李永光，文育勝，劉雯雯，趙濤，魏芳，祁光宇

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，甘肅 定西 730500；2.甘肅省定西市臨洮農(nóng)業(yè)學(xué)校，甘肅 定西 730500；3.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州 730046）

奧斯特線蟲(chóng)主要分布在溫帶和氣溫較涼爽的地區(qū)，主要感染牛、綿羊、山羊和其他家養(yǎng)和野生反芻動(dòng)物，也可以感染人。給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且危害人類身體健康［1-2］。奧斯特線蟲(chóng)通常和東方毛圓線蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、羊仰口線蟲(chóng)、甘肅食道口線蟲(chóng)等消化道線蟲(chóng)混合感染，對(duì)上述消化道線蟲(chóng)的診斷，具有重要的經(jīng)濟(jì)學(xué)意義［3］。傳統(tǒng)上對(duì)線蟲(chóng)的診斷主要依靠第3階段幼蟲(chóng)（L3）的孵化和其形態(tài)差別，費(fèi)時(shí)費(fèi)力［4-6］，且特異性和敏感性較低［7-8］，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法對(duì)形態(tài)相似的蟲(chóng)種進(jìn)行鑒別存在較大的局限性。電鏡雖可以將不同蟲(chóng)種準(zhǔn)確區(qū)分，但需要專業(yè)人員，成本高，不適用于大樣本研究［9］。奧斯特線蟲(chóng)寄生于牛羊皺胃和十二指腸，糞便抗原免疫學(xué)檢測(cè)可以作為其診斷方法之一，Agneessens等2001年建立了一種關(guān)于胃部感染線蟲(chóng)檢測(cè)糞便蟲(chóng)體抗原的捕獲ELISA方法，敏感性較好，但是特異性較差，很難在臨床上應(yīng)用［10］。奧斯特線蟲(chóng)蟲(chóng)卵隨牛羊糞便排出體外，糞便蟲(chóng)卵檢測(cè)在一定程度上可以對(duì)奧斯特線蟲(chóng)感染做出定性診斷［11］。為克服形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)診斷的局限性，分子生物學(xué)方法已經(jīng)用于小反芻動(dòng)物［12-15］和牛［16-18］的重要胃腸道線蟲(chóng)的鑒別診斷。

PCR-ELISA方法具有更快的診斷速度和更高的靈敏度，為寄生蟲(chóng)的鑒別診斷、分類和流行病學(xué)調(diào)查提供了簡(jiǎn)便的方法［19-20］。目前該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物檢疫、醫(yī)學(xué)、食品等多個(gè)學(xué)科［21-24］。核糖體DNA中介于5.8S，18S和28S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS），包括ITS-1和ITS-2 2段序列，由于ITS區(qū)受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速度快且長(zhǎng)度不大，加上協(xié)同進(jìn)化使該片段在基因組不同單元間極其一致，且5.8S，18S和28S rDNA的高度保守，便于設(shè)計(jì)引物進(jìn)行動(dòng)物寄生蟲(chóng)的種間以及株間的分類鑒定，可以利用ITS的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)建立特異的檢測(cè)方法［25-26］。因此，本研究以環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)的ITS-2為靶基因，通過(guò)條件篩選，旨在建立環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)PCR-ELISA的快速檢測(cè)方法，為臨床環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)病的批量診斷服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)、東方毛圓線蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、羊仰口線蟲(chóng)、甘肅食道口線蟲(chóng)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜寄生蟲(chóng)病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供。

1.1.2 試劑與耗材鏈霉親和素和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體購(gòu)于Sigma公司；BSA、TMB顯色液購(gòu)于Solarbio公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)于OMEGA公司；pMD 19-T載體和DNA提取試劑盒購(gòu)于Takara公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司；其余試劑均為化學(xué)分析純。

PCR儀購(gòu)于Bio-Rad公司；電泳儀、電泳槽及凝膠成像儀購(gòu)于北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的Ostertagia circumcincta間隔區(qū)ITS-2基因序列，在NCBI對(duì)ITS-2基因序列進(jìn)行比對(duì)，用Oligo 6引物分析軟件，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 樣品寄生蟲(chóng)DNA提取及環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)ITS-2基因PCR產(chǎn)物克隆鑒定、測(cè)序取1.1.1中的環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)、東方毛圓線蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、羊仰口線蟲(chóng)、甘肅食道口線蟲(chóng)樣品，按TaKaRa DNA提取試劑盒操作步驟提取上述寄生蟲(chóng)基因組DNA，4℃保存?zhèn)溆?。用設(shè)計(jì)合成的引物對(duì)環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將回收后的DNA連接到載體pMD 19-T構(gòu)建pMD 19-T-ITS-2質(zhì)粒。將鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)和分析。

