魏華威，康國強，李 響，李東燕，魏景文★

（1.海關總署北京緝私犬基地 100142；2.北京市公安局順義分局刑偵支隊警犬技術管理中隊 100142；3.海關總署瑞麗緝私犬基地 100142；4.中華人民共合國北京海關 100142）

子宮是哺乳動物繁衍的重要器官，是雌性生殖系統(tǒng)的核心器官之一。近年來，伴隨著人與犬的關系已由最初的飼養(yǎng)者與被飼養(yǎng)動物上升到伴侶動物及家人的關系，母犬繁殖障礙相關生殖器官疾病已得到獸醫(yī)工作者的廣泛關注。

子宮內(nèi)膜健康的性狀是妊娠能否成功的關鍵因素。研究顯示，在失敗的妊娠中約60%的病例與子宮內(nèi)膜的不正常相關[1]。在子宮內(nèi)膜的各項指標中，子宮容受性是一個十分關鍵的項目，其特指子宮內(nèi)膜對于受精卵的接受能力，即允許胚胎在子宮進行著床的能力，該階段特點主要是子宮內(nèi)膜發(fā)生了分子和組織學上的一系列生理變化，如上皮細胞增殖被抑制、上皮細胞重塑，同時子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞發(fā)生蛻膜化。對哺乳動物而言，除了雌激素和孕激素外，還有一些其他分子生物學指標評價子宮容受性，如整合素αv，β3 (Integrin αv，β3)，同源框基因 (小時omeobox Genes， 小時OX) 家族的小時OXA10和大分子轉(zhuǎn)膜黏蛋白-糖蛋白1 (Mucinglycoprotein 1， MUC-1)等[3]。

肝素具有抗血栓形成和調(diào)節(jié)免疫的作用。在人類生殖領域，肝素已被證明可改善子宮內(nèi)膜血供，并通過改善子宮內(nèi)膜容受性，提高胚泡植入的成功率[5]，但目前針對犬子宮內(nèi)膜容受性的研究還尚無報道?；诖耍狙芯恐荚谕ㄟ^體外培養(yǎng)犬子宮內(nèi)膜上皮細胞，評估外源肝素鈉（小時eparin sodium salt，小時SS）對子宮容受性因子Integrin αvβ3、小時OXA10和MUC-1蛋白表達的影響，進一步分析肝素鈉的潛在治療價值。

1 材料和方法

1.1 子宮樣品收集

犬子宮由北京農(nóng)學院動物醫(yī)院提供，為正常犬子宮與卵巢切除術后子宮，通過卵巢狀態(tài)判斷為間情期階段子宮。將手術收集的子宮組織用室溫的DPBS（磷酸鹽緩沖液）進行沖洗。

1.2 犬子宮內(nèi)膜上皮細胞體外培養(yǎng)

在滅菌條件下，完成子宮內(nèi)膜的剝離，用含有雙青、鏈霉素的DPBS沖洗3次，修剪為約1m3的組織塊。將處理好的組織均勻鋪于細胞培養(yǎng)瓶中，靜置1.5h后，加入含10% FBS的細胞完全培養(yǎng)基( DMEM/F12，HYClone) ，然后將組織放入37℃、5%濃度二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每隔 2d更換一次細胞液體，當細胞增殖鋪滿50%時，用0.25%胰蛋白酶進行純化并傳代。

1.3 子宮內(nèi)膜上皮細胞的鑒定

將第二代犬子宮內(nèi)膜上皮細胞移至 6 孔板中進行細胞爬片。培養(yǎng)5d后去除培養(yǎng)液并清洗3次；然后加入4%的多聚甲醛固定10min；清洗3次后，加入0.15% Triton X-100通透15min。用1%的BSA封閉25min后，再按1:100加入兔抗多克隆角蛋白-18抗體（北京博奧森生物技術有限公司，bs-2043R）。在4℃下恒溫過夜后，按1:200再加入FITC標記的山羊抗兔熒光二抗（北京全式金生物技術有限公司，小時S121），避光孵育1h。經(jīng)過DPBS再次清洗3次后，用1μg /mL DAPI避光孵育2min，清洗后用熒光顯微鏡進行拍照觀察。

1.4 細胞處理

將第二代犬子宮內(nèi)膜上皮細胞接種于6孔板中，靜置培養(yǎng)24h后，加入基礎培養(yǎng)基對細胞饑餓12h。加入不同濃度小時SS（終濃度為0， 10， 20和40 μg/mL，Sigma公司，美國），處理24h后收集的細胞檢測子宮容受性因子Intergrin αv，β3、小時OXA10和MUC-1的表達變化。

1.5 總蛋白提取及Western Blot

將收集的細胞中加入含1%PMSF的RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司），以12000 r/min離心10min后，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度；加入4×Loading Buffer（北京索萊寶科技有限公司）于95℃變性10min并進行 SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2h后，分別用Intergrin αv多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，10569-1-AP，1:1000），Intergrinβ3多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，18309-1-AP，1:1000），小時OXA10多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司，bs-2502R，1:1000），MUC-1多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，23614-1-AP，1:1000）和β-actin多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司，bs-0061R，1:4 000）4℃孵育過夜。清洗后，用小時RP標記的羊抗兔IgG抗體（北京博奧森生物技術有限公司，bs-0295G-小時RP，1:3000）37℃孵育2h。最后用ECL化學發(fā)光法對蛋白條帶進行檢測。

