楊勁博 鐘興華 林心君 胡海霞 朱曉勤

腦卒中中醫(yī)名為中風(fēng),是一種常見(jiàn)的腦血管疾病,分為缺血性卒中和出血性卒中,缺血性卒中占80%,嚴(yán)重危害患者的健康和生命［1］,缺血性卒中涉及到血腦屏障功能障礙、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等多種機(jī)制,最終導(dǎo)致不可逆的腦組織損傷［2,3］,同時(shí)肢體痙攣［4］是最主要的后遺癥。腦缺血后機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致腦組織損傷的主要因素。氧化應(yīng)激是自由基生成過(guò)多與抗氧化機(jī)制消除之間的一種不平衡狀態(tài)［5,6］。缺血再灌注發(fā)生后,神經(jīng)系統(tǒng)中活性氧(ROS)生成過(guò)多,通過(guò)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA 的氧化修飾［7,8］,破壞血腦屏障的完整性,激活炎癥細(xì)胞和促進(jìn)白細(xì)胞浸潤(rùn)來(lái)增強(qiáng)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致自噬、凋亡引起卒中后繼發(fā)性腦損傷［9,10］。GLGZD 源于《金匱要略》,功效為解肌祛邪,舒緩筋脈,主治太陽(yáng)柔痙體強(qiáng)證,用于治療腦卒中后肢體痙攣［11］,在基礎(chǔ)研究和臨床研究中均表現(xiàn)出對(duì)腦卒中的保護(hù)作用［12,13］,本研究基于中藥多靶點(diǎn)調(diào)控卒中后的氧化還原穩(wěn)態(tài),探討GLGZD 通過(guò)Sirt1/PGC-1α/ERRα 通路抑制凋亡進(jìn)而減輕神經(jīng)元損傷的作用機(jī)制,為臨床用藥提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠60 只,體質(zhì)量(180±20)g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(瀘)2017-0005,飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,使用許可證號(hào)：SYXK(閩)2019-0007。本研究已通過(guò)福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核,并嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 藥物 GLGZD 組方：栝樓根30 g、桂枝9 g、生姜9 g、白芍9 g、大棗9 g、甘草6 g。均購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院國(guó)醫(yī)堂。上述藥材煎煮2 次并濃縮至1.06 g/ml。灌胃時(shí)根據(jù)人與大鼠臨床等效劑量換算。

1.1.3 試劑 GAPDH 抗體(Bioss 公司,貨號(hào)：bsm-0978M)；Sirt1 抗體(SantaCruz 公司,貨號(hào)：sc-74465)；PGC-1α 抗體(abcam 公司,貨號(hào)：ab191838)；ERRα抗體(CST 公司,貨號(hào)：#13826)。

1.1.4 儀器 光學(xué)顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica 公司,型號(hào)分別為：DM400B LED、DMi8)。

1.2 方法

1.2.1 大腦中動(dòng)脈阻塞模型制備 戊巴比妥鈉(2%)腹腔注射麻醉大鼠并固定于鼠板上,于頸正中剪一切口,分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈以及頸外動(dòng)脈,結(jié)扎頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈,用眼科剪在頸總動(dòng)脈近心端血管壁剪一小口,將線(xiàn)栓從頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈,線(xiàn)栓進(jìn)入的深度約為18 mm,阻斷血流供應(yīng)1.5 h,后將線(xiàn)栓部分退出,恢復(fù)血流供應(yīng)。待大鼠從麻醉中蘇醒,參照改良神經(jīng)功能缺損Longa 評(píng)分對(duì)大鼠神經(jīng)功能損傷程度進(jìn)行評(píng)價(jià),評(píng)分為1～3 分者視為造模成功,納入實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組與給藥 將造模成功的40 只大鼠隨機(jī)分為MCAO 組與GLGZD 組,每組20 只；另外20 只設(shè)Sham 組,僅鈍性分離肌肉血管,不插入線(xiàn)栓。三組大鼠均在手術(shù)當(dāng)天評(píng)分并于分組后開(kāi)始灌胃干預(yù),Sham組和MCAO 組給予0.9%生理鹽水灌胃,GLGZD 組給予GLGZD 水提液灌胃,1 次/d,連續(xù)7 d。

1.2.3 Longa 評(píng)分評(píng)估神經(jīng)功能缺損 分別于造模結(jié)束后及藥物干預(yù)7 d 后,采用Longa 評(píng)分進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定［14］。

1.2.4 模型大鼠血清中MDA、GSH-Px 的含量測(cè)定取大鼠血清,按照MDA 測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)和GSH-Px 測(cè)試盒說(shuō)明書(shū),檢測(cè)各組大鼠血清中MAD、GSH-Px 含量。

