李艷艷，白繼超，徐中清

（北京市大興區(qū)生物醫(yī)藥基地中國獸藥藥品監(jiān)察所 102699）

1 概述

雞球蟲病是一種特殊的雞腸道寄生蟲。選擇合適的球蟲繁殖培養(yǎng)基及其添加成分是球蟲體外培養(yǎng)的關(guān)鍵，也是建立球蟲體外篩選模型不可或缺的一步[1]。本文報道了不同培養(yǎng)基的重復(fù)比較以及在培養(yǎng)基中添加的成分對E.tenella的影響。體外細(xì)胞培養(yǎng)在球蟲病的分子免疫學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥性研究中起著重要作用，還可以加強禽類球蟲病預(yù)防，促進(jìn)球蟲疫苗的發(fā)展[2]。在體外培養(yǎng)過程中，影響球蟲生長的因素包括環(huán)境溫度、細(xì)胞系的選擇和培養(yǎng)基。本研究比較了不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基及其添加成分對雞球蟲E.tenella細(xì)胞培養(yǎng)的影響。

影響球蟲病體外培養(yǎng)成功的因素很多，其中培養(yǎng)基及其組成是影響球蟲病體外培養(yǎng)成功的重要因素之一[3]。最初的實驗主要集中在培養(yǎng)基的選擇上，然后逐漸對其有效成分進(jìn)行了研究。EAGLESMEM和EAG'LESBME是最早被認(rèn)為是營養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基，含有水解乳蛋白和培養(yǎng)基19的HBSS也被用來培養(yǎng)E.etenlla。此后，rpmi1640介質(zhì)得到了廣泛的應(yīng)用[4]。然而，經(jīng)過反復(fù)比較，我們發(fā)現(xiàn)MEM-A培養(yǎng)的E.tenella能顯著增加第二代分裂體和卵囊的數(shù)量。通過對兩種培養(yǎng)基成分的比較，發(fā)現(xiàn)a-mem中含有核糖核苷和脫氧核糖核苷，因此它的含量是E.tenella體外培養(yǎng)的關(guān)鍵因素之一。

2 方法

2.1 子孢子純化

2.1.1 卵囊破壁

卵囊計數(shù)后，3000r/min，離心10min去除上清液，將沉淀物加入組織研磨機，在冰水中研磨。連續(xù)顯微鏡觀察，直到90%左右的球蟲病卵囊破裂，3000r/min，離心10min，丟棄上清液，4°備用。

2.1.2 子孢子脫囊

將含孢子囊的溶液分別加入A、B、C、D四種不同劑型的解囊溶液中，40℃水浴，純化消毒后，在解囊過程中消化時進(jìn)行顯微鏡檢查。在顯微鏡下連續(xù)觀察脫囊狀態(tài)，持續(xù)半小時后停止。

2.1.3 子孢子的純化

制備20%、30%、65%、70%、75%和80%蔗糖溶液。在不同的離心管中加入65%、70%、75%和80%的蔗糖，然后用滴管依次向離心管中加入20%、30%的蔗糖溶液并進(jìn)行標(biāo)記。并且與含有帶子孢子的脫囊液混合，1500r/min，離心十分鐘，在兩種濃度溶液之間會顯示出白色條帶，將其吸取。用3000r/min的pbs溶液離心洗滌蔗糖溶液15min，根據(jù)解凍后純化孢子數(shù)與孢子數(shù)的比值計算回收率。

2.1.4 子孢子活性檢測

用不同的脫囊液用相同的方法純化子孢子后，用PBS將純化的孢子定量至2mL，吸收1滴小孢子液，并向玻片中加入2滴伊紅染料。2min后顯微鏡下觀察，染色計數(shù)后算出未染色的子孢子數(shù)在總子孢子數(shù)的占比，并記錄存活率。

