劉 學，盧海強，王玉印，田洪濤，谷新晰

（河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000）

β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）是一類水解甘露聚糖中β-1,4-D-吡喃甘露糖苷鍵的內(nèi)切酶[1]，在食品、養(yǎng)殖業(yè)、造紙、生物燃料等領(lǐng)域應用廣泛[2]。甘露聚糖酶主要來自細菌[3]、真菌[4]及放線菌等微生物[5-6]，依據(jù)氨基酸序列和結(jié)構(gòu)差異可分為4 類，即GH5、GH26、GH113和GH134家族。目前GH5家族甘露聚糖酶的研究報道較多，是主要的商業(yè)用酶。2015年，GH134家族甘露聚糖酶首次在構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中獲得[7]，是分子質(zhì)量最小的一類甘露聚糖酶。研究表明GH5、GH26和GH113家族的甘露聚糖酶有較大相似性，同屬于GH-A超家族，具有典型的(β/α)8-磷酸丙糖異構(gòu)酶（triosephoaphate isomerase，TIM）桶狀結(jié)構(gòu)并遵循異頭碳構(gòu)象保留型催化機制，而GH134家族甘露聚糖酶則表現(xiàn)出明顯差異，顯示出類似溶菌酶的折疊并采用異頭碳反轉(zhuǎn)型催化機制[8-9]。探究不同家族酶的性質(zhì)差異可為甘露聚糖酶的具體應用提供借鑒，如Freiesleben等[10]表征了真菌來源的GH5和GH26家族甘露聚糖酶的性質(zhì)，表明GH26家族甘露聚糖酶的最適pH值在5～7范圍內(nèi)，最適反應溫度在50～68 ℃之間，而GH5家族甘露聚糖酶的最適pH值為3～6，最適反應溫度為78～87 ℃，且與GH26家族的甘露聚糖酶相比，其熱穩(wěn)定性強；此外在降解甘露聚糖的過程中，發(fā)現(xiàn)GH5家族甘露聚糖酶的初始速率均低于GH26家族的甘露聚糖酶，但兩個家族酶的底物特異性沒有顯示出明顯差異。Tailford等[11]發(fā)現(xiàn)，來自芽孢桿菌（Bacillus）的GH5和GH26家族甘露聚糖酶的亞位點對底物所含糖單元的識別與催化有嚴格特異性，其中來自瓊脂芽孢桿菌（Bacillus agaradhaerens）的BaMan5A在其－2和+1亞位點可容納葡萄糖或甘露糖，而來自枯草芽孢桿菌（B. subtilis）的BsMan26A在其負結(jié)合位點對甘露糖有嚴格的特異性。然而，作為結(jié)構(gòu)和催化機制存在巨大差異的GH5和GH134家族β-甘露聚糖酶的差異分析鮮有報道。

多糖結(jié)構(gòu)復雜，分子質(zhì)量大、黏度高、水解困難，其完全降解需要多個酶的協(xié)同作用。對于甘露聚糖酶，已發(fā)現(xiàn)存在同質(zhì)協(xié)同和異質(zhì)協(xié)同兩種協(xié)同水解方法[12]。其中同質(zhì)協(xié)同是兩種主鏈切割酶（如甘露聚糖酶、甘露糖苷酶）或兩種側(cè)鏈切割酶（如乳糖苷酶、乙酰甘露聚糖酯酶）之間的協(xié)同作用，異質(zhì)協(xié)同則是一個主鏈切割酶和一個側(cè)鏈切割酶（如甘露聚糖酶和半乳糖苷酶）之間的協(xié)同作用[13-14]。Han Yejun等[15]研究表明細菌Caldanaerobius polysaccharolyticus來源的Man5A-TM1和Man5A-TM2對β-甘露聚糖和瓜爾豆膠的降解有協(xié)同作用，Man5A-TM1和Man5B對β-甘露聚糖和羧甲基纖維素的降解有協(xié)同作用，還原糖含量增加。Chen Xi等[3]發(fā)現(xiàn)Bacillus來源的BaMan5A與商業(yè)α-半乳糖苷酶水解半乳甘露聚糖時顯示有協(xié)同作用，最大協(xié)同系數(shù)可達1.58。因此采用復合甘露聚糖酶協(xié)同降解多糖，對提高多糖的水解效率有重要意義。