1.2.5 qPCR 法檢測(cè)Sirt1、PGC-1α、ERRα mRNA的表達(dá)水平 Trizol 法提取大鼠腦組織總mRNA,參照試劑盒方法逆轉(zhuǎn)錄和qPCR 反應(yīng)。引物序列見(jiàn)表1。以GAPDH 作為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt計(jì)算目標(biāo)mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.6 Western blot 法檢測(cè)Sirt1、PGC-1α、ERRα蛋白的表達(dá)水平 取腦組織稱(chēng)重并置于研磨儀,裂解后,進(jìn)行BCA 蛋白定量、金屬水浴變性,-20℃保存。通過(guò)SDS-PAGE 凝膠電泳及轉(zhuǎn)模,以GAPDH 為內(nèi)參,對(duì)Sirt1(1∶500,132 kDa)、PGC-1α(1∶1000,91 kDa)、ERRα(1∶1000,50 kDa)、GAPDH(1∶5000,36 kDa)蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.2.7 TUNEL 法檢測(cè)缺血側(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率 石蠟切片脫蠟復(fù)水固定后,滴加蛋白酶K 室溫孵育30 min,平衡緩沖液室溫孵育10 min,滴加50 μl rTdT緩沖液,37℃避光孵育1 h,滴加2 × SSC 溶液避光孵育15 min,DAPI 染核8 min,抗熒光淬滅封片劑封片,于熒光倒置顯微鏡200 倍鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,方差齊性的數(shù)據(jù)采用最小顯著差法檢驗(yàn),方差不齊的數(shù)據(jù)則采用蓋姆斯-霍威爾法。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GLGZD 對(duì)模型大鼠Longa 評(píng)分的影響 干預(yù)后,MCAO 組與GLGZD 組Longa 評(píng)分均高于Sham 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；GLGZD 組Longa 評(píng)分低于MCAO 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)圖A。

圖A 大鼠Longa 評(píng)分

2.2 GLGZD 對(duì)模型MDA、GSH-Px 含量的影響 干預(yù)后,MCAO 組MDA 水平高于Sham 組、GSH-Px 水平低于Sham 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；GLGZD組MDA 水平低于MCAO 組、GSH-Px 水平高于MCAO組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖B。

圖B 大鼠血清MDA、GSH-Px 的表達(dá)

2.3 GLGZD 對(duì)模型大鼠缺血側(cè)腦組織Sirt1、PGC-1a、ERRa 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平的影響 qPCR與Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干預(yù)后,MCAO 組Sirt1、PGC-1α、ERRα 的mRNA 及蛋白表達(dá)水平低于Sham 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；GLGZD 組Sirt1、PGC-1α、ERRα 的mRNA 及蛋白表達(dá)水平均高于MCAO 組,ERRα 的mRNA 及蛋白表達(dá)水平低于Sham 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；見(jiàn)圖C。

圖C 大鼠Sirt1/PGC-1α/ERRα 通路基因和蛋白的表達(dá)

2.4 GLGZD 對(duì)模型大鼠缺血側(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的影響 TUNEL 染色顯示,干預(yù)后,Sham 組大鼠少見(jiàn)TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞凋亡較少；MCAO 組大鼠缺血側(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率高于Sham 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；GLGZD 組缺血側(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率低于MCAO 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖D。

圖D 大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率(TUNEL 染色200×)

3 討論

缺血性卒中是一種具有復(fù)雜特性的腦部疾病,涉及到多種病理生理過(guò)程。MCAO 模型是目前國(guó)際上認(rèn)可和通用的缺血性卒中模型。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)GLGZD干預(yù)后,卒中后神經(jīng)功能缺損明顯減輕。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致缺血性腦卒中后神經(jīng)功能損傷的重要病理環(huán)節(jié)。MDA 是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物之一,最能反映組織氧化損傷的程度。GSH-Px 參與清除過(guò)多的ROS,在保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷中起著關(guān)鍵作用。降低MDA 含量、增加GSH-Px 活化,有利于減輕氧化應(yīng)激損傷,起到神經(jīng)保護(hù)作用［15,16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GLGZD 干預(yù)后,MDA 含量明顯減少,GSH-Px 含量明顯升高,說(shuō)明GLGZD 通過(guò)減輕氧化應(yīng)激損傷起到保護(hù)作用。

Sirtuins(Sirts1-7)［17］是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴(lài)的組蛋白脫乙酰酶家族,主要通過(guò)蛋白質(zhì)的去乙?；?、多聚磷酸核糖基化等機(jī)制參與蛋白質(zhì)的翻譯后修飾［18］。Sirt1 與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ 輔活化因子-1α(PGC-1α)相互作用［19］并直接去乙?；?提高其轉(zhuǎn)錄活性,去乙?；疨GC-1α更有效地招募ERRα 等轉(zhuǎn)錄因子［20］,減輕ROS 生成所致的代謝障礙,減少氧化損傷維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),保護(hù)神經(jīng)元免受凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MCAO 組Sirt1、PGC-1α、ERRα 表達(dá)水平較Sham 組顯著降低,GLGZD 干預(yù)后,上述情況出現(xiàn)逆轉(zhuǎn),提示GLGZD 可通過(guò)調(diào)控Sirt1/PGC-1α/ERRα 通路起到神經(jīng)保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。DNA 片段化是凋亡標(biāo)志之一。通過(guò)TUNEL 檢測(cè)DNA 片段化,簡(jiǎn)單、快速地檢測(cè)大鼠腦組織中的凋亡細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)GLGZD 干預(yù)后,可顯著減少大鼠缺血側(cè)TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞比例,降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡率,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述,GLGZD 可顯著改善大鼠神經(jīng)功能缺損,通過(guò)調(diào)控Sirt1/PGC-1a/ERRa 通路降低氧化應(yīng)激損傷,減輕神經(jīng)元凋亡,對(duì)腦缺血再灌注損傷具有較好的保護(hù)作用,這也為本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究GLGZD 的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)不足之處在于,僅探討Sirt1/PGC-1a/ERRa 通路對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)控作用,其復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程與關(guān)系有待進(jìn)一步探索,故藥物多通路的調(diào)控作用可作為未來(lái)深入研究的重點(diǎn)方向。