譚繼恩，姚 瑤，吳 娜，徐明生，趙 燕，劉會(huì)平，涂勇剛,*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制工程實(shí)驗(yàn)室，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

蛋清是食品工業(yè)的重要營(yíng)養(yǎng)資源和寶貴成分，其主要由水（88%）和蛋白質(zhì)（11%）組成。卵白蛋白是蛋清主要蛋白質(zhì)，約占蛋清總蛋白質(zhì)的54%[1]。卵白蛋白在蛋清的功能特性如凝膠性、起泡性及乳化性中起重要作用[2]。卵白蛋白由385 個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量約為45 kDa，等電點(diǎn)（pI）為4.5[3]。卵白蛋白是一種單聚糖蛋白，在其第292位的天冬酰胺（Asn）結(jié)合了一個(gè)單一碳水化合物[4]。在卵白蛋白核心內(nèi)部有4 個(gè)游離硫醇基團(tuán)，在第73位和第120位的半胱氨酸（Cys）之間存在1 個(gè)二硫鍵。

前期實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)當(dāng)腌制過(guò)程中溫差較大時(shí)，或在低溫貯藏過(guò)程中皮蛋蛋白會(huì)出現(xiàn)返色現(xiàn)象，這說(shuō)明溫度對(duì)皮蛋蛋白色澤具有重大影響。且在前期研究中，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了由蛋清和NaOH組成的模型，發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)抑制劑的添加可以抑制模型色澤的形成；并基于此模型對(duì)禽蛋蛋清和脫糖蛋清進(jìn)行堿誘導(dǎo)處理，發(fā)現(xiàn)蛋清在脫糖前后的色澤存在顯著差異?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，認(rèn)為皮蛋蛋白色澤主要是由強(qiáng)堿誘導(dǎo)的美拉德反應(yīng)導(dǎo)致，此推測(cè)與皮蛋色澤相關(guān)的報(bào)道一致[5-7]。由于卵白蛋白是蛋清中含量最多的蛋白質(zhì)，且前期實(shí)驗(yàn)室對(duì)蛋清凝膠的研究表明卵白蛋白對(duì)強(qiáng)堿誘導(dǎo)的蛋清凝膠的形成具有很大的貢獻(xiàn)作用[8]?；诖?，認(rèn)為卵白蛋白在皮蛋腌制過(guò)程中對(duì)皮蛋蛋白色澤的形成也可能起很大作用，為了探討皮蛋蛋白色澤是否主要由卵白蛋白在堿作用下與糖發(fā)生美拉德反應(yīng)造成，通過(guò)構(gòu)建卵白蛋白-葡萄糖的體外模型探討溫度對(duì)其色澤等的影響。蛋清除了含有大量蛋白質(zhì)，還含有一定量還原糖，其還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%[9]。蛋清中卵白蛋白-還原糖質(zhì)量比大致為15∶1，因此本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的模型中卵白蛋白-葡萄糖質(zhì)量比為15∶1。

美拉德反應(yīng)，又稱(chēng)非酶褐變反應(yīng)，是指在食品熱處理或儲(chǔ)存過(guò)程中含羰基化合物（如還原糖）與含氨基化合物（如氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等）通過(guò)縮合、聚合而生成類(lèi)黑精的反應(yīng)[10]。在美拉德反應(yīng)期間會(huì)產(chǎn)生很多不同種類(lèi)的早期、中間及晚期產(chǎn)物，它們統(tǒng)稱(chēng)為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard reaction products，MRPs）。美拉德反應(yīng)受許多因素影響，如溫度、pH值、水分活度、反應(yīng)物的類(lèi)型及反應(yīng)時(shí)間等[11]。許多研究表明MRPs具有抗氧化活性，其展現(xiàn)抗氧化活性的機(jī)制包括破壞自由基鏈、螯合過(guò)渡金屬，分解過(guò)氧化氫和清除活性氧等[10,12]。因此本研究測(cè)定卵白蛋白-葡萄糖體系在堿作用后的抗氧化活性，以期開(kāi)發(fā)一種應(yīng)用在食品工業(yè)中的天然抗氧化劑。

