朱士臣，俞杰航，金 燕，丁玉庭，周緒霞,*，楊 青，位正鵬，王金梅

（1.浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江省深藍(lán)漁業(yè)資源高效開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家遠(yuǎn)洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心（杭州），浙江 杭州 310014；2.大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034；3.泰祥集團(tuán)-榮成泰祥食品股份有限公司，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部冷凍調(diào)理海洋食品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 榮成 264300）

魚糜制品營養(yǎng)豐富且質(zhì)構(gòu)特性獨(dú)特，深受廣大消費(fèi)者喜愛。冷凍可以抑制因微生物和內(nèi)源酶作用引發(fā)的魚糜腐敗變質(zhì)，是目前穩(wěn)定魚糜品質(zhì)、延長(zhǎng)貨架期的主要手段。但由于冷凍貯藏過程中溫度的波動(dòng)性，導(dǎo)致冰晶重結(jié)晶現(xiàn)象嚴(yán)重，冰晶的力學(xué)效應(yīng)會(huì)破壞魚糜組織細(xì)胞，誘發(fā)蛋白質(zhì)聚集、降解、氧化以及脂質(zhì)氧化等系列生化反應(yīng)[1-2]，從而進(jìn)一步降低魚糜制品的質(zhì)構(gòu)特性和營養(yǎng)價(jià)值。

添加抗凍劑是控制魚糜冷凍變性的有效手段之一。目前應(yīng)用最為普遍的抗凍劑為蔗糖、多元醇或多聚磷酸鹽及其復(fù)配物，盡管此類抗凍劑抗凍效果較好，但存在一定的健康風(fēng)險(xiǎn)。如蔗糖等糖類會(huì)帶入高熱量及甜味而導(dǎo)致肥胖、齲齒等，且不適于糖尿病患者食用；多聚磷酸鹽的攝入存在加重高血壓或慢性腎病等風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。近年來，廣大學(xué)者開發(fā)了幾種具有較高安全性的食品用抗凍劑，如多糖類膠體及抗凍蛋白和抗凍肽等[4-6]。多糖的膠凝特性能夠使冰晶的融化-生長(zhǎng)過程局限于其三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，從而抑制冰重結(jié)晶[7]?？箖龅鞍椎目箖鎏匦耘c其聚脯氨酸II型結(jié)構(gòu)（PPII結(jié)構(gòu)）親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)相隔分布的構(gòu)象特點(diǎn)密切相關(guān)[8]；抗凍多肽Gly-X-Y的序列排布也是其發(fā)揮抗凍特性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征。盡管上述新型抗凍劑表現(xiàn)出一定的冷凍保護(hù)效果，但由于其抗凍能力或制備條件的局限性，限制了它們的廣泛應(yīng)用。

作為膠原部分變性的產(chǎn)物，明膠在保留部分PPII結(jié)構(gòu)的同時(shí)，還包括分子質(zhì)量分布廣泛的多肽組分。明膠小分子多肽鏈（＜10 kDa）由Gly-Pro-X單元序列重復(fù)組合而成，與抗凍多肽的重復(fù)序列Gly-X-Y非常類似，已被證實(shí)具有較強(qiáng)的抗冰晶形成能力[9]。明膠的成凝膠性是其另一重要的結(jié)構(gòu)特征，是由一定較大分子質(zhì)量的多肽組分在一定理化條件下自組裝形成的具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)凝膠體的過程。明膠上述結(jié)構(gòu)或組分均賦予了其抑制冰晶形成或生長(zhǎng)能力，這為明膠作為一種新型蛋白抗凍劑提供一定的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

本課題組前期的研究結(jié)果表明，酶法制備明膠具有較強(qiáng)的抗凍潛力[10-11]。本研究將酶型魚鱗明膠加入到魚糜中，探究魚鱗明膠對(duì)魚糜在凍融過程中的冷凍保護(hù)作用，旨在為食品級(jí)綠色安全、健康高效新型冷凍保護(hù)劑的開發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚鱗、黑魚 杭州朝暉六區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

胃蛋白酶（1∶3 000） 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；Ca2+-ATP酶活性測(cè)定試劑盒 江蘇省南京建成科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海力辰邦西儀器科技有限公司；LGJ-12D真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)起航科技有限公司；BECKMAN A高速冷凍臺(tái)式離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司；IKA-T25高速分散均質(zhì)機(jī) 德國IKA公司；XW-80A旋渦混合器 上海馳唐電子有限公司；UV-6100S紫外-可見分光光度儀 上海美普達(dá)儀器有限公司；MCR 52流變儀 奧地利安東帕（中國）有限公司；PHS-3E pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司；Gemini 500場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 明膠的制備