本研究擬從煙曲霉（A. fumigatus）HBHF5和微孢根霉（Rhizopus microsporus）GZHF10中克隆表征GH5和GH134家族甘露聚糖酶（AfMan5A和RmMan134C），探究兩者在酶結(jié)構(gòu)、酶學特性、底物特異性和底物親和力方面的差異，并開展酶協(xié)同降解多糖的研究，旨在為GH5和GH134家族甘露聚糖酶的高效催化提供一定理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株A. fumigatusHBHF5、R. microsporusGZHF10、畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115、質(zhì)粒pET30a（+）和pPIC9K由本課題組篩選并保存[16]；感受態(tài)大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、E. coliBL21（DE3） 北京博邁德基因技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒 美基生物科技有限公司；Taq酶、限制性內(nèi)切酶 日本TaKaRa公司；His標簽蛋白純化試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司；魔芋粉、刺槐豆膠、瓜爾豆膠、角豆膠、殼聚糖 源葉生物有限公司；微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、果膠、甘露糖 北京索萊寶科技有限公司；皂角米多糖由本實驗室提取并保存；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

誘導培養(yǎng)基：0.5% (NH4)2SO4、0.1% KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、0.001% FeSO4·7H2O、0.02% CaCl2、0.3%酵母浸粉、0.3%魔芋粉；BMGY/BMMY培養(yǎng)基：1%酵母浸粉、2%蛋白胨、1.34%無氨基酸酵母氮源（含硫酸銨）、4×10－5%生物素、1%甘油、0.5%甲醇；LB培養(yǎng)基：0.5%酵母浸粉、1%胰蛋白胨、1%氯化鈉，固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

T100TM聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司；SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱 上海博遠實業(yè)有限公司；ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；Universal 320高速冷凍離心機 德國Hettich公司；SCIENTZ-IID超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾儀器廠；TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；DW-86L388J超低溫冰箱 海爾智家股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學分析

使用MEGA7.0軟件對AfMan5A（AFUA_7G01070）、RmMan134C（ORE23177.1）及其他GH5、GH26、GH113和GH134家族β-甘露聚糖酶的蛋白序列進行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[17-18]。采用軟件ProtParam（https://www.expasy.org/resources/protparam）分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，PredictProtein（https://predictprotein.org/）分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。選擇與AfMan5A序列一致性為70.35%的晶體結(jié)構(gòu)（PDB:3wh9）和與RmMan134C（PDB:5xxa）序列一致性為77.78%的晶體結(jié)構(gòu)為模板，使用SWISSSMODEL軟件模擬構(gòu)建蛋白結(jié)構(gòu)，使用The ConSurf Server（https://consurf.tau.ac.il/）分析蛋白保守序列，并通過軟件Pymol進行蛋白保守序列的可視化分析，氨基酸殘基以梯度著色。

1.3.2 重組甘露聚糖酶基因的克隆與載體構(gòu)建

菌株A. fumigatusHBHF5和R. microsporusGZHF10分別接種至誘導培養(yǎng)基中，45 ℃培養(yǎng)3 d，離心收集菌體備用。采用RNA提取試劑盒提取總RNA，－80 ℃保存?zhèn)溆?。利用引物進行PCR擴增獲得AfMan5A和RmMan134C基因，并將獲得的基因分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-AfMan5A和pET30a-RmMan134C。引物AfMan5APF（GGGGAATTCCCCAGCGCAAAGAAATTCG）、AfMan5A-PR（GAATGCGGCCGCCTAAA CCCACCCCTGCTTC）、RmMan134C-PF（GGGGAATTCAGGCCCGGCGATAGAGGCC）、RmMan134C-PR（GAATGCGGCCGCTTAAATAGCGGTAA CGTCGACCCAG），由金唯智生物科技有限公司合成。