1.2.3 引物標(biāo)記以及PCR擴(kuò)增在引物的上下游5'端分別標(biāo)記上地高辛（DIG）和生物素（BIO），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成1對(duì)PCRELISA所需要的引物。

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.3 環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)ITS-2基因PCR-ELISA檢測(cè)方法的建立

1.3.1 鏈霉親和素最佳包被濃度的確定用0.05 mol/L、pH為9.6的碳酸鹽緩沖液，把鏈霉親和素（1 mg/mL）倍比稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156 25 μg/mL，200 μL/孔包被酶標(biāo)板，4℃濕盒過(guò)夜，按照稀釋后的濃度進(jìn)行PCR-ELISA檢測(cè)，依據(jù)D450nm以及P/N值確定鏈霉親和素的最佳包被濃度。

1.3.2 最佳封閉液濃度和封閉時(shí)間的確定按照1.3.1篩選出的鏈霉親和素的最佳包被濃度包被酶標(biāo)板，分別用1%、2%、3%、4%、5%、6%和8%的BSA封閉液封閉，以標(biāo)記引物所擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物作為一抗，用1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的抗地高辛抗體作為二抗，將封閉時(shí)間設(shè)定為10、20、30、45、60、90、120 min，進(jìn)行PCR-ELISA檢測(cè)，確定最佳封閉液濃度和封閉時(shí)間。

1.3.3 一抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定按照1.3.1和1.3.2篩選出的最佳包被濃度和最佳封閉條件，以標(biāo)記引物所擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物作為一抗，將PCR產(chǎn)物加入酶標(biāo)板的反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)定為5、l0、20、30、40、50、60 min，進(jìn)行PCR-ELISA檢測(cè)，確定一抗最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.4 酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)條件的確定根據(jù)1.3.3篩選出的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行PCR-ELISA，將HRP標(biāo)記的抗地高辛抗體（1 mg/mL）按照1∶500依次倍比稀釋至1∶32 000，將二抗反應(yīng)時(shí)間依次設(shè)定為5、l0、20、30、40、50、60 min，根據(jù)結(jié)果確定最佳反應(yīng)條件［27］。

1.3.5 最佳顯色時(shí)間的確定根據(jù)上述最佳反應(yīng)條件進(jìn)行PCR-ELISA的測(cè)定，37℃條件下，將顯色時(shí)間設(shè)置為1、3、5、10、15、20 min，根據(jù)結(jié)果確定最佳反應(yīng)條件。

1.3.6 PCR最佳循環(huán)次數(shù)的確定以O(shè)stertagia circumcincta間隔區(qū)ITS-2設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR循環(huán)數(shù)分別設(shè)置為5、10、15、20、25、30和35，進(jìn)行PCR-ELISA檢測(cè)，根據(jù)結(jié)果確定最佳循環(huán)次數(shù)。

1.3.7 PCR-ELISA臨界值的測(cè)定利用建立好的PCR-ELISA檢測(cè)方法，對(duì)己知的42份環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)陰性樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)測(cè)得的D450nm值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.8 敏感性試驗(yàn)用超純水將環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)陽(yáng)性DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋濃度分別為4.1 ng/μL、410 pg/μL、41 pg/μL、4.1 pg/μL、410 fg/μL、41 fg/μL，按所建立的PCR-ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，與常規(guī)PCR作比較，評(píng)價(jià)其敏感性。

1.3.9 特異性試驗(yàn)對(duì)環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)、東方毛圓線蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、羊仰口線蟲(chóng)、甘肅食道口線蟲(chóng)基因組DNA，按所建立的PCR-ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其特異性。

1.3.10 重復(fù)性試驗(yàn)用同一批次包被的酶標(biāo)板對(duì)環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)病的4份陽(yáng)性樣品和1份陰性樣品進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，每份樣品重復(fù)檢測(cè)5次，評(píng)價(jià)其批內(nèi)重復(fù)性。用不同批次包被的酶標(biāo)板對(duì)環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)病的4份陽(yáng)性樣品和1份陰性樣品進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，每份樣品重復(fù)檢測(cè)5次，評(píng)價(jià)其批間重復(fù)性，測(cè)定其D450nm值，計(jì)算變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物克隆鑒定與測(cè)序

對(duì)環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)基因組DNA PCR產(chǎn)物和重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-ITS-2 PCR產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，90 V電壓電泳40 min，均可以檢測(cè)到大小約196 bp的條帶，與預(yù)期大小相符（圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒pMD19-T-ITS-2的PCR鑒定結(jié)果（196 bp）Figure 1 PCR results of pMD19-T-ITS-2 plasmid

測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pMD19-T-ITS-2基因中的目的基因片段大小為196 bp，與試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果相符，其序列與GenBank中己經(jīng)發(fā)表的Osterta?gia circumcincta間隔區(qū)ITS-2基因序列同源性為99%，用BLAST軟件對(duì)序列進(jìn)行分析比對(duì)結(jié)果如圖2所示。

