劉 毅，袁 莉，袁嘉怡，儲(chǔ) 文，馬衛(wèi)興,2,3,*

（1.江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇海洋大學(xué)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)學(xué)院，江蘇 連云港 222005；3.江蘇省海洋藥物篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005）

L-半胱氨酸是一種含有巰基的天然氨基酸，不僅在人體新陳代謝、蛋白折疊、酶促反應(yīng)等生理過(guò)程中扮演著重要角色[1-2]，其水平異常還可能與疾病相關(guān)，例如：生長(zhǎng)緩慢、脫發(fā)、水腫、肝臟損傷、肌肉松弛以及皮膚病變等[3-4]。同時(shí)，半胱氨酸可作為風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、帕金森病、阿爾茨海默癥、妊娠并發(fā)癥以及乳腺癌等癌癥的生物標(biāo)志物[5-7]。半胱氨酸在食品、醫(yī)藥、化妝品行業(yè)也有著廣泛應(yīng)用，例如食品添加劑[8]、肝臟藥、解毒藥[9]以及美白產(chǎn)品[10]等。

因此，建立省時(shí)高效的方法用于半胱氨酸的定量測(cè)定具有重要意義。目前，檢測(cè)半胱氨酸的分析方法主要有分光光度法[11-12]、熒光分析法[13-14]、電化學(xué)法[15-16]、高效液相色譜法[17-18]、滴定法[19-20]等，這些方法多數(shù)需要精密儀器，且操作復(fù)雜、成本較高。共振光散射技術(shù)是一種在熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行測(cè)定的分析技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、靈敏、快速、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、藥品中某些成分的定量檢測(cè)[21-23]。

有研究表明亞硫酸根在堿性條件下能夠與孔雀石綠發(fā)生加成反應(yīng)[24-25]，因此，半胱氨酸上的巰基也可與孔雀石綠發(fā)生加成反應(yīng)。通過(guò)探索半胱氨酸-孔雀石綠體系的最佳反應(yīng)條件，建立孔雀石綠單波長(zhǎng)、雙波長(zhǎng)共振光散射光譜法檢測(cè)半胱氨酸的新方法，并應(yīng)用于保健食品L-半胱氨酸護(hù)肝膠囊和醬油中半胱氨酸的定量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-半胱氨酸護(hù)肝膠囊 湖北舒邦藥業(yè)有限公司；醬油為市售海天和李錦記醬油。

L-半胱氨酸（純度≥98.5%）、硼砂、氫氧化鈉國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；孔雀石綠 阿拉丁試劑（上海）有限公司。以上試劑均為分析純，超純水為實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

F-7000型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；BS210S分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；pHS-3C精密酸度計(jì) 上海虹益儀器儀表公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：用超純水將L-半胱氨酸配成0.50 g/L的儲(chǔ)備液，放入冰箱保存。使用時(shí)用超純水稀釋100 倍配制成質(zhì)量濃度為5.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

孔雀石綠溶液：稱取18.2 mg孔雀石綠溶于500 mL超純水中，制備濃度為1.00×10-4mol/L的孔雀石綠溶液。

硼砂-氫氧化鈉緩沖液：用0.05 mol/L硼砂溶液和0.20 mol/L氫氧化鈉溶液混合配制成pH 9.3～10.1的硼砂-氫氧化鈉緩沖液，使用酸度計(jì)測(cè)定其pH值。

待測(cè)溶液：準(zhǔn)確加入適量5.00 mg/L半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、適量1.00×10-4mol/L孔雀石綠溶液、0.5 mL特定pH值的緩沖溶液于10 mL比色管中，用超純水定容并搖勻，得到待測(cè)溶液，反應(yīng)一定時(shí)間后用于共振光散射分析。

空白溶液：不加入半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余制備條件與待測(cè)溶液相同。

1.3.2 共振光散射分析

取適量溶液于1 cm石英比色皿中，調(diào)節(jié)儀器激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)相等，狹縫寬度為5 nm，在200～800 nm內(nèi)掃描測(cè)定待測(cè)溶液和空白溶液得到共振光散射光譜，得到最佳波長(zhǎng)下待測(cè)溶液的共振光散射強(qiáng)度（I）及空白溶液散射強(qiáng)度（I0），計(jì)算共振光散射強(qiáng)度差值（ΔI）：ΔI＝I-I0。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限測(cè)定