1.3.3 重組甘露聚糖酶酶液的制備及純化

質(zhì)粒pPIC9K-AfMan5A經(jīng)限制性內(nèi)切酶BglII線性化，并經(jīng)純化后電轉(zhuǎn)化至GS115感受態(tài)細胞，質(zhì)粒pET30a-RmMan134C熱激轉(zhuǎn)化至E. coliBL21（DE3）。分別參照酵母表達手冊和pET系統(tǒng)手冊篩選陽性轉(zhuǎn)化子。AfMan5A的陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng) BMGY培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)48 h后，菌泥重懸于50 mL BMMY培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，并加入甲醇進行誘導，保持甲醇終體積分數(shù)為0.5%。RmMan134C的陽性轉(zhuǎn)化子接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，直至OD600nm為0.5～0.8時，加入1/1 000的1 mol/L異丙基硫代半乳糖苷，進行誘導表達。

采用His標簽蛋白純化試劑盒純化蛋白，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進行結(jié)果分析。

1.3.4AfMan5A和RmMan134C酶活力測定

參考Miller[19]的方法，采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定甘露聚糖酶酶活力。將100 μL適當稀釋的酶液加入到900 μL的0.25%魔芋底物溶液中，搖勻后50 ℃水浴20 min，加入1.5 mL的DNS試劑終止反應，煮沸5 min后冷卻至室溫，在540 nm波長處測定OD值。酶活力單位（U）：該反應條件下，每分鐘生成1 μmol甘露糖所需的酶量。

1.3.5 溫度和pH值對酶活力的影響

在10、20、30、40、50、60、70、80、90 ℃和100 ℃條件下測定重組酶的最適反應溫度，以最高酶活力為100%，計算不同溫度下的相對酶活力。在50 ℃下處理AfMan5A和RmMan134C的酶液0～60 min，按標準方法測定酶活力，分析其熱穩(wěn)定性。以未經(jīng)處理的酶溶液作對照，其酶活力定為100%。

用100 mmol/L的pH 2～3甘氨酸-鹽酸緩沖液、pH 3～8檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液和pH 8～12甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液溶解的底物，按標準方法測定AfMan5A和RmMan134C酶活力，以最高酶活力為100%，計算不同pH值下的相對酶活力。使用上述緩沖液適當稀釋酶液，于0 ℃處理酶液1 h，按標準方法測定酶活力，分析其pH值穩(wěn)定性。以最適pH值處理的酶溶液作對照，其酶活力定為100%。

1.3.6 金屬離子對酶活力的影響

分析金屬離子（Mg2+，Ca2+，F(xiàn)e3+，Cu2+，Zn2+，Li+，Na+，K+，Mn2+）對酶活力的影響。在標準酶活力反應體系中，加入金屬離子，使其終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L，以未處理為對照組，其酶活力定為100%，計算不同金屬離子處理酶溶液的相對酶活力。

1.3.7AfMan5A和RmMan134C的蛋白含量測定

參照Bradford[20]方法，以牛血清蛋白為標準，用考馬斯亮藍法測定酶液的蛋白含量。

1.3.8AfMan5A和RmMan134C底物譜和底物親和力的差異分析

以蛋白質(zhì)量濃度為（1±0.04）mg/mL的酶液進行底物譜和底物親和力分析。用pH 5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制1.25 g/L的魔芋粉、皂角米多糖、刺槐豆膠、瓜爾豆膠、角豆膠、羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、殼聚糖和果膠底物，按照標準方法，分別在最適反應溫度條件下測定酶活力，分析底物特異性。

取底物溶液4 mL，加入2 mL蛋白質(zhì)量濃度為（1±0.04）mg/mL的酶液，于4 ℃、25 r/min條件下混勻8 h，12 000 r/min離心5 min取上清液，以1.25 g/L的魔芋粉為底物，未與底物結(jié)合酶液的酶活力定為100%，在最適反應條件下測定它和上清液的酶活力，計算兩者差值，分析底物結(jié)合的親和力[21]。

1.3.9AfMan5A和RmMan134C的協(xié)同酶解多糖分析

取1.3.8節(jié)配制好的底物溶液，按照標準方法，將相同蛋白質(zhì)量濃度（（1±0.04）mg/mL）的酶液在各自最適反應溫度下反應，中途煮沸20 min滅活酶液，對照組為單個酶液反應，并添加100 μL蒸餾水代替酶液。測定AfMan5A和RmMan134C三種協(xié)同反應，包括兩者同時反應、AfMan5A先反應和RmMan134C先反應。以甘露糖標準曲線計算對照組和雙酶協(xié)同組的還原糖含量，以協(xié)同系數(shù)判定AfMan5A和RmMan134C的協(xié)同降解作用。協(xié)同系數(shù)為協(xié)同組的還原糖含量值與對照組還原糖含量相加值的比值，協(xié)同系數(shù)小于1說明無協(xié)同作用，大于1有協(xié)同作用，且隨著比值的增加，協(xié)同作用顯著[22]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個實驗重復3 次，使用GraphPad Prism 8.0.1、Excel 2010和SPSS Statistics 17.0對數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果以進行評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 AfMan5A和RmMan134C的生物信息學分析及表達

