劉彥峰，李俊娥，毛亞玲，韓舜愈，李霞

（1.莫高股份葡萄酒廠，甘肅 武威 733008；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 武威 733008）

2020年全球葡萄酒產(chǎn)量為260億L，在釀酒過程中葡萄皮渣廢料占加工總量的20%左右［1-2］。葡萄皮渣中含有大量的膳食纖維、皂苷類、白藜蘆醇、多酚類、花色苷、蛋白質(zhì)等多種功能性成分，但資源化利用率較低，造成了資源浪費的同時還嚴(yán)重污染了環(huán)境［3-18］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，皂苷類多具有祛痰止咳、抗菌、抗氧化、提高免疫能力、降血糖、抗結(jié)石和抗腫瘤等多方面的生物活性，同時植物皂苷類可以預(yù)防老年人骨質(zhì)疏松等多種疾病，是目前天然藥物領(lǐng)域研究的熱點，具有深度開發(fā)和利用的價值［19-24］。

隨著萃取技術(shù)體系的逐步發(fā)展和成熟，雙水相萃取法已被廣泛應(yīng)用到天然產(chǎn)物的研究中［25-28］。與傳統(tǒng)的乙醇回流提取法相比，雙水相萃取法具有設(shè)備簡單，可在常溫下進行，能耗低，不會破壞萃取物性質(zhì)，回收效率高等優(yōu)勢［29-32］。但目前關(guān)于釀酒葡萄皮渣的皂苷類萃取研究未見報道。本研究以無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值對葡萄皮皂苷分配系數(shù)及萃取率的影響為基礎(chǔ)，采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗，優(yōu)化萃取條件，以期為利用無水乙醇和硫酸銨雙水相體系提取葡萄皮渣中的皂苷提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

葡萄皮渣：2020年9月采自甘肅莫高實業(yè)股份有限公司，將采集的葡萄皮渣經(jīng)挑選、曬干、粉碎，得到干凈的葡萄皮粉末，備用。

1.2 儀器與試劑

722型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；PL203電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；XO-SM50超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)（南京先歐儀器制造有限公司）；DKB-501超級恒溫水?。〒P州三發(fā)電子有限公司）；FZ102微型植物試樣粉碎機（河北黃驊中興儀器有限公司）；DD-5M離心機（湖南凱達科學(xué)儀器有限公司）。

無水乙醇（≥99.7%）、香草醛（≥99%）、冰乙酸（≥99.5%）、高氯酸（≥72%）、硫酸銨、NaOH、HCl等均為國產(chǎn)分析純，購自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄皮中皂苷含量測定條件優(yōu)化

1.3.1.1 粗提液的制備［33］稱取葡萄皮粉末5 g，放入250 mL的三角瓶中，葡萄皮粉末與50%的無水乙醇以1∶5（g/mL）的比例混合搖勻，超聲15 min后2 000 r/min離心5 min，取粗提液待用。

1.3.1.2 雙水相萃取方法［34］準(zhǔn)確量取一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的無水乙醇、硫酸銨及葡萄皮皂苷粗提液，充分振蕩混勻后靜置，使兩相進行分離。

1.3.1.3 香草醛冰乙酸-高氯酸比色法測定皂苷含量［30，35］取分離液0.1 mL，依次加入0.2 mL香草醛冰乙酸混合液、0.8 mL高氯酸在60℃下水浴15 min，再用水冷卻5 min，用冰乙酸定容至10 mL，測定510 nm下的吸光值（空白對照將上清液換為等量蒸餾水）。帶入回歸方程y=0.066 1x-0.023，R2=0.997，（x為皂苷質(zhì)量濃度mg/mL，y為吸光值）得到皂苷的質(zhì)量濃度。

