張 歡，勾耀鵬，胡朝輝，王晨豫，王 亮，齊亞銀★

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 832003；2.新疆泰昆集團(tuán)有限責(zé)任公司 831100；3.新疆天潤乳業(yè)股份有限公司 830000）

犢牛健康成長嚴(yán)重者影響牧場的發(fā)展情況。新生犢牛容易患消化道疾病和呼吸道疾病，而呼吸道疾病包括病毒病和細(xì)菌病、病毒病有牛傳染性鼻氣管炎、牛副流感3型、牛呼吸道合胞體等。而細(xì)菌病包括巴氏桿菌、曼氏桿菌、肺炎鏈球菌等[1,2]。

牛巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的一種敗血性傳染病。急性經(jīng)過主要以高熱、肺炎或急性胃腸炎和內(nèi)臟廣泛出血為主要特征，呈敗血癥和出血性炎癥，故稱牛出血性敗血病，簡稱：牛出敗[3-5]。臨床上主要表現(xiàn)為三種型（敗血癥型（牛出?。?、水腫型、肺炎型）。帶菌動(dòng)物是主要的傳染源，病原體存在鼻咽黏膜和扁桃體中（上呼吸道），通過被污染的飼料、飲水傳播[6]。牛巴氏桿菌病屬于條件致病菌，是犢牛呼吸道中的常在細(xì)菌，環(huán)境應(yīng)激是造成本病暴發(fā)的重要因素[7]。通常不發(fā)病，一旦新生犢牛免疫力下降，受到外界冷熱應(yīng)激、潮濕陰冷、牛舍簡陋、氨氣過重、通風(fēng)不良、運(yùn)輸應(yīng)激等，極易發(fā)病。犢牛感染BVD、IBR后繼發(fā)感染多殺性巴氏桿菌病的病死率增加[8]。

本文為確定導(dǎo)致新疆北疆地區(qū)部分牧場犢牛多殺性巴氏桿菌的感染攜帶情況，采集犢牛鼻拭子使用特異性knt基因進(jìn)行PCR檢測，為該牧場犢牛防控巴氏桿菌病提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料

1.1 主要試劑與儀器

DNA提取試劑盒購自天根生物科技有限公司。PCR儀購自賽默飛公司。移液器購自Eppendorf公司。

2 方法

2.1 樣品來源

2022年7月無菌采集北疆地區(qū)2個(gè)規(guī)模化牧場3月齡犢牛鼻拭子共計(jì)42份。將采集好的鼻拭子棉簽放入無菌的1.5mL的EP管中。記錄好編號(hào)快速放入裝有冰袋的采樣箱帶回實(shí)驗(yàn)室。

2.2 樣品DDNA提取

在采集的鼻拭子1.5mLEP管中加入600 μLPBS，混勻，在-80℃反復(fù)凍融三次。DNA提取使用組織基因組DNA提取試劑盒，按照說明書提取鼻拭子DNA。具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.3 引物合成

根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]中巴氏桿菌特異性基因kmt引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表1。

表1 巴氏桿菌kmt 特異性引物序列

2.4 PCR擴(kuò)增

本實(shí)驗(yàn)以提取的總DNA為PCR反應(yīng)體系中的模板。反應(yīng)體系如下表2。

表2 巴氏桿菌kmt特異性引物反應(yīng)體系

使用PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)。使用瓊脂糖凝膠成像儀觀察結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 巴氏桿菌PCR調(diào)查結(jié)果

北疆部分地區(qū)兩個(gè)規(guī)?；翀霭褪蠗U菌PCR調(diào)查結(jié)果：牧場一犢牛巴氏桿菌陽性率為23.8%（5/21）。牧場二犢牛巴氏桿菌陽性率為19.05%（4/21）。犢牛巴氏桿菌病總陽性率為21.42%（9/42）。結(jié)果見圖1，表3。兩個(gè)牧場犢牛均有不同程度的巴氏桿菌感染。且感染率較高，當(dāng)犢牛免疫力下降時(shí)，牧場如不進(jìn)行提前防控措施，可能會(huì)造成不可估量的損失。