由4 個家族甘露聚酶的進化樹結(jié)果可知（圖1），甘露聚糖酶按照家族各自構(gòu)成一個分支，同時發(fā)現(xiàn)，GH134家族甘露聚糖酶與其他3 個家族的β-甘露聚糖酶相比，親緣關(guān)系較遠。這與GH5、GH26和GH113家族的β-甘露聚糖酶屬于同一超級家族（GH-A）有關(guān)，都遵循保留型催化機制，而GH134家族甘露聚糖酶則采用異頭碳反轉(zhuǎn)型催化機制。

圖1 GH5和GH134家族β-甘露聚糖酶的系統(tǒng)進化樹及結(jié)構(gòu)分析Fig. 1 Phylogenetic tree and structure analysis of β-mannanase from the GH5 and GH134 families

經(jīng)同源建模分析AfMan5A由8 個α-螺旋及8 個β-折疊交替排列形成了TIM桶狀結(jié)構(gòu)，排列在一起的8 個β-折疊片段形成桶狀內(nèi)部凹槽結(jié)構(gòu)，與之相連接的α-螺旋則組成桶的外沿，其中有54.96%的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)、31.1%的α-螺旋結(jié)構(gòu)、13.94%的β-折疊結(jié)構(gòu)。并由8 個保守氨基酸殘基構(gòu)成了該桶狀的活性口袋，分別是R76、H124、N191、E192、H265、Y267、E300及W330，其中第4個及第7個β-折疊的C末端是2 個高度保守的谷氨酸殘基（E192和E300），是β-甘露聚糖酶的親核催化及酸堿催化位點[23-24]。RmMan134C由9 個α-螺旋及2 個反向平行的β-折疊組成，其中無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)占65.03%、α-螺旋結(jié)構(gòu)占27.32%、β-折疊結(jié)構(gòu)占7.65%。分析RmMan134C的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)E55和D67是其活性催化位點，此外173～183位的氨基酸（DTRFWVDVTAI）組成了RmMan134C最短的保守區(qū)，且該區(qū)域相對而言最為保守，主要是β-折疊片結(jié)構(gòu)，推測可為RmMan134C的蛋白分子機構(gòu)穩(wěn)定提供保障。

甘露聚糖酶AfMan5A基因全長1 119 bp，編碼373 個氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為41.31 kDa，含28 個堿性氨基酸和38 個酸性氨基酸，等電點為5.52，不穩(wěn)定系數(shù)為16.54。RmMan134C基因由549 bp堿基組成，編碼183 個氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為20.71 kDa，含21 個堿性氨基酸和21 個酸性氨基酸，等電點為6.91，不穩(wěn)定系數(shù)為26.39。圖2為AfMan5A和RmMan134C的蛋白電泳圖，其分子大小均大于理論值，推測是由于具有糖基化位點[25]和N端的His標簽引起[26]，仍需進一步研究。

圖2 重組酶AfMan5A和RmMan134C的SDS-PAGE圖Fig. 2 SDS-PAGE pattern of recombinant AfMan5A and RmMan134C

2.2 AfMan5A和RmMan134C的酶學性質(zhì)差異

2.2.1 溫度和pH值對酶活力的影響

如圖3所示，AfMan5A的最適溫度和最適pH值為60 ℃和6.0，RmMan134C的最適溫度和最適pH值為35 ℃和5.0。AfMan5A在50 ℃熱處理1 h后，可保持（90.0±2.7）%的殘余酶活力，RmMan134C在50 ℃熱處理1 h后，可保持（13.2±2.6）%的殘余酶活力。pH值穩(wěn)定性結(jié)果顯示，AfMan5A在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)，酶活力較穩(wěn)定，顯示出80%以上的殘余酶活力，RmMan134C在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)，酶活力較穩(wěn)定，顯示出60%以上的殘余酶活力。結(jié)果表明，AfMan5A屬于高溫酶，RmMan134C屬于中溫酶，熱處理結(jié)果顯示，較高的溫度條件下，AfMan5A的熱穩(wěn)定性優(yōu)于RmMan134C。pH值測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者均為偏酸性酶，在酸性和中性pH值范圍內(nèi)均有較好的耐受性。