2.2 雞胚成纖維細(xì)胞的制備

2.2.1 取9～11日齡雞胚，取出雞胚體，置于滅菌板中，取出內(nèi)臟、頭部和四肢，洗滌PBS兩次。

2.2.2 將胚胎轉(zhuǎn)移到小燒杯中，完全切割，沖洗PBS兩次，然后將PBS吸入。

2.2.3 加入2mL 0.25%胰蛋白酶，在37℃下消化約15min。

2.2.4 輕輕吸取胰蛋白酶，沖洗PBS兩次，吸取PBS。

2.2.5加入少量生長液，輕輕吹氣過濾上清液；吹開其余的組織，并用生長液過濾。

2.2.6 將濾過的細(xì)胞懸液稀釋10倍，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至40～60萬/mL。

2.2.7 加50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)，24～28h形成單層致密層。

2.3 雞腎細(xì)胞原代培養(yǎng)

2.3.1 在無菌環(huán)境中采集10d齡左右的雛雞腎臟。

2.3.2 將腎臟轉(zhuǎn)移到一個小燒杯中，切成小塊，洗滌兩次，然后吸取PBS。

2.3.3 加入5倍體積的0.25%胰蛋白酶，在37℃條件下消化約半小時。

2.3.4 加入少量生長液，輕輕吹氣過濾上清液；其余的組織被吹走，并用生長液過濾。

2.3.5將濾過的細(xì)胞懸液稀釋10倍，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至40～60萬/mL。

2.3.6加50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。

2.3.7 37℃培養(yǎng)，24～28h形成單層致密層。

2.4 傳代細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)

2.4.1冷凍保存細(xì)胞的復(fù)蘇：在液氮中冷凍保存的MDBK細(xì)胞在37℃的水浴中在1min內(nèi)迅速溶解。加入細(xì)胞瓶，加入含有血清和雙抗體的培養(yǎng)基，37℃，5% CO2，12h，倒入培養(yǎng)基，用新的含有雙抗體的培養(yǎng)基代替。

2.4.2細(xì)胞傳代：細(xì)胞瓶底涂布80%后，倒入培養(yǎng)基，D-Hank洗滌3次，加入少量胰蛋白酶，37℃，5% CO2消化3min，顯微鏡下細(xì)胞呈圓形后，加入培養(yǎng)基，吹干均勻，然后放入37℃，5% CO2培養(yǎng)。

2.5用rp mL 64測定不同血清的培養(yǎng)效果比較了雞血清和胎牛血清中鋁的含量。實驗分為A組雞血清組；B組胎牛血清組：用10個培養(yǎng)細(xì)胞制備胎牛血清，用5%胎牛血清接種種子。重復(fù)測試三次。

2.6胰島素最佳濃度試驗

試驗分為3組0.05、0.05、0.5g/mL培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為rpml640，細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入10%小牛血清和5%雞血清，觀察E.tenella培養(yǎng)的效果。觀察不同濃度胰島素對E.tenella的影響。

2.7 介質(zhì)成分對比試驗

以rpml640和a-mem為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，比較不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基的效果。重復(fù)測試三次。

2.8 效果判定指標(biāo)

2.8.1 細(xì)胞生長：接種前、接種后2、4、6d倒置顯微鏡觀察細(xì)胞覆蓋面積10次，每組30個視野。

2.8.2 第二代血吸蟲計數(shù)：接種后10x4.5d倒置顯微鏡下計算第二代血吸蟲計數(shù)，每組30個視野。

2.8.3 卵囊數(shù)：取種子8d后，用0.05%d ta和0.3%胰蛋白酶處理消化細(xì)胞層。收集卵囊，用mcmas和r型計算器計算卵囊數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 不同基質(zhì)中細(xì)胞生長的比較

以a-mem和RPMl640為基本培養(yǎng)基，對雞腎原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。它的細(xì)胞覆蓋率見表1。從表1可以看出，A-MEM組在接種前和接種后2、4和6d的細(xì)胞覆蓋率均高于RPML640 組。