1.3.1.4 皂苷萃取率的測定［30］在雙水相萃取中，常采用相比R、分配系數(shù)K和萃取率Y作表征來評判雙水相體系中萃取物的萃取效果。分配系數(shù)K指物質(zhì)在兩相中的分配情況，為上下相質(zhì)量濃度比，萃取率Y指上相中的物質(zhì)含量占雙水相萃取出的總物質(zhì)含量的比例。

在香草醛冰乙酸-高氯酸比色法測定皂苷含量的基礎(chǔ)上，按（1）式計算葡萄皮皂苷的萃取率Y：

式中：V1：上相體積（mL）；V2：下相體積（mL）；C1：上相皂苷的質(zhì)量濃度（mg/mL）；C2：下相皂苷的質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.3.2 試驗設(shè)計

1.3.2.1 單因素試驗分別以無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值為單一變量，對皂苷萃取率進行分析。按照1.3.1.2、1.3.1.3方法計算萃取率并繪制圖表、解釋分析。

1.3.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取對葡萄皮皂苷萃取率影響較大的3個因素，采用中心組合試驗Box-Behnken設(shè)計試驗因素與水平（表1），采用Design Expert軟件設(shè)計3因素3水平。并用響應(yīng)曲面法對試驗結(jié)果進行比較分析，確定各因素之間的交互作用對葡萄皮皂苷萃取率的影響，優(yōu)化其萃取條件［36-37］。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計Table 1 Response surface test factors and levels design

1.3.2.3 穩(wěn)定性試驗取經(jīng)優(yōu)化工藝制備的同一樣液，分別在25、35、45、55℃條件下，每隔2 h測其吸光值，以吸光值的變化反映溫度對皂苷穩(wěn)定性的影響；測定Mg2+、K+、Ca2+等金屬離子在不同濃度下的吸光值，反映皂苷的金屬離子穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對葡萄皮中皂苷萃取率的影響選擇無水乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（V/V）分別為19%、21%、23%、25%、27%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，pH值為6時，對葡萄皮皂苷萃取率進行研究。考察無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對皂苷萃取率的影響。如圖1所示，皂苷萃取率和分配系數(shù)隨著無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，于分配理論而言，當(dāng)無水乙醇較少時，硫酸銨的鹽析起主要作用，隨著無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，黏度增加，同時相界面的張力也增加，破壞雙水相體系的穩(wěn)定性，從而降低了皂苷的萃取率［38］。由圖1所示，當(dāng)無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21%時，分配系數(shù)和萃取率達到最高值，綜合考慮確定無水乙醇的較佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21%。

圖1 無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對皂苷萃取率的影響Figure 1 Effect of mass fraction of anhydrous ethanol on extraction rate of saponins

2.1.2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對葡萄皮中皂苷萃取率的影響選擇硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為18%、20%、22%、24%、26%，無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)21%，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，pH值為6時，對葡萄皮皂苷萃取率進行研究?？疾炝蛩徜@質(zhì)量分?jǐn)?shù)對皂苷萃取率的影響。如圖2所示，分配系數(shù)和皂苷萃取率隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大，達到最大值后略有下降，主要原因是：隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，雙水相體系的分相能力逐漸增大，故皂苷萃取率會增大，但硫酸銨用量飽和后對萃取率影響不再有明顯的影響；硫酸銨用量不同，上下相電位差也不同，而電位差大小影響萃取率和分配系數(shù)，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時，會破壞皂苷，從而使皂苷萃取率下降［39］。因此，硫酸銨的較佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定為24%。

圖2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對皂苷萃取率的影響Figure 2 Effect of mass fraction of ammonium sulfate on extraction rate of saponins

2.1.3 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對葡萄皮中皂苷萃取率的影響選擇粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%、8%、10%，無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)21%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%，pH值為6時，對葡萄皮皂苷萃取率進行測定。考察粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對皂苷萃取率的影響。如圖3所示，分配系數(shù)和皂苷萃取率隨著粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，可見，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響上下相的分配。當(dāng)粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到一定值時，由于皂苷的溶解性是一定的，只增加粗提液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而在無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變的情況下，不再溶解皂苷，增加粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)，反而可能會使溶出量下降。綜合考慮，確定較佳的粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。