幾十年來(lái)，對(duì)美拉德反應(yīng)的研究都集中在熱誘導(dǎo)和微波誘導(dǎo)，而對(duì)堿誘導(dǎo)美拉德反應(yīng)的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)將卵白蛋白-葡萄糖混合液與2 g/100 mL NaOH溶液混合后放置在不同溫度（4、25、37 ℃）孵育不同時(shí)間（1、3、5、7 d）。由于皮蛋的低溫貯藏溫度為4 ℃，腌制溫度為25 ℃，且蛋清蛋白在過(guò)高的溫度下會(huì)發(fā)生熱變性，因此選擇4、25、37 ℃作為考察溫度。通過(guò)顏色、褐變強(qiáng)度、熒光強(qiáng)度和pH值等的變化評(píng)估體系理化特性的變化，通過(guò)還原力，2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基清除活性及Fe2+螯合活性評(píng)估體系抗氧化活性的變化。本研究將對(duì)皮蛋蛋白色澤形成規(guī)律有更深入的了解，豐富美拉德反應(yīng)的理論體系，且有助于開(kāi)發(fā)一種應(yīng)用在食品工業(yè)中的天然抗氧化劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵白蛋白、ABTS 美國(guó)Sigma公司；葡萄糖、氫氧化鈉（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；溴化鉀（光譜純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

色差儀 美國(guó)亨特工程公司；Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 賽默飛世爾科技公司；垂直電泳儀 美國(guó)伯樂(lè)公司；氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立有限公司；多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；UV-5200PC紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 元析儀器（上海）有限公司；970CRT熒光分光光度計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 反應(yīng)液的制備

將卵白蛋白與葡萄糖用超純水配制成蛋白質(zhì)量濃度6 g/100 mL、糖質(zhì)量濃度0.4 g/100 mL的混合溶液。將混合溶液與質(zhì)量濃度2 g/100 mL NaOH溶液以2∶1的比例混合，迅速攪拌均勻后放置在不同溫度（4、25、37 ℃）孵育不同時(shí)間（1、3、5、7 d）。卵白蛋白-葡萄糖混合液用作對(duì)照。

1.3.2 顏色的測(cè)定

使用色差儀測(cè)定在不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系隨孵育時(shí)間的顏色變化。在測(cè)定前用白板和黑板對(duì)色差儀進(jìn)行校正。取反應(yīng)后的樣品液于比色皿中進(jìn)行顏色的測(cè)定。色差儀可以提供3 個(gè)顏色參數(shù)：L*（亮度參數(shù)，其值0～100表示從黑色到白色，值越高越白）、a*（紅綠參數(shù)，其值-100～100表示從綠色到紅色，正值表示紅色，負(fù)值表示綠色）、b*（黃藍(lán)參數(shù)，其值-100～100表示從藍(lán)色到黃色，正值表示黃色，負(fù)值表示藍(lán)色）[13]。

1.3.3 紫外吸光度的測(cè)定

參考Tan Ji’en等[14]的方法略作修改，將樣品液稀釋25 倍后，用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定稀釋液在294 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.4 褐變程度的測(cè)定

參考Tan Ji’en等[14]的方法略作修改，取1.5 mL樣品液于石英比色皿中，用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定樣品液在420 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.5 熒光強(qiáng)度的測(cè)定

參考Tan Ji’en等[14]的方法略作修改，將樣品液稀釋25 倍后，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定稀釋液在激發(fā)波長(zhǎng)為347 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為415 nm處的熒光強(qiáng)度。

1.3.6 pH值的測(cè)定

使用前對(duì)pH計(jì)進(jìn)行校正，用校正好的pH計(jì)測(cè)定樣品液的pH值。

1.3.7 FTIR分析

參考Sheng Long等[15]的方法略作修改，測(cè)定卵白蛋白-葡萄糖體系的FTIR。將不同反應(yīng)時(shí)間的卵白蛋白-葡萄糖體系混合液在-80 ℃冷凍完全，然后在真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥。將干燥好的樣品與KBr以質(zhì)量比1∶100混合，充分研磨后用壓片機(jī)壓成厚度小于0.5 mm的透明薄片。用FTIR對(duì)薄片進(jìn)行掃描（分辨率4.0 cm-1、掃描次數(shù)32、波數(shù)范圍4 000～400 cm-1）。用OMNIC 6.0數(shù)據(jù)收集軟件對(duì)收集的原始譜圖做進(jìn)一步分析。

