伍紅英 方慧祺 何水珍 曾凡偉 鄧燕 林峰華 林海帆 陳軼群 李琳琳

人類中的惡性腫瘤較多,對(duì)人類的危害性較大,而結(jié)直腸癌就是其中的一種,其進(jìn)展期致死性強(qiáng),嚴(yán)重危害人類健康,但早期結(jié)直腸癌,尤其是黏膜層內(nèi)結(jié)直腸癌行內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)(ESD)或外科手術(shù)均可治愈,患者在診斷初期的5 年內(nèi)生存率較高,高達(dá)90%［1］,但是臨床上明確診斷結(jié)直腸癌時(shí),多是該疾病的中晚期階段,該類患者占比高達(dá)60%［2］。目前結(jié)直腸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是纖維結(jié)腸鏡結(jié)合病理檢查,其作為對(duì)身體的侵入性檢查方式,為了提高檢查效果,在患者檢查前必須要飲用大量的水,同時(shí)還要服用清腸藥物,較為痛苦,且檢查時(shí)要求全結(jié)直腸充分清潔。受結(jié)直腸解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、清潔程度、醫(yī)務(wù)人員對(duì)病變的識(shí)別能力、退鏡時(shí)間等因素影響,結(jié)直腸腺瘤的漏診率可高達(dá)20%以上。大便潛血試驗(yàn)、糞鈣衛(wèi)蛋白、腫瘤標(biāo)記物、影像學(xué)檢查是目前臨床推薦的篩查結(jié)直腸癌主要的檢查手段,以上均為非侵入手段,安全性以及對(duì)于患者的舒適度較高,但是也存在一定的缺陷,其檢測(cè)敏感性、特異性較差,諸多研究報(bào)道過這些檢測(cè)方式不利于早期篩查結(jié)直腸癌,其檢出率只有30%,因此臨床上多不采用這些方式來早期診斷結(jié)直腸癌［3,4］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌從發(fā)現(xiàn)到診斷,之后的持續(xù)發(fā)展與患者體內(nèi)的DNA 甲基化狀態(tài)相關(guān)［5-8］。因此,臨床上多次提出將患者體內(nèi)DNA 甲基化異常狀態(tài)認(rèn)定為早期結(jié)直腸癌的診斷指標(biāo)。正常人體的腸道代謝每天有達(dá)到 5×1010級(jí)別的上皮細(xì)胞脫落,且腫瘤組織細(xì)胞更新速度快,粘附力低,故脫落速度更快,量更多,這也可以解釋結(jié)直腸癌患者的糞便中大量存在腫瘤因素,包含上皮細(xì)胞上脫落而來的癌細(xì)胞和游離存在的癌DNA［9,10］。臨床認(rèn)為,腸道環(huán)境是堿性的,有利于癌DNA 的保存,這也導(dǎo)致研究從糞便中提取DNA 的保存更好,質(zhì)量更高,為本研究提出的猜想提供了更好地支持。因此,糞便是檢測(cè)DNA 甲基化狀態(tài)的最佳標(biāo)本。本文提出了要充分利用好MSP 技術(shù),從而對(duì)結(jié)直腸癌患者糞便中的SDC2 和SEPT9 基因甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢查,以便于探討其對(duì)結(jié)直腸癌篩查、早期診斷的價(jià)值。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2020 年5 月～2021 年4 月廈門市海滄醫(yī)院消化內(nèi)科門診及住院的25 例結(jié)直腸癌患者作為結(jié)直腸癌組,20 例結(jié)直腸腺瘤患者作為結(jié)直腸腺瘤組,15 例結(jié)直腸正常者作為正常對(duì)照組。60 例研究對(duì)象中男32 例,女28 例；中位年齡45 歲。本研究中所選研究對(duì)象及其親屬均對(duì)本研究的具體事項(xiàng)和內(nèi)容完全知曉,并且同意參與研究,簽署了知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①年齡25～75 歲；②結(jié)直腸癌組患者僅患有結(jié)直腸癌,除此之外不患有其他腫瘤疾??；③三組所選取研究對(duì)象的性別比例均衡,組間年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；④所有糞便均在行結(jié)腸鏡檢查前收集,且收集前未服瀉藥；⑤依據(jù)Bristol 糞便分類法,收集糞便要求第1 型～第5 型,量＞100 g；⑥收集糞便前5 d 未行結(jié)腸鏡、灌腸、消化道鋇餐等操作；⑦患者未行放化療；⑧正常對(duì)照組無嚴(yán)重疾病、遺傳性非息肉病性大腸癌(HNPCC)家族史、家族性結(jié)腸息肉病。

1.3 方法 為保證本研究所提取樣本的真實(shí)性,由廈門博創(chuàng)盛世生物技術(shù)有限公司、廈門艾德生物醫(yī)藥技術(shù)股份有限公司協(xié)助本課題組完成。