表1 兩種培養(yǎng)基對雞腎原代細(xì)胞生長的影響

3.2 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對Etenla卵囊數(shù)的影響

第2代淋巴細(xì)胞接種后4.5d計數(shù)，8d收集卵囊數(shù)。結(jié)果見表2。如表2所示，平均每場第二代淋巴瘤數(shù)為N和17.5，卵囊數(shù)為65和91個/孔，高于A-MEM。

表2 兩種培養(yǎng)基對第二代血吸蟲和卵囊形成的影響

3.3 培養(yǎng)基中添加不同成分的入侵率

入侵率（%） 肌苷 水解乳蛋白 葉酸 全培養(yǎng)基 空白PH=7 14.54 13.43 9.61 9.23 3.51 PH=7.6 13.51 11.21 9.65 9.45 2.41

4 討論

在E.tenella艾美耳球菌的體外培養(yǎng)技術(shù)中，MDBK是一個很好的上皮細(xì)胞系[5]，但布氏E.tenella在MDBK細(xì)胞中發(fā)育不好[6-7]，微小隱孢子蟲在MDBK中不發(fā)育。BHK廣泛應(yīng)用于AMEL培養(yǎng)，被認(rèn)為優(yōu)于雞腎和火雞腎細(xì)胞。楚德軍認(rèn)為BHK、MDBK和RK-13適合球蟲的生長，更適合E.tenella艾美球蟲的體外培養(yǎng)[8]。有證據(jù)表明，mdbk和hep2細(xì)胞更適合弓形蟲、rk13、bhk、rdavero和cer的體外培養(yǎng)[9]。HCT-8細(xì)胞被認(rèn)為是最適合體外培養(yǎng)微小隱孢子蟲的細(xì)胞，但有些人在微小隱孢子蟲侵入后比MDCK、MA-104、HEP-2和VERO細(xì)胞更容易受到感染，其中微小隱孢子蟲不能有性繁殖，VERO細(xì)胞侵入性最小，不能形成滋養(yǎng)層[10]。結(jié)果還表明，小隱孢子蟲體外培養(yǎng)的絨毛細(xì)胞獲得的卵囊更具感染性，更適合小隱孢子蟲體外培養(yǎng)[11]。溫度對球蟲的生長也有很大的影響。以LMH、BHK、MDBK、HCT-8、VERO、CRFK、PK-15、RK-13和IEC-6為載體時，41℃更適合球蟲生長，以CaCO-2和MDCK為載體時，37℃更適合球蟲生長。更適合球蟲生長。因為球蟲自然宿主的體溫是41℃。研究表明，弓形蟲在37℃和室溫下的體外培養(yǎng)對弓形蟲感染率有顯著影響，29℃的體外培養(yǎng)可產(chǎn)生較多的速殖子。但是溫度對葡萄孢菌體外培養(yǎng)的影響不大，在細(xì)胞類型中起著重要作用。然而，艾美耳球菌體外培養(yǎng)細(xì)胞毒的研究卻未見報道。實驗結(jié)果表明，37℃下強毒艾美球蟲的侵襲時間明顯長于41℃，這可能是由于體溫為41℃所致。雖然37℃更適合細(xì)胞生長，但如果需要進(jìn)行毒力艾美耳球菌的體外培養(yǎng)試驗，則認(rèn)為孢子侵染和隨后的培養(yǎng)過程中的溫度控制更接近自然狀態(tài)。