1.3.8 氨基酸分析

參考Zhong Lei等[16]的方法略作修改，對(duì)卵白蛋白-葡萄糖體系的氨基酸含量進(jìn)行分析。在凍干的粉末中加入6 mol/L HCl溶液，于110 ℃的水解爐中水解22 h。取出水解樣品，冷卻至室溫后，將水解液過(guò)濾至50 mL容量瓶中，用超純水定容。取1.0 mL濾液至15 mL試管中，用試管濃縮儀在40～50 ℃的加熱環(huán)境下減壓干燥，干燥后殘留物用1～2 mL超純水溶解，再減壓干燥，最后蒸干。往干燥后試管中加入1～2 mL檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 2.2）溶解殘留物，振蕩混勻后用0.22 μm的濾膜過(guò)濾溶液，而后用自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行分析。

1.3.9 抗氧化活性的測(cè)定

1.3.9.1 抗氧化活性成分的制備

將在不同溫度孵育不同時(shí)間的卵白蛋白-葡萄糖溶液于-80 ℃冷凍完全后進(jìn)行冷凍干燥，將干燥后的樣品置于干燥器中進(jìn)行保存以進(jìn)行抗氧化活性的測(cè)定。

1.3.9.2 還原力的測(cè)定

參考Tan Ji’en等[14]的方法并略作修改。取1.0 mL 8 mg/mL樣品液，加入1.0 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L、pH 6.6）和1.0 mL鐵氰化鉀溶液（質(zhì)量濃度1 g/100 mL）。而后把上述反應(yīng)液于50 ℃的水浴鍋中水浴20 min，取出冷卻至室溫后，加入1.0 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液，混勻后3 000 r/min離心10 min。取1.0 mL上清液加入1.0 mL蒸餾水和200 μL氯化鐵溶液，混勻后用酶標(biāo)儀測(cè)定其在700 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.9.3 ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性的測(cè)定

ABTS陽(yáng)離子自由基的制備：將7 mmol/L ABTS儲(chǔ)備溶液和2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液混合，在室溫下于黑暗中放置16 h[17]。取1.0 mL 0.2 mg/mL的樣品液，加入1.0 mL ABTS陽(yáng)離子自由基工作液，混勻后于黑暗中放置6 min，而后用酶標(biāo)儀測(cè)定其在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度。樣品ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性計(jì)算公式如下：

式中：As為樣品在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度；A0為空白在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度（即樣品液被超純水取代）。

1.3.9.4 Fe2+螯合活性的測(cè)定

參考Tan Ji’en等[14]的方法略作修改。將1.0 mL 2 mg/mL樣品液與1.85 mL超純水混合，而后加入0.05 mL 0.2 mol/L FeCl2溶液，于室溫放置30 s后，即刻加入0.1 mL 5 mmol/L菲啰嗪溶液。混勻后于室溫放置10 min，而后3 000 r/min離心5 min，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定其在562 nm波長(zhǎng)處的吸光度。用超純水代替樣品溶液作為空白。樣品的Fe2+螯合活性計(jì)算公式如下：

式中：As為樣品溶液的吸光度；A0為空白的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 堿作用下卵白蛋白-葡萄糖體系顏色變化

食物顏色反映的是與原料相關(guān)的有色天然產(chǎn)物或加工過(guò)程中產(chǎn)生的有色化合物[18]。卵白蛋白-葡萄糖體系在不同溫度孵育不同時(shí)間的顏色變化見(jiàn)圖1a。在4 ℃孵育時(shí)，卵白蛋白-葡萄糖體系的顏色沒(méi)有出現(xiàn)明顯變化；在25 ℃孵育時(shí)，其顏色隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸加深；在37 ℃孵育時(shí)，其顏色在3 d內(nèi)迅速加深，而后隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)其顏色逐漸由黃色轉(zhuǎn)變成棕色。卵白蛋白-葡萄糖體系顏色的變化初步表明卵白蛋白與葡萄糖在堿作用下可能發(fā)生了美拉德反應(yīng)。

圖1 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系顏色隨著孵育時(shí)間的變化Fig. 1 Changes in color of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