圖2 重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-ITS-2測(cè)序結(jié)果Figure 2 Sequencing results of pMD19-T-ITS-2 plasmid

2.2 環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)ITS-2基因PCR-ELISA檢測(cè)方法的建立

2.2.1 鏈霉親和素最佳濃度的確定由表1可知，當(dāng)鏈霉親和素濃度為1.25 μg/mL時(shí)，P/N=17.29的值最大，確定鏈霉親和素的最佳包被濃度為1.25 μg/mL。

表1 鏈霉親和素包被濃度的確定Table 1 Screening of the suitable concentration of streptavidin

2.2.2 最佳封閉液濃度和封閉時(shí)間的確定由表2可知，當(dāng)封閉液濃度為3%，封閉時(shí)間為30 min時(shí)，P/N=14.57值最大，確定BSA封閉液最佳封閉濃度為3%，最佳封閉時(shí)間為30 min。

表2 封閉液各工作濃度及時(shí)間的確定Table 2 Screening of sealing solution concentration and sealing time

2.2.3 一抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定由表3可知，當(dāng)PCR產(chǎn)物反應(yīng)20 min時(shí)，P/N=20.40值最大，確定一抗反應(yīng)最佳時(shí)間為20 min。

表3 一抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定Table 3 Screening of the optimum reaction time of pri‐mary antibody

2.2.4 酶標(biāo)二抗條件的確定由表4可知，當(dāng)HRP標(biāo)記的抗地高辛抗體濃度為1∶2 000，反應(yīng)時(shí)間為20 min時(shí)，P/N=14.09值最大，確定二抗最佳稀釋濃度為1∶2 000，最佳反應(yīng)時(shí)間20 min。

表4 二抗最佳反應(yīng)濃度和反應(yīng)時(shí)間的確定Table 4 Screening of the optimum reaction concentration and time of antibodyⅡ

2.2.5 最佳顯色時(shí)間的確定根據(jù)上述最佳反應(yīng)條件進(jìn)行PCR-ELISA，由表5可知，當(dāng)顯色時(shí)間為5 min時(shí)，P/N=15.50值最大，符合檢測(cè)要求。

表5 最佳顯色時(shí)間的確定Table 5 Screening of the optimal reactive time of the substrate

2.2.6 PCR最佳循環(huán)次數(shù)的確定由表6可知，當(dāng)循環(huán)數(shù)為30個(gè)循環(huán)時(shí)，P/N值=19.50最大。確定PCR擴(kuò)增的最佳循環(huán)次數(shù)為30個(gè)循環(huán)。

表6 PCR擴(kuò)增最佳循環(huán)次數(shù)的確定Table 6 Screening of the optimal cycle times for PCR amplification

2.2.7 PCR-ELISA臨界值的測(cè)定對(duì)42份樣品數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)SPSS軟件計(jì)算得到平均值X=0.17，標(biāo)準(zhǔn)方差SD=0.05，校正值=X+3SD=0.32，當(dāng)樣品PCR-ELISA檢測(cè)D450nm≥0.32時(shí)，判定為環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)陽(yáng)性，當(dāng)D450nm<0.32時(shí)，判定為陰性樣本。

2.2.8 敏感性檢測(cè)由圖3和表8可知，PCRELISA可檢測(cè)出環(huán)紋奧斯特線蟲(chóng)DNA的最低濃度為410 fg/μL，而常規(guī)PCR可以檢測(cè)最低模板濃度為4.1 pg/μL，證明PCR-ELISA的敏感性比常規(guī)PCR高10倍。

表8 PCR-EL1SA敏感性試驗(yàn)Table 8 The sensitivity test of PCR-ELISA

圖3 PCR敏感性檢測(cè)Figure 3 The Sensitivity of PCR

表7 PCR-ELISA臨界值確定Table 7 Determination of PCR-ELISA threshold values

2.2.9 特異性檢測(cè)用所建立的PCR-ELISA檢測(cè)方法對(duì)奧斯特線蟲(chóng)、東方毛圓線蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、羊仰口線蟲(chóng)、甘肅食道口線蟲(chóng)DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表9所示。奧斯特線蟲(chóng)D450nm為0.36，大于校正值0.32，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其他病原體D450nm均小于0.32，結(jié)果為陰性。證明本研究建立的PCR-ELISA檢測(cè)方法特異性好，無(wú)交叉反應(yīng)。