圖3 重組酶AfMan5A和RmMan134C的最適溫度（A）、溫度穩(wěn)定性（B）、最適pH值（C）及pH值穩(wěn)定性（D）Fig. 3 Optimum temperature (A), temperature stability (B), optimum pH (C) and pH stability (D) of recombinant AfMan5A and RmMan134C

2.2.2 金屬離子對酶活力的影響

通過分析不同金屬離子對AfMan5A和RmMan134C酶活性的影響（表1），發(fā)現(xiàn)金屬離子Cu2+、Zn2+、Mn2+均可抑制兩個酶的酶活力，且Cu2+和Mn2+的抑制作用比Zn2+強，但對兩個酶的抑制程度有差別，5 mmol/L的Cu2+、Zn2+和Mn2+對AfMan5A的抑制率為53.2%、21.2%和86.6%，對RmMan134C的抑制率為16.5%、7.6%和70.8%。根據(jù)顯著性分析結(jié)果，Mg2+、Ca2+、Fe3+、Li+、Na+、K+可提高AfMan5A的酶活性，其中Ca2+的促進效果最為明顯，可提高175%的酶活力，而這些金屬離子除Fe3+、5 mmol/L的Mg2+和Li+對RmMan134C酶活性有輕微抑制作用外，其余的金屬離子對RmMan134C酶活力影響不大。數(shù)據(jù)表明，AfMan5A和RmMan134C對金屬離子耐受性較好。

表1 金屬離子對AfMan5A和RmMan134C相對酶活力的影響Table 1 Effects of metal ions on the activity of AfMan5A and RmMan134C%

2.3 酶的底物特異性及親和力分析

甘露聚糖酶AfMan5A和RmMan134C對多種底物均表現(xiàn)出一定的水解活性，結(jié)果如表2所示。AfMan5A對甘露聚糖底物的特異性強，可水解魔芋葡甘露聚糖及皂角米、刺槐豆膠、瓜爾豆膠和角豆膠來源的半乳甘露聚糖，對纖維素和醛酸類底物沒有顯示出降解能力。RmMan134C較AfMan5A具有更寬的底物譜，對甘露聚糖、纖維素和醛酸類底物均顯示出降解活性，最適底物為魔芋葡甘露聚糖，這一結(jié)果與微孢根霉來源的RmMan134A不同，它對刺槐豆膠（100%）有高酶活性，其次是魔芋（39.4%）和瓜爾豆膠（21.9%）[27]。

表2 重組酶AfMan5A和RmMan134C的底物特異性和親和力分析Table 2 Substrate specificity and affinity analysis of AfMan5A and RmMan134C

一般來說，酶的水解速率和酶與底物的吸附能力有關(guān)，酶與底物親和力越大，酶催化效率越高，因此，分析酶的底物親和力可能會對酶與底物結(jié)合機制及在底物降解過程中與其他酶協(xié)同作用提供新的見解。由表2可知，AfMan5A對角豆膠的親和力最小，RmMan134C對刺槐豆膠的親和力最小，但均對魔芋葡甘露聚糖顯示出最高的親和力，這與魔芋葡甘露聚糖是AfMan5A和RmMan134C的最適底物結(jié)果一致。其中米曲霉來源的AoMan134A[28]酶解魔芋粉（kcat/Km=564 mL/（s·mg））時的動力學參數(shù)大于刺槐豆膠（kcat/Km=527 mL/（s·mg））和瓜爾豆膠（kcat/Km=77 mL/（s·mg）），也表現(xiàn)出相同結(jié)果。此外AfMan5A和RmMan134C對羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、殼聚糖的親和力相近，但AfMan5A對皂角米多糖、刺槐豆膠、瓜爾豆膠和果膠的親和力大于RmMan134C。