圖1b～d展示了卵白蛋白-葡萄糖體系在不同溫度孵育不同時(shí)間的顏色參數(shù)變化。在4 ℃和25 ℃孵育時(shí)，卵白蛋白-葡萄糖體系的L*值在孵育5 d內(nèi)隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降（P＜0.05），當(dāng)孵育7 d又輕微上升（P＜0.05）；而在37 ℃孵育時(shí)，其L*值在孵育3 d內(nèi)逐漸下降（P＜0.05），然后隨著孵育時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)而逐漸上升（P＜0.05）。L*值下降可能是由于棕色色素的形成所致[13]，這與前面的顏色變化結(jié)果相對(duì)應(yīng)。在不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系的a*值均為負(fù)值，這表明體系反映出更多綠色特征。在4 ℃孵育時(shí)，體系的b*值隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)而輕微下降；在25 ℃和37 ℃孵育時(shí)，在整個(gè)孵育期間其b*值呈先上升后下降的趨勢(shì)。且在3 個(gè)不同溫度下體系的b*值均為負(fù)值，表明體系在整個(gè)孵育期間都展示出黃色特征。這3 個(gè)顏色參數(shù)在孵育期間的變化可能是由于卵白蛋白與葡萄糖在孵育期間發(fā)生了美拉德反應(yīng)，從而生成了各種各樣的中間和最終產(chǎn)物所致[19]。

2.2 堿作用下卵白蛋白-葡萄糖體系紫外吸光度的變化

美拉德反應(yīng)過(guò)程中形成的中間產(chǎn)物通常在294 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰[20]。不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系在294 nm吸光度隨孵育時(shí)間的變化如圖2所示。與未加堿的卵白蛋白-葡萄糖混合物相比，卵白蛋白-葡萄糖體系在4 ℃孵育時(shí)，其在294 nm波長(zhǎng)處的吸光度隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)而不斷上升（P＜0.05）；在25 ℃孵育時(shí)，其在294 nm波長(zhǎng)處的吸光度在前5 d內(nèi)隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸上升（P＜0.05），到第7天時(shí)趨于平穩(wěn)（P＞0.05）；在37 ℃孵育時(shí)，其在294 nm波長(zhǎng)處吸光度在整個(gè)孵育期間呈現(xiàn)先上升后下降（P＜0.05）的變化趨勢(shì)，在第5天達(dá)到最大值。在294 nm波長(zhǎng)處吸光度的增加表明卵白蛋白-葡萄糖體系在孵育過(guò)程中形成了美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物。先前的研究表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，一些美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物會(huì)進(jìn)一步發(fā)生聚合反應(yīng)生成棕色物質(zhì)，從而導(dǎo)致中間產(chǎn)物含量的減少[21-22]。這可能就是卵白蛋白-葡萄糖體系在37 ℃孵育后期其在294 nm波長(zhǎng)處吸光度下降的原因。孵育溫度越高，卵白蛋白-葡萄糖體系在294 nm波長(zhǎng)處的吸光度也越高，這可能是因?yàn)樵诓煌瑴囟认旅览路磻?yīng)的反應(yīng)速率不同，在更高溫度下，中間產(chǎn)物的形成速率更快。這與Jin Wengang等[20]對(duì)扇貝性腺水解產(chǎn)物-核糖體系的研究觀察到的結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)其在294 nm波長(zhǎng)處吸光度隨反應(yīng)溫度升高而升高。

圖2 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系在294 nm波長(zhǎng)處吸光度隨著孵育時(shí)間的變化Fig. 2 Changes in absorbance at 294 nm of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

2.3 堿作用下卵白蛋白-葡萄糖體系褐變程度變化

美拉德反應(yīng)的后期階段非常復(fù)雜，在這個(gè)階段會(huì)產(chǎn)生各種各樣的含氮或不含氮的棕色聚合物，這些聚合物在420 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，因此可用420 nm波長(zhǎng)處的吸光度指示棕色聚合物的生成[23]。如圖3所示，在3 個(gè)不同溫度下孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系在420 nm波長(zhǎng)處吸光度均隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)（P＜0.05），只是在4 ℃孵育時(shí)，其吸光度只是輕微上升，而在25 ℃和37 ℃孵育時(shí)，其上升趨勢(shì)更為顯著。且孵育溫度越高，體系在420 nm波長(zhǎng)處吸光度越大。與卵白蛋白-葡萄糖混合物在420 nm波長(zhǎng)處吸光度相比，孵育后卵白蛋白-葡萄糖體系在420 nm波長(zhǎng)處吸光度的增加說(shuō)明孵育期間卵白蛋白與葡萄糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)，生成了棕色聚合物。孵育溫度更高，體系在420 nm波長(zhǎng)處的吸光度越高是因?yàn)闇囟仍礁撸览路磻?yīng)速率越快，導(dǎo)致生成更多的棕色聚合物。這結(jié)果與體系在294 nm波長(zhǎng)處吸光度結(jié)果一致，都是孵育溫度越高，體系吸光度也相對(duì)越高。