圖3 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對皂苷萃取率的影響Figure 3 Effect of mass fraction of crude extract on extraction rate of saponins

2.1.4 pH值對葡萄皮皂苷萃取率的影響選擇體系pH值分別為3、4、5、6、7，無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)21%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，對葡萄皮皂苷萃取率進行研究。考察pH值對皂苷萃取率的影響。體系pH值可以改變兩相電位差，因此pH值對萃取物的分配影響較大［2］。圖4表明，分配系數(shù)和皂苷萃取率隨pH值的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，pH值為6時分配系數(shù)和皂苷萃取率最高，因此確定較佳pH值為6。

圖4 pH值對皂苷萃取率的影響Figure 4 Effect of pH value on extraction rate of saponins

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化萃取條件及結(jié)果根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選取對葡萄皮皂苷萃取率影響較大的3個因素：粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、pH值（B）、無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）分別為自變量，皂苷萃取率為響應(yīng)值，在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%的基礎(chǔ)上進行試驗設(shè)計。響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析對Box-Behnken響應(yīng)面試驗進行方差分析，結(jié)果見表3。

使用Design-Expert 8.0.6軟件對表2、3數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，建立葡萄皮皂苷萃取率工藝參數(shù)回歸方程為：

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

由表3數(shù)據(jù)可知，模型P<0.000 1，說明回歸方差分析模型顯著，失擬項P值=0.888 1>0.05，差異不顯著，說明皂苷萃取率的其他未知因素對試驗結(jié)果的干擾程度小，試驗誤差小，該回歸模型與實測值能較好的擬合，能很好的對響應(yīng)值進行預(yù)測。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=0.72%，較低，表明試驗具有較好的可靠性；模型決定系數(shù)R2=0.997 7，說明響應(yīng)值皂苷萃取率試驗值和預(yù)測值間擬合度良好，校正系數(shù)R2Adj=0.994 8，表明該模型能解釋99.48%響應(yīng)值的變化，因而該模型擬合程度良好，可用此模型來預(yù)測和分析葡萄皮中的皂苷萃取率。

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 3 The ANOVA results of response surface

從方差分析結(jié)果可以看出，該回歸模型F檢驗非常顯著（P<0.01），模型的一次項系數(shù)B（pH值）、C（無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)）對皂苷萃取率（Y）的影響均為極顯著（P<0.01），而A（粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的影響不顯著（P>0.05）；交互項AC對響應(yīng)值的影響極顯著（P<0.01），其他交互項均不顯著（P>0.05）；二次項A2、B2、C2均極顯著（P<0.01）。由模型各因素的回歸系數(shù)絕對值大小可知，3個因素對葡萄皮中皂苷萃取率影響的大小順序依次是：C>B>A，即無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)>pH值>粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析利用Design-Expert 8.0.6軟件繪制粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)3個因素的交互作用對葡萄皮皂苷萃取率影響的響應(yīng)曲面及等高線圖（圖5）。響應(yīng)曲線圖的曲線越平緩則表示影響越不顯著，反之則亦然；等高線為圓形，表示交互作用不顯著，等高線為橢圓形，則表示交互作用顯著。該結(jié)果與回歸方程方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線Figure 5 Response surfaces and contour plots of interaction of various factors

2.3 驗證試驗

采用軟件Design-Expert V 8.0.6對模型進行分析，獲得葡萄皮皂苷萃取的最優(yōu)條件為：粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.02%，pH值5.86，無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)21.11%。為驗證結(jié)果的真實準(zhǔn)確性及試驗的實際操作考慮，將其修正為粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，pH值6，無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21%。在調(diào)整后的最佳萃取條件下進行3次平行驗證試驗，最終皂苷萃取率平均值為90.3%，這與預(yù)測值90.615 6%相接近，表明了模型的預(yù)測值與試驗值擬合較高，試驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.4 穩(wěn)定性試驗