2.4 AfMan5A和RmMan134C的協(xié)同酶解

由圖4可知，AfMan5A和RmMan134C同時降解魔芋粉、皂角米多糖、刺槐豆膠、瓜爾豆膠和角豆膠底物，協(xié)同系數(shù)均小于1，顯示無協(xié)同效果。而進一步探究AfMan5A和RmMan134C反應的先后順序?qū)f(xié)同作用的影響，結(jié)果顯示AfMan5A和RmMan134C按不同的先后順序反應時，協(xié)同組的還原糖含量仍小于對照組還原糖含量相加值，因此，結(jié)果表明AfMan5A和RmMan134C對甘露聚糖類底物無協(xié)同作用。以羧甲基纖維素鈉或殼聚糖為底物時，發(fā)現(xiàn)AfMan5A先反應時顯示有協(xié)同效果，協(xié)同系數(shù)分別為1.29和4.19。在降解微晶纖維素底物時，AfMan5A先反應或后反應，結(jié)果均顯示有協(xié)同作用，協(xié)同系數(shù)為分別為6.10和1.14，且AfMan5A先反應時，與其他底物的降解效果相比，其還原糖含量值最高，協(xié)同效果最顯著。結(jié)果表明，AfMan5A和RmMan134C對甘露聚糖類底物無協(xié)同作用，對纖維素類底物有協(xié)同作用，且協(xié)同效果與酶液反應的先后順序有關(guān)。因此對于纖維素類底物的降解，AfMan5A和RmMan134C可作為新的酶制劑選擇，高效應用于實際生產(chǎn)。

圖4 AfMan5A和RmMan134C對多糖的協(xié)同酶解作用Fig. 4 Synergistic hydrolysis of AfMan5A and RmMan134C on polysaccharides

3 討 論

GH5家族的β-甘露聚糖酶分子質(zhì)量在30～70 kDa之間，具有典型的(β/α)8-TIM桶狀結(jié)構(gòu)，催化機制為保留型。與AfMan5A相比，來源于黑曲霉（A. niger）AEY76082.1、宇佐美曲霉（A. usamii）ADZ99027.1和硫色曲霉（A. sulphureus）ABC59553.1的甘露聚糖酶α-螺旋結(jié)構(gòu)占31.85%、33.94%和31.07%，β-折疊結(jié)構(gòu)占19.06%、18.80%和20.63%，且等電點為4.45、4.38和4.19，均屬于酸性蛋白質(zhì)。目前已報道的4 個GH134家族的β-甘露聚糖酶分子質(zhì)量小，為20 kDa左右，催化機制為反轉(zhuǎn)型，與GH5家族相比差異顯著。分析蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，來自于構(gòu)巢曲霉（A. nidulans）AnMan134A[7]、米曲霉（A. oryzae）AoMan134A[28]、鏈霉菌屬（Streptomycessp.）SsGH134[5]和RmMan134A[27]的甘露聚糖酶α-螺旋結(jié)構(gòu)與β-折疊結(jié)構(gòu)的占比差異較大，其中AoMan134A的α-螺旋結(jié)構(gòu)（46.33%）與β-折疊結(jié)構(gòu)的占比（8.47%）相差最大，為37.86%，同時AoMan134A的α-螺旋結(jié)構(gòu)占比也最大。此外，GH134家族的β-甘露聚糖酶等電點在5.5～7.5之間，與GH5家族的β-甘露聚糖酶相比也具有較明顯差異。His標簽分子質(zhì)量低，其中His中的咪唑環(huán)可與金屬離子如Ni2+、Zn2+等特異性結(jié)合，被廣泛應用于蛋白質(zhì)的純化，但也會破壞蛋白質(zhì)構(gòu)象，降低酶的活性和穩(wěn)定性[29]。Halliwell等[30]將His標簽融合到嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilus）L-乳酸脫氫酶的N端或C端，結(jié)果表明與野生型和N-末端標記的酶相比，C-末端標記的酶顯示出較低的活性。而Esen等[31]構(gòu)建了N端和C端His標記的嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum）的甲酸脫氫酶（CtFDH），發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的溶解度不受標簽位置的影響，但與N-CtFDH相比，C-CtFDH 的比活性高約3 倍，催化效率高2 倍。因此關(guān)于His標簽對AfMan5A和RmMan134C酶活力的影響仍需進一步研究。