取洗凈曬干的黑魚魚鱗，加入20 倍體積的0.1 mol/L NaOH溶液在30 ℃恒溫水浴中處理2 h，用清水徹底清洗處理后的魚鱗，以除去魚鱗中的雜蛋白，重復(fù)1 次上述步驟。加入20 倍體積的0.4 mol/L HCl溶液在30 ℃恒溫水浴中脫鈣處理1 h，用清水反復(fù)清洗魚鱗，重復(fù)1 次上述步驟。加入10 倍體積的純水，同時(shí)添加2 g/100 mL胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值至2.0，置于37 ℃恒溫水浴中處理4 h，然后在90 ℃水浴中滅酶處理10 min。反復(fù)清洗酶處理后的魚鱗，加入10 倍體積的純水，調(diào)節(jié)pH值至6.0左右，60 ℃恒溫水浴提取5 h，用3～4 層紗布過濾，將濾液緩慢冷卻至室溫，凍干得到樣品，將樣品粉碎后置于陰涼處密封保存。

1.3.2 魚糜的制備

新鮮黑魚經(jīng)過采肉、漂洗（清水漂洗2 次、0.1%鹽水漂洗1 次）和脫水（控制水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在80%左右）處理后得到新鮮黑魚魚糜。

將新鮮魚糜分為5 組：對(duì)照組（C）；添加0.5%、1%、2%（m/m）明膠組（0.5G、1G、2G）；添加商業(yè)抗凍劑組（4%（m/m）蔗糖+4%（m/m）山梨醇）（S）。將樣品混合均勻后置于-18 ℃保存18 h，然后置于4 ℃解凍6 h為1 個(gè)凍融循環(huán)，定期取樣測(cè)試。

1.3.3 肌原纖維蛋白提取

參考Gao Wenhong等[12]的方法并稍作修改。取2 g魚糜，加入10 倍體積冷卻（4 ℃）的Tris-馬來酸緩沖液（50 mmol/L KCl+20 mmol/L Tris-馬來酸，pH 7.0），于10 000 r/min勻漿，每勻漿20 s冰浴20 s，重復(fù)3 次。勻漿液4 ℃、10 000×g離心10 min，棄去上清液。在沉淀中加入10 倍體積冷卻（4 ℃）的Tris-馬來酸緩沖液（0.6 mol/L KCl+20 mmol/L Tris-馬來酸，pH 7.0），重復(fù)上述勻漿操作，勻漿液于4 ℃靜置提取1 h，在4 ℃、10 000×g離心10 min，得到上清液，即為肌原纖維蛋白溶液。

1.3.4 蛋白溶解度測(cè)定

參考Kittiphattanabawon等[13]的方法并稍作修改。取1.5 g魚糜，加入10 倍體積冷卻（4 ℃）的Tris-馬來酸緩沖液（50 mmol/L KCl+20 mmol/L Tris-馬來酸，pH 7.0），10 000 r/min勻漿，每勻漿20 s冰浴20 s，重復(fù)3 次。勻漿液4 ℃、10 000×g離心10 min，棄去上清液。在沉淀中加入10 倍體積冷卻（4 ℃）的Tris-馬來酸緩沖液（0.6 mol/L KCl+20 mmol/L Tris-馬來酸，pH 7.0），重復(fù)上述勻漿操作，勻漿液于4 ℃靜置提取1 h，4 ℃、10 000×g離心10 min，得到上清液，準(zhǔn)確量取上清液體積，用雙縮脲法測(cè)定上清液中蛋白濃度。按式（1）計(jì)算蛋白溶解度：

1.3.5 總巰基含量測(cè)定

參考Benjakul等[14]的方法并稍作修改。將肌原纖維蛋白溶液稀釋至4 mg/mL。取0.5 mL稀釋液，加入4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（含8 mol/L尿素、2%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、10 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 6.8），充分振蕩混勻后取4 mL混勻液。加入0.4 mL 0.1% 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溶液（含0.2 mol/L Tris-HCl，pH 8.0），40 ℃下孵育25 min，測(cè)定412 nm波長(zhǎng)處的吸光度。以0.6 mol/L KCl溶液（pH 7.0）作為空白對(duì)照，以13 600 L/（mol·cm）的摩爾消光系數(shù)計(jì)算總巰基含量。

1.3.6 Ca2+-ATP酶活性測(cè)定

采用試劑盒測(cè)定Ca2+-ATP酶活性。肌原纖維蛋白的Ca2+-ATP酶活性以單位時(shí)間內(nèi)單位蛋白中Ca2+-ATP酶分解三磷酸腺苷產(chǎn)生無機(jī)磷的量表示，單位為μmol/（mg·h）。