圖3 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系在420 nm波長(zhǎng)處吸光度隨著孵育時(shí)間的變化Fig. 3 Changes in absorbance at 420 nm of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

2.4 堿作用下卵白蛋白-葡萄糖體系熒光強(qiáng)度的變化

在美拉德反應(yīng)中間階段除生成具有紫外吸收的物質(zhì)，還生成具有熒光吸收的物質(zhì)，這些具有熒光吸收的物質(zhì)通常被認(rèn)為是棕色化合物的前體[24]。具有熒光吸收的中間產(chǎn)物與具有紫外吸收的中間產(chǎn)物并不相同，它們具有不同的動(dòng)力學(xué)，具有熒光吸收的中間產(chǎn)物相對(duì)來(lái)說(shuō)更具有反應(yīng)性，更容易轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣酆衔颷25]。如圖4所示，在3 個(gè)不同孵育溫度下，卵白蛋白-葡萄糖體系的熒光強(qiáng)度都隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增加（P＜0.05）。但是與其在294 nm和420 nm波長(zhǎng)處吸光度不同的是，在37 ℃孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系熒光強(qiáng)度是3 個(gè)溫度中最低的，最高在25 ℃，其次在4 ℃。熒光強(qiáng)度的增加表明卵白蛋白與葡萄糖在孵育期間發(fā)生了美拉德反應(yīng)，生成了具有熒光吸收的物質(zhì)。而在37 ℃孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系的熒光強(qiáng)度最低可能是因?yàn)槊览路磻?yīng)在高溫下具有更高的反應(yīng)速率，導(dǎo)致在37 ℃條件下生成的熒光物質(zhì)更快地轉(zhuǎn)變成了棕色化合物。在37 ℃孵育卵白蛋白-葡萄糖體系的熒光強(qiáng)度最低，而其在294 nm波長(zhǎng)處吸光度卻最高，這可能是因?yàn)榫哂袩晒馕盏闹虚g產(chǎn)物比具有紫外吸收的中間產(chǎn)物更具反應(yīng)性所致。

圖4 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系熒光強(qiáng)度隨著孵育時(shí)間的變化Fig. 4 Changes in fluorescence intensity of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

2.5 堿作用下卵白蛋白-葡萄糖體系pH值變化

在不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系的pH值隨著孵育時(shí)間的變化見(jiàn)圖5。第0天為對(duì)照組即卵白蛋白-葡萄糖混合物的pH值，加入2 g/100 mL NaOH溶液后，體系的pH值迅速上升（P＜0.05），而后隨著孵育時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，在不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系的pH值都呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)（P＜0.05），且在更高的孵育溫度下，其pH值下降得更迅速。與結(jié)果相似的是，有研究者發(fā)現(xiàn)卵白蛋白-葡萄糖體系在微波條件下處理時(shí)，其pH值也是隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)[26]。在孵育過(guò)程中體系pH值的下降可能是由于卵白蛋白與葡萄糖在孵育過(guò)程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)，生成了一些酸性物質(zhì)所致。有研究者在發(fā)生美拉德反應(yīng)后的體系中發(fā)現(xiàn)了酸性物質(zhì)（如甲酸、乙酸、甲基乙二醛、乙二醛）的存在，這些酸性物質(zhì)的存在會(huì)降低體系的pH值[20,24]。且當(dāng)葡萄糖與卵白蛋白反應(yīng)時(shí)，會(huì)消耗卵白蛋白中的氨基酸，這也會(huì)降低體系的pH值。而在更高孵育溫度下體系的pH值更低是因?yàn)槊览路磻?yīng)在更高溫度下具有更高的反應(yīng)速率，因此會(huì)生成更多的酸性物質(zhì)，同時(shí)也會(huì)消耗更多的氨基酸，從而使體系的pH值下降得更快。這與在294 nm以及420 nm波長(zhǎng)處的吸光度結(jié)果一致，在更高溫度下體系在294 nm和420 nm波長(zhǎng)處的吸光度越高，說(shuō)明在更高溫度下產(chǎn)生了更多的中間和最終產(chǎn)物，而在更高溫度下pH值下降越快是因?yàn)楫a(chǎn)生了更多的酸性物質(zhì)。