大量研究指出微生物來源的β-甘露聚糖酶最適溫度在40～60 ℃之間，且一般來源于嗜熱微生物的酶最適反應溫度較高，如來源于A. nigerManBK[32]、藍狀菌（Talaromyces leycettanus）Man5A[33]、小巢狀曲霉（A. nidulans）Man5XZ7[34]的GH5家族嗜熱β-甘露聚糖酶的最適溫度分別為80、90、80 ℃。然而本研究的RmMan134C與這些嗜熱菌來源酶有很大不同，其最適溫度為35 ℃，屬于低溫酶，這可能與RmMan134C的氨基酸組成和蛋白結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且RmMan134C最適溫度與其他報道的GH134家族β-甘露聚糖酶相近，如AnMan134A、AoMan134A、SsGH134和RmMan134A的最適溫度分別為30、30、40、50 ℃。比較酶的最適反應pH值，發(fā)現(xiàn)不同來源的β-甘露聚糖酶pH值差異也較大，一般真菌來源的酶最適反應pH值偏酸性，細菌來源的酶最適反應pH值偏堿性或中性，測定結(jié)果表明，AfMan5A和RmMan134C的最適反應pH值分別為6.0和5.0，無較大差異，且與多數(shù)真菌來源的酶最適pH值相似。值得注意的是，在降解魔芋葡甘露聚糖底物時，發(fā)現(xiàn)RmMan134C的比活力（0.31 U/mg）大于AfMan5A（0.21 U/mg），因此，相比于GH5家族的甘露聚糖酶，GH134家族甘露聚糖酶的催化能力更為明顯。

與多糖相比，寡糖分子質(zhì)量低，黏度低、生物活性高。目前酶解法因特異性強、條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點，已成為制備寡糖的首選方法[35]。此外，由于多糖結(jié)構(gòu)復雜，難降解，因此采用復合酶協(xié)同降解多糖來制備寡糖是有必要的，可增強酶解效率和寡糖制備率[36]。本實驗以AfMan5A和RmMan134C為研究對象，探討了兩個酶的不同加樣順序?qū)Χ嗵堑膮f(xié)同降解效果。結(jié)果表明，AfMan5A和RmMan134C對甘露聚糖類底物無協(xié)同作用，對纖維素類底物有協(xié)同作用，且酶液反應的順序不同其協(xié)同效果也不同，在酶解羧甲基纖維素鈉和殼聚糖時，AfMan5A先反應時具有協(xié)同作用，協(xié)同系數(shù)分別為1.29和4.19，酶解微晶纖維素時，AfMan5A先反應和后反應均有協(xié)同效果，其中AfMan5A先反應時的協(xié)同效果最大，協(xié)同系數(shù)為6.10，這可能是由于多糖結(jié)構(gòu)差異和酶的復雜性導致產(chǎn)生了不同的協(xié)同效果。

4 結(jié) 論

本研究成功從A. fumigatusHBHF5和R. microsporusGZHF10中獲得GH5和GH134家族的β-甘露聚糖酶，發(fā)現(xiàn)兩個酶的三維結(jié)構(gòu)差異明顯。甘露聚糖酶AfMan5A和RmMan134C的最適溫度分別為60 ℃和35 ℃，也相差較大，此外金屬離子對AfMan5A酶活性的影響效果明顯。底物特異性和親和力實驗結(jié)果表明，兩個酶的最適底物均為魔芋葡甘露聚糖，且均對魔芋葡甘露聚糖有最高親和力，但AfMan5A對皂角米多糖、刺槐豆膠、瓜爾豆膠和果膠的親和力大于RmMan134C。兩個酶協(xié)同降解多糖時，發(fā)現(xiàn)對微晶纖維素、殼聚糖和羧甲基纖維素鈉均顯示出一定的協(xié)同作用，其中對微晶纖維素的協(xié)同效果最好。本研究分析了GH5和GH134家族AfMan5A和RmMan134C的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，以及二者協(xié)同降解多糖的能力，為β-甘露聚糖酶的實際應用提供數(shù)據(jù)支持。