取7 支10 mL比色管，分別加入0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL質(zhì)量濃度為5.00 mg/L的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，再向每支加入2.50 mL濃度為1.00×10-4mol/L的孔雀石綠溶液和0.50 mL pH 9.7的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液，用超純水定容并搖勻。反應(yīng)20 min后，取適量溶液進(jìn)行共振光散射分析。分別計(jì)算285、338 nm波長(zhǎng)處以及兩波長(zhǎng)疊加時(shí)的ΔI。以半胱氨酸質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)，ΔI為縱坐標(biāo)，繪制出不同波長(zhǎng)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線：ΔI285-c、ΔI338-c及雙波長(zhǎng)疊加ΔI285+338-c，

1.3.4 干擾實(shí)驗(yàn)

按照上述方法，最佳條件下在體系中加入測(cè)定時(shí)可能存在的共存物質(zhì)（其他氨基酸以及半胱氨酸膠囊中的其他物質(zhì)）考察共存物質(zhì)是否會(huì)干擾雙波長(zhǎng)法的測(cè)定結(jié)果。

1.3.5 回收實(shí)驗(yàn)

按照上述方法，最佳條件下用雙波長(zhǎng)疊加法測(cè)定待測(cè)溶液和空白溶液的共振光散射強(qiáng)度，重復(fù)測(cè)定10 次，以雙波長(zhǎng)回歸方程分析處理數(shù)據(jù)。

1.3.6 實(shí)際樣品測(cè)定

1.3.6.1 護(hù)肝膠囊半胱氨酸含量測(cè)定

隨機(jī)抽取市售的舒邦L-半胱氨酸護(hù)肝膠囊5 粒（半胱氨酸標(biāo)示量為72 mg/粒），將膠囊的內(nèi)容物取出，混合均勻后準(zhǔn)確稱取0.138 9 g（相當(dāng)于半胱氨酸5 mg）倒入250 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻。過(guò)濾后棄去適量初濾液，得到續(xù)濾液。分別移取25.0 mL續(xù)濾液至100 mL容量瓶中，用水定容并搖勻，得到3 組待測(cè)樣品溶液。以靈敏度較高的雙波長(zhǎng)疊加法測(cè)定樣品溶液中半胱氨酸含量，各平行測(cè)定6 次。將本方法測(cè)定結(jié)果與Ni2+分光光度法[11]和碘滴定法[26]進(jìn)行比較。

1.3.6.2 醬油中半胱氨酸含量測(cè)定

選擇超市購(gòu)買的海天和李錦記兩種不同品牌的醬油，級(jí)別均為一級(jí)（氨基酸態(tài)氮≥0.700 g/100 mL）。分別取5.00 mL于50 mL棕色容量瓶中，用超純水定容并搖勻，得到醬油樣品溶液。向2 支10 mL比色管中，分別加入1.00 mL海天和李錦記醬油樣品溶液、2.50 mL 1.00×10-4mol/L的孔雀石綠溶液、0.50 mL pH 9.7硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液，用超純水定容并搖勻。反應(yīng)20 min后進(jìn)行共振光散射光譜分析。以靈敏度較高的雙波長(zhǎng)疊加法測(cè)定樣品溶液中半胱氨酸含量，各平行測(cè)定6 次。將本方法測(cè)定結(jié)果與Ni2+分光光度法[11]和碘滴定法[26]進(jìn)行比較。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用最小二乘法建立回歸方程，使用Excel處理數(shù)據(jù)，使用Origin 9.1、Chemdraw 20.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 共振光散射光譜分析

待測(cè)溶液為1.00 mL 5.00 mg/L半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、2.50 mL 1.00×10-4mol/L孔雀石綠溶液、0.50 mL pH 9.7的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液；空白溶液為2.50 mL 1.00×10-4mol/L孔雀石綠溶液、0.50 mL pH 9.7的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液；反應(yīng)20 min后測(cè)定待測(cè)溶液及空白溶液的共振光散射光譜。如圖1所示，在285、338 nm波長(zhǎng)處有兩個(gè)較強(qiáng)烈的共振光散射峰，表明孔雀石綠在硼砂-氫氧化鈉緩沖液中自身形成超分子聚合物，產(chǎn)生了共振光散射；加入半胱氨酸后，共振光散射更加強(qiáng)烈，這是因?yàn)榘腚装彼崤c孔雀石綠超分子聚合物發(fā)生加成反應(yīng)，形成了體積更大的超分子聚合物。因此，可選擇285 nm或者338 nm單波長(zhǎng)法測(cè)定半胱氨酸含量，也可將兩個(gè)波長(zhǎng)處的共振光散射強(qiáng)度疊加使用雙波長(zhǎng)法測(cè)定半胱氨酸含量。