1.3.1 糞便DNA 的提取 收集研究對(duì)象結(jié)腸鏡檢查前糞便,放于檢驗(yàn)科-80℃冰箱,提取糞便,約0.2 g,然后對(duì)糞便使用Solarbio 公司所提供的糞便基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行DNA 的提取,提取出總DNA之后,再使用實(shí)驗(yàn)室的分光光度計(jì)對(duì)DNA 進(jìn)行測(cè)量,選擇A260、A280 進(jìn)行純度檢測(cè),對(duì)于檢測(cè)合格的DNA 樣品放于-20℃冰箱保存,而對(duì)于初次純度檢測(cè)不合格或較次的DNA 再次進(jìn)行提取。

1.3.2 重亞硫酸鹽修飾、純化DNA 對(duì)提取到的DNA 使用QIAGEN 公司重亞硫酸鹽DNA 甲基化試劑盒進(jìn)行DNA 的修飾、純化,獲得患者糞便的重亞硫酸鹽修飾和純化的DNA,將其置于-20℃冰箱內(nèi)保存。

1.3.3 MSP 技術(shù)分析SDC2 基因、SEPT9 基因甲基化狀態(tài) 1 μl 引物F 和R,2 μl DNA 模板,4 μl dNTP,1 μl Ex Taq,5 μl 10×Ex Taq E buffer,用ddH2O 補(bǔ)至50 μl；在95℃進(jìn)行預(yù)變性,持續(xù)5 min；在95℃進(jìn)行變性,持續(xù)30 s；在60℃進(jìn)行退火,持續(xù)30 s；在72℃進(jìn)行延伸,持續(xù)30 s；循環(huán)往復(fù)35 次后,在72℃進(jìn)行再延伸,持續(xù)10 min；在4℃條件下保存?zhèn)溆谩＝又鴮?duì)所提取到的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),首先制作1%的瓊脂糖凝膠,然后用其進(jìn)行SDC2 基因、SEPT9 基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物檢測(cè)。見表1。

表1 SDC2 基因、SEPT9 基因引物

1.4 觀察指標(biāo) 觀察SDC2、SEPT9 基因甲基化檢測(cè)結(jié)果,比較三組糞便中SDC2、SEPT9 基因甲基化檢出率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SDC2 基因甲基化檢測(cè)結(jié)果 結(jié)直腸癌組糞便中SDC2 基因甲基化檢出率為76.00%,高于正常對(duì)照組的13.33%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；結(jié)直腸腺瘤組糞便中SDC2 基因甲基化檢出率為80.00%,高于正常對(duì)照組的13.33%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；結(jié)直腸癌組與結(jié)直腸腺瘤組糞便中SDC2 基因甲基化檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2,圖1,圖2,圖3。

圖1 結(jié)直腸癌組糞便SDC2 基因甲基化狀態(tài)

圖2 結(jié)直腸腺瘤組糞便SDC2 基因甲基化狀態(tài)

圖3 正常對(duì)照組糞便SDC2 基因甲基化狀態(tài)

表2 三組糞便中SDC2 基因、SEPT9 基因甲基化檢測(cè)結(jié)果比較［n(%)］

2.2 SEPT9 基因甲基化檢測(cè)結(jié)果 結(jié)直腸癌組、結(jié)直腸腺瘤組、正常對(duì)照組糞便中SEPT9 基因甲基化檢出率分別為16.00%(4/25)、5.00%(1/20)、0(0/15),比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2,圖4。

圖4 結(jié)直腸癌組糞便SEPT9 基因甲基化狀態(tài)

3 討論

目前已經(jīng)明確結(jié)直腸成癌途徑有5 種,其中70%～80%由癌前病變(腺瘤)進(jìn)展成為癌需要5～10 年,因此結(jié)直腸癌早期及癌前病變階段的篩查及診斷意義重大。其中,CpG 島是存在于真核生物,對(duì)其各個(gè)基因進(jìn)行編碼的主要調(diào)控區(qū)域,通常是非甲基化狀態(tài),其大小區(qū)間在100～1000 bp?；颊叱霈F(xiàn)結(jié)直腸癌的病因復(fù)雜多樣,多種因素會(huì)對(duì)其造成影響,各種因素在其中協(xié)調(diào)互作。研究發(fā)現(xiàn) CpG 島是結(jié)直腸癌基因中的一種,啟動(dòng)子區(qū)域的CpG 島發(fā)生甲基化后會(huì)出現(xiàn)抑癌基因的失活,而抑癌基因的失活導(dǎo)致患者患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加。研究發(fā)現(xiàn),在患者出現(xiàn)癌前病變時(shí),癌相關(guān)基因的啟動(dòng)子會(huì)隨之出現(xiàn)甲基化；并且在啟動(dòng)子的甲基化程度逐漸發(fā)展,以及細(xì)胞發(fā)生甲基化改變的情況逐漸增多時(shí),都會(huì)使患者逐漸演變成結(jié)直腸癌。因此CpG 島甲基化有望成為結(jié)直腸癌早期篩查及診斷的分子標(biāo)記物［9-11］。