1.6 數(shù)據(jù)分析

上述實驗收集到的數(shù)據(jù)應用SPSS Statistics 21.0軟件進行單因素方差分析，然后使用Prism 5軟件進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)的圖表繪制并做圖像分析。

2 結果與分析

2.1 上皮細胞鑒定

結果如圖1A所示，純化后的犬牛子宮內(nèi)膜上皮細胞貼壁后表現(xiàn)出明顯的“鋪路石”形態(tài)，通過細胞免疫熒光法檢測到在犬子宮內(nèi)膜上皮細胞中CK-18的表達，結果如圖所示，約90%細胞的表達呈強陽性（圖1B-D），實驗表明所獲得的高純度細胞可以滿足接下來實驗的要求。

圖1 子宮內(nèi)膜上皮細胞（犬）的培養(yǎng)鑒別

2.2 不同濃度肝素鈉對犬子宮內(nèi)膜上皮細胞容受性因子Intergrin αv，β3、小時OXA10和MUC-1表達的影響

結果如圖2所示，40 μg/mL 小時SS顯著促進了Intergrin αv，β3和小時OXA10蛋白的表達 (P ＜ 0.01)；與之相反，小時SS呈濃度依賴性的抑制MUC-1蛋白的表達 (P＜0.05)。

圖2 不同濃度肝素鈉對犬子宮內(nèi)膜上皮細胞Intergrin αv，β3、小時OXA10和MUC-1表達的影響

3 討論

子宮是胎兒生長發(fā)育和娩出的器官，其功能層是胚胎著床附植的場所，在生殖、生理研究中占據(jù)著重要地位[6]。體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細胞是研究雌性生殖、生理或病理及母體與胚胎之間相互作用機理的最佳材料。因此，如何保證子宮內(nèi)膜細胞獲取后的高同一性和高純度對于接下來體外生殖研究十分重要，該技術的成熟建立對犬繁殖學與繁殖障礙疾病的研究具有重要意義。

目前，國內(nèi)外研究團隊已先后成功建立了人[7]、小鼠[8]、豬[9]、牛[10]和山羊[11]等哺乳動物子宮內(nèi)膜上皮細胞的培養(yǎng)體系。子宮內(nèi)膜上皮細胞的分離培養(yǎng)方法較多，組織貼壁法和酶消化法是最為常見。在細胞純化方面，應用較多的有酶消化法、機械刮出法以及反復貼壁法等[12]。原代培養(yǎng)的子宮細胞主要是上皮細胞和基質(zhì)細胞混合生長。在用胰蛋白酶消化細胞時，由于上皮和基質(zhì)細胞特性，基質(zhì)細胞先脫壁，而上皮細胞則需要消化較長時間，特別是在原代和早期傳代培養(yǎng)中差別尤為明顯[13]。因此，本實驗應用子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞對胰蛋白酶的耐受程度不同，采用多次差時消化法即可純化出上皮細胞。所得細胞呈鋪路石狀，同時利用CK18抗體進行免疫熒光染色，約95%細胞呈綠色熒光染色，表明本試驗培養(yǎng)的犬子宮內(nèi)膜上皮細胞純度較高，可有效用于后續(xù)研究。

哺乳動物子宮處于“容受狀態(tài)”時，除了發(fā)生組織學變化外，多種相關因子同樣可作為標志物用于評估該生物過程。子宮內(nèi)膜上皮細胞表面存在的整合素αvβ3和小時OXA10呈時空特異性表達，它們是影響哺乳動物子宮容受性的兩個關鍵標志因子[14，15]。而抗黏附因子家族代表的MUC-1則起到阻礙胚胎植入作用，其表達的下調(diào)可以提高母體子宮的容受性，對于胚胎附植具有利作用[16]。肝素鈉是肝素的衍生物，其具有抗栓活性、抗凝活性，可迅速起效，發(fā)揮持續(xù)性抗血栓形成作用[4]。在胚泡植入障礙模型小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，肝素可通過促進子宮內(nèi)細胞增殖分化和血管生成促進維持子宮內(nèi)膜的良好血供，進而增強子宮內(nèi)膜容受性并提高胚泡的植入率[5]。有趣的是，在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，肝素鈉可直接作用于犬子宮內(nèi)膜上皮細胞，促進其容受性標志分子Intergrin αv，β3和小時OXA10的表達，并抑制MUC-1的表達，這表明肝素鈉除了通過維持子宮內(nèi)膜血供外，對于子宮內(nèi)膜的容受性還具有直接的調(diào)控作用。

4 結論

綜上所述，本研究成功建立了一種便捷、實用、高效的犬子宮內(nèi)膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法；并發(fā)現(xiàn)40μg/mL肝素鈉可通過調(diào)控Intergrin αv，β3和小時OXA10和MUC-1的表達，對于犬子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控具有積極的實踐意義，下一步我們將對其調(diào)控的機制機理展開更加深入的研究。