表3 巴氏桿菌kmt特異性引物檢測結(jié)果

圖1 巴氏桿菌kmt特異性引物擴(kuò)增結(jié)果電泳圖M:Marker;1-21鼻拭子樣品總DNA；

4 討論

規(guī)模化牧場中，犢牛是牧場發(fā)展的基礎(chǔ)。而巴氏桿菌病是新生犢牛極易發(fā)生的疾病，飼養(yǎng)不當(dāng)，環(huán)境中攜帶致病菌，犢牛應(yīng)激導(dǎo)致個(gè)體免疫力下降從而發(fā)病。應(yīng)激包括熱應(yīng)激，冷應(yīng)激等。夏季防暑冬季保暖，落實(shí)新生犢牛初乳飼喂，加強(qiáng)牧場飼養(yǎng)管理，避免犢牛腹瀉給牧場帶來不必要的損失[10]。本試驗(yàn)調(diào)查結(jié)果表明調(diào)查的牧場一犢牛巴氏桿菌陽性率為23.8%（5/21）。牧場二犢牛巴氏桿菌陽性率為19.05%（4/21）。犢牛巴氏桿菌病總陽性率為21.42%（9/42）。新疆北疆地區(qū)牧場犢牛均有不同程度的巴氏桿菌病的感染情況。巴氏桿菌作為牛呼吸道常在細(xì)菌，而誘發(fā)該細(xì)菌的條件較多，臨床上根據(jù)臨床癥狀鑒別較為困難，難與溶血性曼氏桿菌、支原體等疾病進(jìn)行鑒別診斷，實(shí)驗(yàn)室鑒別方法較多。通常以病毒病發(fā)病導(dǎo)致繼發(fā)感染，以混合感染的情況出現(xiàn)較為常見[11,12]。

巴氏桿菌的感染機(jī)制分為內(nèi)源性感染和外源性感染，因此防控該細(xì)菌的主要兩個(gè)措施就是消除傳染源，切斷傳播途徑[13,14]。內(nèi)源性感染：當(dāng)各種原因?qū)е屡５牡挚沽ο陆禃r(shí)，寄生于呼吸道、消化道黏膜的多殺性巴氏桿菌趁虛而入，經(jīng)淋巴液進(jìn)入血液發(fā)生感染。防控內(nèi)源性感染這情況主要是在于提高犢牛自身的免疫力，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，減少各種應(yīng)激，避免犢牛抵抗力下降過低，繼而感染發(fā)病。外源性感染：多殺性巴氏桿菌能通過受損的呼吸道、消化道以及皮膚感染。防控該途徑主要是消滅傳染源，加大對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境的消毒，犢牛接種疫苗后傷口進(jìn)行消毒。避免犢牛傷口接觸繼而發(fā)生菌血癥等。

新生犢牛的免疫力較差，而巴氏桿菌可通過病菌可通過空氣飛沫、飲水、飼草等傳播，傳播途徑廣，群體發(fā)病率高，淘汰率、致死率高，臨床上一旦發(fā)現(xiàn)疑似巴氏桿菌感染，臨床癥狀表現(xiàn)明顯的立即單獨(dú)隔離飼養(yǎng)，查明病因，治療痊愈后再返回原飼養(yǎng)圈舍。巴氏桿菌易與其他呼吸道病原形成混合感染導(dǎo)致肺炎。對(duì)牛群危害極大[15]。

牧場治療該病主要以提高犢牛的免疫力結(jié)合使用巴氏桿菌敏感性藥物進(jìn)行治療為該病的主要治療措施。具體為措施為新生犢牛做好飼喂初乳，飼喂時(shí)添加中藥制品黃芪多糖有較好的表現(xiàn)。使用泰拉霉素進(jìn)行預(yù)防，取得了較好的臨床效果，3月齡以內(nèi)的犢牛呼吸道疾病發(fā)病率顯著下降。3月齡以上的犢牛建議使用巴氏桿菌疫苗進(jìn)行免疫?，F(xiàn)階段巴氏桿菌疫苗已經(jīng)非常成熟，3月齡以上犢牛首免一次，21d后加強(qiáng)免疫一次可有效防控巴氏桿菌病的出現(xiàn)?，F(xiàn)階段因抗生素濫用導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性逐年增加，耐藥菌株增多，巴氏桿菌耐藥性也有不同程度的增強(qiáng)[16]。使用提高犢牛免疫力和疫苗免疫成為該疾病的主要防控措施。