濃度確定

結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支可引起左心室心肌組織發(fā)生缺血再灌注損傷，以左心室發(fā)展壓（LVDP）為標(biāo)準(zhǔn)確定最有效的薰衣草水提液（LAD）濃度。圖1表明當(dāng)灌注治療后LAD低于60 μg/mL時(shí)，LAD的保護(hù)作用隨濃度的增加而增加。30min后，I/R損傷后LVDP的恢復(fù)率在60 μg/mL濃度下達(dá)到最大值。當(dāng)LAD濃度高于60μg/mL（從70μg/mL到100μg/ mL）時(shí)，I/R后LVDP的恢復(fù)率下降，這表明高濃度LAD對心臟有副作用，因此60 μg/mL的LAD對心臟有最佳保護(hù)作用。

2.3 薰衣草水提液對心肌功能的保護(hù)作用

測定薰衣草水提液處理后的大鼠血漿CK和LDH水平評估LAD的心肌保護(hù)作用。表1，表2結(jié)果表明，I/R組中流出液中CK和LDH的水平顯著升高，而經(jīng)60μg/mL LAD處理后（實(shí)驗(yàn)組），流出液中CK和LDH的水平顯著降低。這表明60μg/mL LAD對心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

2.4 以ATP為標(biāo)準(zhǔn)的淬滅方法評估

淬滅方法參考早期研究報(bào)道。在-80℃下用80%甲醇/甘油淬滅血液。淬滅后的樣品經(jīng)7000g，4℃離心5min收集血細(xì)胞。將血細(xì)胞在4℃下用0.9%生理鹽水洗滌2次。不同樣品采用相同的淬滅步驟，并用不同的方法進(jìn)行提取，渦旋混勻后以10000g， -20℃離心5min。根據(jù)早期研究，可通過測量ATP的濃度對優(yōu)化方法的淬滅效率進(jìn)行評估。采用螢火蟲熒光素酶催化的生物化學(xué)發(fā)光型ATP測定試劑盒，對ATP滲漏進(jìn)行分析，評估淬滅步驟的穩(wěn)定性（敏感測定法，Biaffin GmbH & Co KG，德國）。圖2表明，在80%甲醇/甘油的淬滅方法中，培養(yǎng)基上清液中可測量的ATP濃度約為85 μM ATP，這是ATP泄漏量最少的實(shí)驗(yàn)組，誤差線表明所得結(jié)果可靠性較高。

采用細(xì)胞內(nèi)腺苷酸濃度（ATP、ADP、AMP）評估淬滅效率，結(jié)果見圖3，細(xì)胞內(nèi)代謝物的三種淬滅方法獲得的結(jié)果與上清液中ATP的結(jié)果一致。在所有提取方法中，若采用80%甲醇/甘油進(jìn)行淬滅，則細(xì)胞內(nèi)腺苷酸濃度均較高，誤差線表明所得結(jié)果可靠性較高。采用80%甲醇/甘油的淬滅方法對ATP和ADP的測定無顯著差異。對三種不同樣品進(jìn)行淬滅，結(jié)果表明，所有樣品中AMP的濃度幾乎相等。綜上所述，80%甲醇/甘油溶液可用作優(yōu)化后的淬滅和提取方法。

2.5 提取方法對PCA結(jié)果的影響

PCA作為一種無監(jiān)督方法，已廣泛用于比較不同提取方法中樣品的代謝譜（Winder等，2008）。PCA結(jié)果表明，R2X = 0.796，Q2 = 0.446，其中t[2]的貢獻(xiàn)僅為8.87%，這些結(jié)果表明這三種提取方法均有良好的重現(xiàn)性。此外，每種提取方法均明顯產(chǎn)生了不同的代謝物譜圖（圖4A）。對PCA負(fù)載圖（圖4B）進(jìn)一步評估表明，天冬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、棕櫚酸酯、磷酸鹽是BE的重要代謝產(chǎn)物；AMP、纈氨酸、乳酸、絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、焦谷氨酸是FTM的重要代謝物；亮氨酸和3-磷酸甘油酸酯是NE的重要代謝產(chǎn)物。

2.6 基于OPLS-DS模型的提取方法評估

OPLS-DA作為一種評估驗(yàn)證方法，在本研究中用于代謝組學(xué)分析，做為PCA結(jié)果的交叉驗(yàn)證和補(bǔ)充。OPLS-DA的Q2表示可預(yù)測性和質(zhì)量，R2表示X和Y的變異性。OPLS-DA的得分圖為：R2（X）= 0.849，R2（Y）= 0.997和Q2 = 0.869，表明不同提取方法差異性顯著（圖5A）。對200個(gè)隨機(jī)排列測試（圖5B）通過原始R2和Q2的值高于排列值來驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。這些結(jié)果表明本試驗(yàn)結(jié)果具有較高的可信度。

3 討論

以左心室發(fā)展壓（LVDP）為標(biāo)準(zhǔn)確定最有效的LAD濃度時(shí)，當(dāng)灌注治療后LAD低于60μg/mL時(shí)，LAD的保護(hù)作用隨濃度的增加而增加。30min后，I/R損傷后LVDP的恢復(fù)率在60 μg/mL濃度下達(dá)到最大值。當(dāng)LAD濃度高于60μg/mL（從70 μg/mL到100 μg/mL）時(shí)，I/R后LVDP的恢復(fù)率下降，這表明高濃度LAD對心臟有副作用，因此60 mg/L的LAD對心臟有最佳保護(hù)作用。

PCA結(jié)果表明三種提取方法均有良好的重現(xiàn)性。且每種提取方法均明顯產(chǎn)生了不同的代謝物譜圖，早期研究指出，不同提取方法對某些代謝產(chǎn)物有較高的提取率，不同的提取方法在對特定代謝產(chǎn)物提取中具有各自的特征。因此，應(yīng)根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)的目的選擇合適的提取方法。

參考文獻(xiàn)

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