圖5 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系pH值隨著孵育時(shí)間的變化Fig. 5 Changes in pH of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

2.6 堿作用下卵白蛋白-葡萄糖體系FTIR光譜的變化

蛋白質(zhì)在紅外區(qū)域有幾個(gè)特征吸收帶，其中酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）和II帶（1 600～1 500 cm-1）是研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)最具價(jià)值的吸收帶[27]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)發(fā)生反應(yīng)后，其分子水平上的官能團(tuán)會(huì)發(fā)生修飾，這在紅外光譜上表現(xiàn)為新條帶的出現(xiàn)或舊條帶的消失，以及峰強(qiáng)度和位置的變化。

圖6展示了卵白蛋白以及在不同溫度孵育不同時(shí)間的卵白蛋白-葡萄糖體系的紅外圖譜。在3 個(gè)不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系在1 655 cm-1和1 540 cm-1兩處吸收峰的強(qiáng)度都比卵白蛋白在此兩處的吸收峰強(qiáng)度更低，且隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，其強(qiáng)度呈不斷下降的趨勢(shì)。這表明酰胺I帶和II帶發(fā)生了修飾，可能是因?yàn)樵诜跤^(guò)程中卵白蛋白與葡萄糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)，消耗了卵白蛋白的氨基所致。Su Junfeng等[28]研究得到相似的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在羧甲基纖維素和大豆蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)期間，酰胺I帶和II帶處的吸收峰強(qiáng)度隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降。除了酰胺I帶和II帶峰強(qiáng)度的下降，在1 453 cm-1和1 239 cm-1兩處的峰強(qiáng)度也在孵育后呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，進(jìn)一步說(shuō)明卵白蛋白與葡萄糖在孵育期間發(fā)生了美拉德反應(yīng)。且卵白蛋白-葡萄糖體系孵育后，在884 cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰，這個(gè)新吸收峰可能是由于卵白蛋白與葡萄糖在堿作用下生成的MRPs（如Amadori化合物、席夫堿或吡嗪）引起的。Liu Qian等[29]報(bào)道形成MRPs（Amadori化合物、席夫堿和吡嗪）的鍵在1 800～800 cm-1處具有吸收峰。其他一些學(xué)者也觀察到相似的現(xiàn)象，即反應(yīng)體系發(fā)生美拉德反應(yīng)后會(huì)在紅外圖譜中出現(xiàn)新的吸收峰[15-16]。FTIR表明不同溫度下孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系發(fā)生了美拉德反應(yīng)，葡萄糖成功與卵白蛋白綴合。

圖6 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系FTIRFig. 6 FTIR spectra of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

2.7 氨基酸分析

如表1所示，與卵白蛋白的總氨基酸含量相比，在不同溫度孵育后的卵白蛋白-葡萄糖體系的總氨基酸含量都呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)，這可能是由于孵育期間卵白蛋白的氨基與葡萄糖的羰基發(fā)生了美拉德反應(yīng)，消耗了一部分卵白蛋白中的氨基酸所致[30]。除了總氨基酸含量在孵育后呈下降外，各種氨基酸含量在孵育后也呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。與其他氨基酸相比，絲氨酸（Ser）、組氨酸（His）和Cys展現(xiàn)出較明顯的下降趨勢(shì)，在孵育后分別下降約50%、70%和100%。這表明3種氨基酸的反應(yīng)性高，是卵白蛋白與葡萄糖在堿處理下發(fā)生美拉德反應(yīng)的主要氨基酸。尤其是Cys，在孵育后其含量下降到0%左右，說(shuō)明它基本都參與了美拉德反應(yīng)，與葡萄糖形成了共軛物，因此其含量下降很快，這也說(shuō)明Cys的反應(yīng)性比其他氨基酸都高，是堿處理下卵白蛋白與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)的主要結(jié)合位點(diǎn)[31]。這與Zhong Lei等[16]研究的結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)在燕麥蛋白分離物與平菇β-葡聚糖混合孵育后Cys的含量下降最多。Chen Zhangyi等[8]發(fā)現(xiàn)在堿處理過(guò)程中，蛋清中的巰基含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)不斷上升，而二硫鍵含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)不斷下降，這說(shuō)明堿會(huì)破壞蛋清中的二硫鍵而使巰基暴露出來(lái)。因此當(dāng)卵白蛋白-葡萄糖體系在堿處理過(guò)程中，卵白蛋白第73位和第120位的Cys之間存在的二硫鍵可能會(huì)被堿破壞，從而使Cys暴露出來(lái)，使其更易與葡萄糖發(fā)生反應(yīng)，這可能就是堿處理過(guò)程中卵白蛋白中Cys具有最高反應(yīng)性的原因。