圖1 待測(cè)溶液及空白溶液的共振光散射光譜Fig. 1 Resonance light scattering spectra of the sample and blank solutions

2.2 半胱氨酸-孔雀石綠體系的反應(yīng)條件優(yōu)化分析

2.2.1 硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液pH值及添加體積對(duì)共振光散射強(qiáng)度的影響

半胱氨酸-孔雀石綠體系為1.00 mL 5.00 mg/L半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和2.00 mL 1.00×10-4mol/L孔雀石綠溶液；緩沖溶液為0.5 mL不同pH值的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液；反應(yīng)時(shí)間為20 min。如圖2所示，在pH 9.7時(shí)，體系的ΔI最大，增加或者減小pH值，ΔI均減小。在pH 9.7條件下，不斷改變硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液的體積，結(jié)果如圖3所示，緩沖溶液的體積對(duì)體系的ΔI影響不大，曲線較平穩(wěn)，當(dāng)緩沖液體積為0.40～0.60 mL時(shí)，ΔI最大且穩(wěn)定。因此，取中間值，選擇0.50 mL pH 9.7的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液。

圖2 不同硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液pH值下體系的ΔIFig. 2 ΔI of the system a a function of pH of borax-sodium hydroxide buffer solution

圖3 不同硼砂-氫氧化鈉緩沖添加溶液體積下體系的ΔIFig. 3 ΔI of the system as a function of volume of borax-sodium hydroxide buffer solution

2.2.2 孔雀石綠溶液添加體積對(duì)共振光散射強(qiáng)度的影響

在最優(yōu)緩沖溶液條件下，使用1.00 mL 5.00 mg/L半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和不同體積（0.50～3.50 mL）1.00×10-4mol/L孔雀石綠溶液；反應(yīng)時(shí)間為20 min。如圖4所示，ΔI隨著孔雀石綠體積增加而增大，在2.50 mL時(shí)體系的ΔI最大，繼續(xù)增加體積ΔI降低。因此，孔雀石綠溶液的最佳添加體積為2.50 mL。

圖4 不同孔雀石綠溶液添加體積下體系的ΔIFig. 4 ΔI of the system as a function of volume of malachite green solution

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)共振光散射強(qiáng)度的影響

在室溫下，在最佳條件下，考察半胱氨酸與孔雀石綠的反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系共振光散射強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ΔI不斷增大，20 min時(shí)達(dá)到最大并在1 h內(nèi)基本不變，說(shuō)明半胱氨酸-孔雀石綠體系在20 min內(nèi)反應(yīng)完全，具有較好的穩(wěn)定性。因此，選擇半胱氨酸-孔雀石綠體系的最佳反應(yīng)時(shí)間為20 min。

2.2.4 試劑加入順序?qū)舱窆馍⑸鋸?qiáng)度的影響

在最佳條件下，對(duì)半胱氨酸-孔雀石綠-緩沖溶液、半胱氨酸-緩沖溶液-孔雀石綠、孔雀石綠-緩沖溶液-半胱氨酸、孔雀石綠-半胱氨酸液-緩沖溶液、緩沖溶液-半胱氨酸-孔雀石綠、緩沖溶液-孔雀石綠-半胱氨酸6種加入順序進(jìn)行比較。結(jié)果表明：試劑的加入順序?qū)和ΔI影響不大。實(shí)驗(yàn)選擇半胱氨酸-孔雀石綠-緩沖溶液順序。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限分析

本方法的線性范圍為0.10～0.60 mg/L，單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)法對(duì)應(yīng)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限如表1所示，雙波長(zhǎng)法的檢出限更低，為0.003 23 mg/L。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)Table 1 Standard curves, correlation coefficients and limits of detection of single-wavelength and dual-wavelength resonance light scattering spectroscopy

2.4 共存物質(zhì)的干擾分析

由表2可知，所測(cè)共存物質(zhì)均對(duì)0.50 mg/L半胱氨酸不造成干擾，相對(duì)誤差在±5%以內(nèi)。因此，本方法具有良好的選擇性。

表2 干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of interference test

2.5 精密度分析

如表3所示，方法的回收率在97.3%～102.0%之間，平均值為99.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.50%。因此，本方法具有良好的精密度。