培養(yǎng)基也是影響球蟲生長的重要因素。結(jié)果表明，5%水解乳蛋白的MEM細(xì)胞培養(yǎng)基是一種適合E.tenella艾美耳球菌體外培養(yǎng)的培養(yǎng)體系。將腺苷或肌苷加入THP-1培養(yǎng)72h的微小隱孢子蟲培養(yǎng)基中，可以增加卵囊的產(chǎn)生，而在MDBK細(xì)胞中添加肌苷24h也可以增加卵囊的產(chǎn)生。在培養(yǎng)基中加入葉酸可提高球蟲的表達(dá)。此外，ph值也會影響球蟲的產(chǎn)量。一般認(rèn)為pH7.4對球蟲生長最有利。血清含量對弓狀細(xì)胞增殖有明顯影響。實驗結(jié)果表明，肌苷能提高孢子的侵染率，且比其他組分更有效。

血清是球蟲培養(yǎng)不可缺少的成分。經(jīng)過長時間的探索，我們發(fā)現(xiàn)雞血清在培養(yǎng)嫩鏈球菌中起著重要作用。與牛血清和豬血清相比，雞血清能促進(jìn)雞腎細(xì)胞的生長和有絲分裂原的形成。實驗表明，雞血清有利于卵泡的形成，其作用機制可能與雞血清的同源性有關(guān)。

維生素曾經(jīng)被認(rèn)為是球蟲培養(yǎng)的重要成分。蘇丁澤陽， 高陽[12]證明，生物素、葉酸、肌醇、鹽酸硫胺素、維生素E、維生素K、對氨基苯甲酸、維生素BX和維生素E有利于E.tenella第二代分裂階段和卵泡形成。然而，王黎霞等[13]發(fā)現(xiàn)這些維生素不是E.tenella生長所必需的E.物質(zhì)。氨基酸中的精氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、亮氨酸和色氨酸被認(rèn)為是e培養(yǎng)物，E.tenella的有用物質(zhì)由于缺乏在培養(yǎng)基中，對培養(yǎng)結(jié)果有很大的影響。蔣保余[14]證實了這一點。盡管以前對培養(yǎng)基的組成進(jìn)行了大量的研究，但E.tenella的栽培工作未能突破，卵囊產(chǎn)量沒有提高，檢測結(jié)果不穩(wěn)定，影響細(xì)胞培養(yǎng)的正?；榱私鉀Q卵囊產(chǎn)生的問題，我們研究了胰島素對E.tenella細(xì)胞的影響。E.tenella細(xì)胞的培養(yǎng)表明，它不僅能促進(jìn)雞原代腎細(xì)胞的生長，而且能促進(jìn)第二代E.tenella淋巴細(xì)胞的生長和增加卵泡數(shù)量。以前的培養(yǎng)E.E.tenella的結(jié)果是每平方厘米只有200個卵囊。結(jié)果表明，在胰島素培養(yǎng)基中加入0.05μg/mL，培養(yǎng)基中卵泡數(shù)穩(wěn)定且顯著增加。電流實驗結(jié)果達(dá)到700個單位。生理學(xué)研究表明，胰島素在調(diào)節(jié)糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝中起著非常復(fù)雜的作用。胰島素調(diào)節(jié)的一般方向是促進(jìn)合成代謝和抑制合成代謝。結(jié)果表明，胰島素對雞腎細(xì)胞和E.tenella芽孢桿菌的作用相似，但其作用機制有待進(jìn)一步研究。

雞腎原代細(xì)胞和對蝦腎原代細(xì)胞的培養(yǎng)，細(xì)胞生長迅速，活力旺盛，第二代血吸蟲數(shù)量高于小牛血清。然而，細(xì)胞生長迅速，細(xì)胞團(tuán)消失，如果繼續(xù)使用胎牛血清，最終培養(yǎng)的卵囊數(shù)量減少，這與小跑團(tuán)的減少有關(guān)。在E.tenella細(xì)胞培養(yǎng)中，建議用小牛血清和雞血清提高卵囊產(chǎn)量。

整體而言，作者認(rèn)為在體外培養(yǎng)過程中，當(dāng)vero細(xì)胞在40℃條件下使用時，在培養(yǎng)基中加入葉酸更有利于實驗的準(zhǔn)確性。