在更高溫度下，體系氨基酸含量下降得更加迅速。這與顏色、紫外吸光度、褐變程度等的結(jié)果相似，都是在更高溫度下顯示出更顯著的變化。這進(jìn)一步說(shuō)明溫度越高，美拉德反應(yīng)的反應(yīng)性越高，因此在更高溫度下卵白蛋白中的氨基酸與葡萄糖發(fā)生反應(yīng)的速率越快，導(dǎo)致其氨基酸含量下降得更快。

表1 卵白蛋白及不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系的氨基酸含量Table 1 Amino acid contents of ovalbumin and ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods%

2.8 抗氧化活性

2.8.1 還原力

如圖7所示，與卵白蛋白-葡萄糖混合物還原力相比，在不同溫度孵育后，卵白蛋白-葡萄糖體系的還原力都有了很大的提升（P＜0.05）。但隨著孵育時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系還原力都呈逐漸下降趨勢(shì)（P＜0.05）。孵育溫度越高，卵白蛋白-葡萄糖體系還原力也相對(duì)較高，而且其隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)下降得也越快。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似的是，有研究者發(fā)現(xiàn)卵白蛋白與葡萄糖在120 ℃濕熱處理20 min后，其還原力也有了顯著的提升[32]。卵白蛋白-葡萄糖體系在孵育后其還原力顯著上升可能是由于卵白蛋白與葡萄糖在孵育期間發(fā)生了美拉德反應(yīng)，生成了中間產(chǎn)物還原酮等。Amarowicz[33]報(bào)道，還原酮等中間產(chǎn)物因其具有捐贈(zèng)氫原子來(lái)打斷自由基鏈的能力而展現(xiàn)出較高的還原力。當(dāng)美拉德反應(yīng)從中間階段進(jìn)入后期階段時(shí)，在中間階段形成的中間產(chǎn)物還原酮等會(huì)進(jìn)一步反應(yīng)生成復(fù)雜的最終產(chǎn)物，從而失去還原力[33]。這可能就是卵白蛋白-葡萄糖體系還原力在孵育時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)后而不斷下降的原因。

根據(jù)Arrhenius原理，溫度升高會(huì)提高分子的動(dòng)能和碰撞速率，從而使反應(yīng)速率增加[34]。因此在更高的孵育溫度下，卵白蛋白與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)的速率更快，從而能生成更多的還原酮等具有還原力的中間產(chǎn)物，這就是卵白蛋白-葡萄糖體系在更高溫度下具有更高還原力的原因。至于在更高孵育溫度下其還原力下降得更快，也是因?yàn)樵诟邷囟认虑捌谏傻倪€原酮等中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成最終產(chǎn)物的速率更快，從而使其還原力下降得更快。

圖7 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系還原力隨孵育時(shí)間的變化Fig. 7 Changes in reducing power of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