表9 PCR-ELISA特異性試驗(yàn)Table 9 The Specificity test of PCR-ELISA

2.2.10 重復(fù)性試驗(yàn)用同一批次包被的酶標(biāo)板進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，由表10可知，5份樣本的變異系數(shù)分別為4.00%，2.70%，3.00%，5.10%，7.90%，變異系數(shù)均低于8%，說(shuō)明建立的PCR-EL1SA檢測(cè)方法的批內(nèi)重復(fù)性良好。

表10 PCR-EL1SA批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)Table 10 The within-run repetive experiments of the PCR-EL1SA

用同一批次包被的酶標(biāo)板進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)，由表11可知，5份樣本的變異系數(shù)分別為3.80%，5.80%，7.10%，4.50%，7.80%，變異系數(shù)均低于10%（表11），說(shuō)明建立的PCR-EL1SA檢測(cè)方法的批內(nèi)重復(fù)性良好。

表11 PCR-EL1SA批間重復(fù)性試驗(yàn)Table 11 The between-run repetive experiments of the PCR-EL1SA

3 討論

PCR-ELISA檢測(cè)是將PCR擴(kuò)增目的基因與ELISA準(zhǔn)確定量相結(jié)合的一種檢測(cè)方法，該方法將PCR檢測(cè)的快速性與ELISA檢測(cè)的敏感性有機(jī)結(jié)合，使生物信號(hào)逐級(jí)放大，具有敏感、特異、可大量檢測(cè)樣品等優(yōu)點(diǎn)［28-30］，為醫(yī)療、獸醫(yī)和農(nóng)業(yè)等行業(yè)重要的檢測(cè)方法［31］。該方法可直接通過(guò)讀取D450nm值判斷結(jié)果，減少了人為因素對(duì)結(jié)果的影響，同時(shí)無(wú)需接觸溴化乙錠（EB）致癌物質(zhì)，減少了對(duì)試驗(yàn)人員和環(huán)境的潛在危險(xiǎn)。

本試驗(yàn)對(duì)奧斯特線蟲(chóng)ITS?2基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，在上下游引物的5’端分別標(biāo)記生物素和地高辛，利用生物素和鏈霉親和素特異性結(jié)合的原理，帶有標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與鏈霉親和素結(jié)合，酶標(biāo)二抗與地高辛結(jié)合。鏈霉素和生物素的結(jié)合能力是普通抗原抗體結(jié)合能力的106倍，“鏈霉親和素-生物素”系統(tǒng)是PCR-ELISA檢測(cè)的最好搭檔［32-35］。通過(guò)對(duì)鏈霉親和素的包被濃度、包被條件、封閉液濃度及封閉時(shí)間、PCR產(chǎn)物反應(yīng)時(shí)間、二抗工作濃度以及反應(yīng)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，最終篩選出最佳奧斯特線蟲(chóng)PCR-ELISA反應(yīng)條件。

本試驗(yàn)對(duì)PCR擴(kuò)增的平臺(tái)期摸索確立了最佳循環(huán)次數(shù)，分別以5、10、15、20、25、30和35循環(huán)數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增并檢測(cè)，結(jié)果顯示30個(gè)循環(huán)數(shù)時(shí)，擴(kuò)增效率己經(jīng)達(dá)到最高，確定最佳循環(huán)數(shù)為30個(gè)循環(huán)，此時(shí)最為省時(shí)高效。同時(shí)，在試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)各個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳包被條件為1.25 μg/mL的鏈霉親和素4℃包被過(guò)夜，3%的BSA封閉液37℃條件下封閉20 min，PCR產(chǎn)物37℃作用20 min，HRP標(biāo)記的抗地高辛抗體2 000倍稀釋的酶標(biāo)二抗（1 mg/mL）37℃反應(yīng)20 min，顯色5 min。經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化，本試驗(yàn)建立的PCR-ELISA檢測(cè)方法比原來(lái)節(jié)省了0.5～1 h左右。

本試驗(yàn)建立的奧斯特線蟲(chóng)PCR-ELISA可檢測(cè)出樣本的最低濃度為410 fg/μL，而常規(guī)PCR可以檢測(cè)最低模板濃度為4.1 pg/μL，證明PCR-ELISA的敏感性比常規(guī)PCR高10倍，并與東方毛圓線蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、羊仰口線蟲(chóng)、甘肅食道口線蟲(chóng)無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明其特異性好。對(duì)相同模板進(jìn)行批間和批內(nèi)重復(fù)性進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示變異系數(shù)均低于10%，說(shuō)明建立的PCR-ELISA方法批內(nèi)批間重復(fù)性良好，證明本試驗(yàn)建立的PCR-ELISA檢測(cè)方法穩(wěn)定性高。本試驗(yàn)所建立的PCR-ELISA檢測(cè)方法具有高效、快速、靈敏、特異、安全等優(yōu)勢(shì)，可以快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)奧斯特線蟲(chóng)，為調(diào)查和預(yù)警提供技術(shù)支持。