作為一種細(xì)胞表面的跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,SDC2 有兩種途徑出現(xiàn)癌變,其一是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑,其二是由上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而成［12,13］。有報(bào)道稱,結(jié)直腸腫瘤患者糞便內(nèi)的SDC2 基因甲基化發(fā)生頻率和甲基化率明顯高于正常人糞便或者非腫瘤鄰近組織內(nèi)的水平［14］。正如Niu 等［15］所報(bào)道的,結(jié)直腸癌患者組織中的SDC2 甲基化水平遠(yuǎn)高于鄰近的正常上皮組織,研究發(fā)現(xiàn)SDC2 基因在結(jié)腸直腸癌組織中出現(xiàn)甲基化,其特異性達(dá)93.3%,且其在結(jié)直腸腺瘤中SDC2 甲基化水平亦明顯升高。根據(jù)本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤的SDC2 基因甲基化檢出率分別為76.00%(19/25)、80.00%(16/20),與既往研究基本一致,提示糞便中SDC2 甲基化檢測(cè)對(duì)于結(jié)直腸癌早期及癌前病變?cè)\斷具有重要臨床價(jià)值。

SEPT9 基因主要定位于人類染色體的17q25.3,其包含17 個(gè)外顯子,是廣泛存在于各類真核細(xì)胞中保守基因家族的一員。研究表明,SEPT9 基因在受到干擾后,會(huì)通過多條信號(hào)通路使腫瘤血管生成的速度加快,同時(shí)癌細(xì)胞增殖的速度也會(huì)加快,從而抑制了癌細(xì)胞的凋亡［16,17］。SEPT9 基因調(diào)控區(qū)域含有CpG 島,CpG島甲基化程度加深會(huì)阻礙SEPT9 基因表達(dá),從而導(dǎo)致抑癌表達(dá)功能有所喪失,故SEPT9 基因的甲基化程度未來會(huì)成為診斷結(jié)直腸癌的主要生物標(biāo)志物。又有研究發(fā)現(xiàn),糞便的 DNA 分子標(biāo)志物檢測(cè)敏感性較高,且遠(yuǎn)高于外周血游離SEPT9 基因甲基化標(biāo)志物檢測(cè)敏感性,特別是對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌,這個(gè)結(jié)果值得更深層次地探討［18］。趙慧霞等［19］在126 例結(jié)直腸癌患者切除術(shù)中發(fā)現(xiàn),對(duì)患者的癌組織、癌旁組織以及術(shù)前糞便中的DNA 所進(jìn)行的SEPT9 基因甲基化檢測(cè)結(jié)果表明甲基化程度一致,即結(jié)直腸癌患者的糞便SEPT9基因甲基化程度與患者癌組織中甲基化程度一致。兩類患者臨床上各時(shí)期檢查無差別的情況也提示糞便基因SEPT9 甲基化檢測(cè)對(duì)于結(jié)直腸癌早期及癌前病變?cè)\斷具有一定的臨床價(jià)值。本研究中的結(jié)直腸癌患者的SEPT9 基因甲基化檢出率較低,僅為16.00%(4/25),結(jié)直腸腺瘤檢出率也較低為5.00%(1/20),且三組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),與既往研究結(jié)果存在差異。

多數(shù)研究均提示,檢測(cè)糞便中的SDC2 基因甲基化程度具有較高的臨床價(jià)值,該檢測(cè)方式更加便捷、創(chuàng)傷性更低、檢測(cè)速度更快,對(duì)于未來結(jié)直腸癌、癌前病變患者的篩查、早期診斷意義重大［20］。結(jié)腸鏡結(jié)合病理檢查是結(jié)直腸癌及癌前病變?cè)\斷的金標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合SDC2 基因甲基化檢測(cè)可篩選、提醒患者需要行結(jié)腸鏡檢查,避免結(jié)直腸癌到晚期才被發(fā)現(xiàn),從而明顯降低死亡率。結(jié)腸鏡檢查由于多種原因?qū)е陆Y(jié)直腸腺瘤漏診率＞20%,結(jié)合SDC2 基因甲基化檢測(cè)可使醫(yī)生及患者避免一些人為因素,亦可依據(jù)甲基化檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)患者下次復(fù)查結(jié)腸鏡時(shí)間,降低結(jié)腸鏡檢查漏診率。

綜上所述,糞便中SDC2 基因甲基化程度有利于篩查、早期診斷結(jié)直腸癌,對(duì)于癌前病變更好地發(fā)現(xiàn)、追蹤。因此,糞便中SDC2 基因甲基化程度是一個(gè)重要的分子指標(biāo),使結(jié)直腸癌的篩查、診斷更加便利、無創(chuàng)、快捷；SEPT9 基因的甲基化狀態(tài)敏感性較低,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的可能性較小,因此仍需要擴(kuò)大樣本量,多中心、多研究進(jìn)一步證實(shí)其在結(jié)直腸癌早期診斷及篩查中的作用。