2.8.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性

如圖8所示，與卵白蛋白-葡萄糖混合物相比，在不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系的ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性均在孵育1 d后顯著增加（P＜0.05）。而后在4 ℃和25 ℃孵育時(shí)，隨著孵育時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，其ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性未出現(xiàn)明顯變化（P＞0.05）；在37 ℃孵育時(shí)，其ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性隨著孵育時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)而出現(xiàn)輕微下降（P＜0.05）。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，有研究者發(fā)現(xiàn)卵白蛋白與葡萄糖在120 ℃濕熱處理20 min后，其ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性也有了顯著提升[32]。有學(xué)者報(bào)道有些美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物可以作為氫原子供體，從而展現(xiàn)出ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性[35-36]。因此孵育后卵白蛋白-葡萄糖體系的ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性增加可能是因?yàn)槁寻椎鞍着c葡萄糖在孵育期間發(fā)生了美拉德反應(yīng)，生成了可以作為氫供體的中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物。當(dāng)美拉德反應(yīng)從中間階段進(jìn)入最終階段時(shí)，中間產(chǎn)物會(huì)進(jìn)一步反應(yīng)生成最終產(chǎn)物，從而可能失去其ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性[33]。在3 個(gè)溫度下，只有在37 ℃孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系的ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性下降是因?yàn)槊览路磻?yīng)在更高的溫度下反應(yīng)速率更快，因此可能在37 ℃時(shí)具有ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性的中間產(chǎn)物有一部分已轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物，而在4 ℃和25 ℃時(shí)具有ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性的中間產(chǎn)物還沒(méi)有轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物。而體系還原力與ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性隨孵育時(shí)間的變化趨勢(shì)不同可能是因?yàn)樵诓煌臏y(cè)定方法中起作用的物質(zhì)不同。這說(shuō)明MRPs的抗氧化活性很復(fù)雜。

圖8 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系A(chǔ)BTS陽(yáng)離子自由基清除活性隨孵育時(shí)間的變化Fig. 8 Changes in ABTS radical cation scavenging activity of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

2.8.3 Fe2+螯合活性

由圖9可知，卵白蛋白-葡萄糖混合物的Fe2+螯合活性只有1.8%左右，當(dāng)其在堿作用下在不同溫度下孵育1 d后，其Fe2+螯合活性有顯著提高（P＜0.05）。在4 ℃孵育時(shí)，隨著孵育時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)其Fe2+螯合活性變化不大，只有在孵育7 d后才出現(xiàn)輕微下降（P＜0.05）。然而在25 ℃和37 ℃孵育時(shí)，其Fe2+螯合活性隨著孵育時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)呈不斷下降的趨勢(shì)（P＜0.05）。有研究者報(bào)道MRPs是有效的金屬螯合劑，因?yàn)樗鼈冎械牧u基和吡咯基團(tuán)具有螯合金屬的作用[37-38]。卵白蛋白-葡萄糖體系在孵育后其Fe2+螯合活性顯著提高可能是因?yàn)樵诜跤^(guò)程中卵白蛋白與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)生成了具有羥基和吡咯基團(tuán)的MRPs。而隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)其Fe2+螯合活性出現(xiàn)輕微下降可能是因?yàn)槟承┚哂蠪e2+螯合活性的MRPs隨著美拉德反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)生了反應(yīng)，生成了更加復(fù)雜的MRPs，而失去了Fe2+螯合活性。至于在更高溫度下Fe2+螯合活性下降得更快的原因如前所述，是因?yàn)槊览路磻?yīng)在更高溫度下的速率更快，因此更多具有Fe2+螯合活性的產(chǎn)物進(jìn)一步反應(yīng)生成更復(fù)雜的物質(zhì)而失去抗氧化活性。

圖9 不同溫度孵育的卵白蛋白-葡萄糖體系Fe2+螯合活性隨孵育時(shí)間的變化Fig. 9 Changes in Fe2＋-chelating activity of ovalbumin-glucose system incubated at different temperatures for different periods

3 結(jié) 論

考察溫度對(duì)堿處理下卵白蛋白-葡萄糖體系顏色、物化特性及抗氧化活性的影響。孵育溫度越高，卵白蛋白-葡萄糖體系的顏色、紫外吸收、褐變程度以及熒光強(qiáng)度等指標(biāo)展現(xiàn)出更顯著的變化。FTIR表明，堿作用下，卵白蛋白與葡萄糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)，氨基酸分析表明兩者發(fā)生美拉德反應(yīng)的主要結(jié)合位點(diǎn)為Ser、His和Cys，最主要的結(jié)合位點(diǎn)為Cys。孵育后的卵白蛋白-葡萄糖體系的抗氧化活性與卵白蛋白葡萄糖混合相比有顯著提升，但隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)有輕微的下降。總之，溫度對(duì)堿處理下卵白蛋白-葡萄糖體系顏色、物化性質(zhì)及其抗氧化活性具有顯著影響，卵白蛋白可能在皮蛋腌制過(guò)程中對(duì)皮蛋蛋白顏色的形成起很大的作用。