2.4.1 溫度對皂苷穩(wěn)定性的影響由圖6可知，溫度在45℃時吸光值變化幅度較小，說明在此溫度下皂苷的穩(wěn)定性好；而吸光值在25、35、55℃時都有大幅度的變化，皂苷有被破壞的跡象。

圖6 溫度對皂苷穩(wěn)定性的影響Figure 6 Effect of temperature on the stability of saponins

2.4.2 金屬離子對皂苷穩(wěn)定性的影響由圖7所示，不同的金屬離子對皂苷的穩(wěn)定性有一定的破壞，若吸光值變化幅度較小，說明皂苷的穩(wěn)定好；若出現(xiàn)大幅度的變化，說明皂苷穩(wěn)定性不好。因此，Mg2+、K+、Ca2+對皂苷的穩(wěn)定性都有不同程度的影響［40］。

圖7 金屬離子對皂苷穩(wěn)定性的影響Figure 7 Effect of metal ion on the stability of saponins

3 討論

葡萄皮渣作為葡萄酒生產(chǎn)過程的主要廢棄物，包括葡萄皮、葡萄籽及少量果肉，年產(chǎn)量近1 000萬t。葡萄皮渣中含有多種有機質(zhì)，可作為生產(chǎn)原料進一步開發(fā)利用［41］。近年來，國外對葡萄皮渣的再利用已有較深的研究和了解，且部分研究成果已成功應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)［42-43］。我國將酒釀葡萄皮渣作為牲畜飼料、肥料甚至垃圾處理。造成了極大的資源浪費，同時污染生態(tài)環(huán)境。因此，對葡萄皮渣的綜合開發(fā)利用具有重要的意義。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，皂苷為糖的衍生物，具有祛痰止咳、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、提高免疫能力、降血糖、降血脂、抗結(jié)石等多種功效。目前，天然產(chǎn)物的提取方法包括蒸餾、超聲、微波輔助提取、超臨界流體萃取及雙水相萃取等。水蒸氣蒸餾方法操作簡便，但提取率低、耗時較長且操作溫度高；超聲、微波輔助提取方法對生產(chǎn)設(shè)備要求較高；超臨界流體萃取具有高效、產(chǎn)生雜質(zhì)少等優(yōu)勢，但該方法操作復(fù)雜且成本較高［44-45］。雙水相萃取操作條件溫和，可在常溫常壓下進行，且設(shè)備簡單。萃取兩相易分散，傳質(zhì)速度快，不存在有機溶劑殘留問題，綠色環(huán)保，適用于萃取生物活性物質(zhì)［46］。王婉麗等［19］對倒心盾翅藤總皂苷進行提取工藝優(yōu)化，評價了乙醇體積、料液比、提取時間及提取溫度對皂苷得率的影響，同時證實了提取工藝的可行性。但雙水相萃取葡萄皮皂苷的相關(guān)研究還未見文獻報道。本試驗選用雙水相萃取方法，根據(jù)單因素試驗及Box-Behnken響應(yīng)面法考察乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值等對皂苷萃取率的影響，確定最佳的提取工藝，證明模型和提取工藝的穩(wěn)定性及可行性。

4 結(jié)論

本試驗采用雙水相法萃取葡萄皮中的皂苷，根據(jù)單因素試驗和Box-Behnken響應(yīng)面分析法考察粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對皂苷萃取率的影響，確定了萃取葡萄皮中皂苷的最佳條件：無水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)21%，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，pH值6，萃取率為90.3%。并對優(yōu)化后的皂苷進行穩(wěn)定性研究，結(jié)果表明，45℃時皂苷穩(wěn)定性最好，金屬離子Mg2+、K+、Ca2+的作用下都對皂苷的穩(wěn)定性有影響。