表3 回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of recovery test

2.6 實(shí)際樣品分析

2.6.1 護(hù)肝膠囊中半胱氨酸含量分析

如表4所示，本方法測(cè)定結(jié)果與Ni2+分光光度法[11]和碘滴定法[26]測(cè)定所得結(jié)果基本一致，且3 組樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，符合定量分析的要求。

表4 護(hù)肝膠囊中半胱氨酸的測(cè)定結(jié)果（n＝6）Table 4 Results of determination of cysteine in hepatoprotective capsules (n = 6)

2.6.2 醬油中半胱氨酸含量分析

由表5可知，本方法測(cè)定結(jié)果與分光光度法[11]和碘滴定法[26]測(cè)定所得結(jié)果基本一致；海天醬油、李錦記醬油中半胱氨酸的質(zhì)量濃度分別為0.288 mg/L和0.257 mg/L，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在3%以內(nèi)，符合定量分析的要求。

表5 醬油樣品中半胱氨酸的測(cè)定結(jié)果（n＝6）Table 5 Results of determination of cysteine in soy sauce (n = 6)

3 討 論

圖5 半胱氨酸-孔雀石綠加成反應(yīng)機(jī)理Fig. 5 Mechanism of cysteine-malachite green addition reaction

圖6 超分子結(jié)構(gòu)式Fig. 6 Supramolecular structural formula

最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，半胱氨酸與孔雀石綠物質(zhì)的量比為1∶6。文獻(xiàn)[24-25]報(bào)道了亞硫酸根在堿性條件下與三苯甲烷類染料孔雀石綠的加成反應(yīng)，是因?yàn)閬喠蛩岣狭蛟泳哂幸粚?duì)孤對(duì)電子才能與孔雀石綠發(fā)生加成反應(yīng)。同樣，半胱氨酸分子上巰基硫原子具有兩對(duì)孤對(duì)電子，按照類比思維，半胱氨酸的巰基硫原子同樣可以與孔雀石綠發(fā)生加成反應(yīng)，生成具有3 個(gè)獨(dú)立苯環(huán)的硫醚衍生物1，反應(yīng)機(jī)理見(jiàn)圖5。在硼砂-氫氧化鈉緩沖介質(zhì)中，3 個(gè)孔雀石綠分子與1 個(gè)硼酸分子上的3 個(gè)羥基分別通過(guò)分子間氫鍵形成超分子2（圖6），引起共振光散射現(xiàn)象，體系在波長(zhǎng)285 nm和338 nm處形成兩個(gè)較強(qiáng)烈的共振光散射峰。當(dāng)體系中加入半胱氨酸后，半胱氨酸首先與孔雀石綠發(fā)生加成反應(yīng)形成加成反應(yīng)產(chǎn)物1；加成產(chǎn)物1上的兩個(gè)叔胺氮原子和1 個(gè)伯氨氮原子分別與3 個(gè)孔雀石綠陽(yáng)離子形成n→π型電荷轉(zhuǎn)移配合物，加成產(chǎn)物1上的1 個(gè)孤立苯環(huán)與1 個(gè)孔雀石綠陽(yáng)離子形成π→π型電荷轉(zhuǎn)移配合物，加成產(chǎn)物1上的羧酸根陰離子與1 個(gè)孔雀石綠陽(yáng)離子通過(guò)靜電引力作用形成離子締合物，這樣1 個(gè)半胱氨酸與6 個(gè)孔雀石綠陽(yáng)離子反應(yīng)形成體積更大的超分子3，導(dǎo)致體系的共振光散射強(qiáng)度更強(qiáng)；且ΔI與半胱氨酸質(zhì)量濃度之間呈線性關(guān)系，據(jù)此建立孔雀石綠共振光散射光譜法測(cè)定半胱氨酸含量。

4 結(jié) 論

依據(jù)半胱氨酸與孔雀石綠在堿性條件下發(fā)生加成反應(yīng)、加成產(chǎn)物與孔雀石綠進(jìn)一步的離子締合反應(yīng)和電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)形成的超分子具有更強(qiáng)烈的共振光散射現(xiàn)象，建立了孔雀石綠共振光散射光譜測(cè)定半胱氨酸含量的新方法。建立的單波長(zhǎng)共振光散射法和雙波長(zhǎng)疊加共振光散射法均具有較高的靈敏度和專屬性，且省時(shí)高效、成本低廉，均符合食品中半胱氨酸定量分析的要求，其中雙波長(zhǎng)疊加共振光散射法比單波長(zhǎng)共振光散射法更靈敏。