1.3.7 羰基含量測(cè)定

參考Lin Jun等[15]的方法并稍作修改。將肌原纖維蛋白溶液稀釋至2 mg/mL。取1 mL稀釋液加入1 mL 10 mmol/L二硝基苯肼溶液（含2 mmol/L HCl溶液）中，充分混勻，置于暗處反應(yīng)1 h。加入1 mL 20%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，在4 ℃、14 000 r/min離心5 min，收集沉淀。用1 mL乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液洗滌沉淀3 次，除去游離的二硝基苯肼。沉淀中加入3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液，混勻，37 ℃下孵育15 min。反應(yīng)得到的溶液以14 000 r/min離心5 min除去不溶物。在370 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液的吸光度，羰基含量以nmol/mg表示（蛋白質(zhì)量計(jì)），摩爾消光系數(shù)為22 000 L/（mol·cm）。

1.3.8 表面疏水性測(cè)定

參考Chelh等[16]的方法并稍作修改。用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）將肌原纖維蛋白溶液稀釋至2 mg/mL。取2 mL稀釋液，加入80 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液（去離子水溶解），混合均勻，暗處靜置10 min，以4 000×g離心15 min。將上清液稀釋10 倍后，測(cè)定595 nm波長(zhǎng)處的吸光度。肌原纖維蛋白溶液的表面疏水性以溴酚藍(lán)質(zhì)量表示。按式（2）計(jì)算溴酚藍(lán)質(zhì)量：

1.3.9 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

對(duì)經(jīng)過8 次凍融循環(huán)的樣品中肌原纖維蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。將5 mg/mL樣品與SDS上樣緩沖液以1∶4（V/V）混合，沸水浴5 min。采用12%分離膠和5%濃縮膠，樣品上樣量為15 μL，以濃縮膠80 V、分離膠120 V的恒定電壓進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染液染色30 min，然后用脫色液（甲醇-冰醋酸水溶液）脫色。

1.3.10 魚糜動(dòng)態(tài)流變特性測(cè)定

采用配備75 mm平行鋼板的MCR 52流變儀測(cè)定升溫過程中魚糜樣品的儲(chǔ)能模量（G’）變化。取適量魚糜樣品置于流變儀平臺(tái)上，平板周圍涂上一層甲基硅油防止水分蒸發(fā)。測(cè)試條件為：平板間隙1 mm；應(yīng)變2%；頻率0.1 Hz；升溫掃描范圍20～90 ℃；升溫速率3 ℃/min。

1.3.11 魚糜凝膠制備

將解凍的魚糜樣品與2% NaCl溶液（m/m）均勻混合，擂潰5 min。將擂潰后的魚糜灌入腸衣（直徑20 mm），排氣扎緊。采用兩段式加熱：首先將魚腸置于40 ℃恒溫水浴30 min，再置于90 ℃恒溫水浴20 min制成魚糜凝膠。置于冷水中冷卻，并于4 ℃冰箱貯存用于后續(xù)指標(biāo)分析測(cè)試。

1.3.12 魚糜凝膠強(qiáng)度測(cè)定

將制備的魚糜凝膠切成圓柱體（Φ20 mm×15 mm），在室溫下平衡30 min，采用TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度。使用P/5S球形探頭，以1 mm/s的恒定速率穿刺10 mm，記錄破斷力和破斷距離，按下式計(jì)算魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度：

1.3.13 魚糜凝膠持水性測(cè)定

參考Ogawa等[17]的方法并稍作修改。將魚糜切成小塊，50 mL離心管中墊入濾紙，準(zhǔn)確稱量離心管和濾紙的質(zhì)量記為m0，再稱取5 g左右切碎的魚糜樣品放置在濾紙中，準(zhǔn)確稱質(zhì)量為m1，在4 ℃、10 000 r/min離心15 min。離心完畢后，準(zhǔn)確稱量離心后的魚糜質(zhì)量為m2。持水性按式（4）計(jì)算：

1.3.14 魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)

將魚糜凝膠切成2 mm左右的薄片，用pH 7.2 2.5%戊二醛溶液在4 ℃固定12 h，再用pH 7.2 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗3 次，每次15 min。然后依次用35%、50%、70%、85%、90%乙醇溶液漂洗脫水，每次15 min，再用無水乙醇脫水兩次，每次15 min。處理好的樣品經(jīng)過冷凍干燥和噴金處理后使用掃描電子顯微鏡放大100 倍觀察魚糜凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.15 差示掃描量熱測(cè)定

按照1.3.3節(jié)的方法提取肌原纖維蛋白，將魚糜質(zhì)量1%的明膠添加到肌原纖維蛋白中，在4 ℃條件下通過磁力攪拌充分混勻，然后按照1.3.2節(jié)的條件進(jìn)行3 次凍融循環(huán)處理。將樣品凍干后采用差示掃描量熱分析明膠與肌原纖維蛋白的相互作用，參數(shù)如下：掃描范圍為20～100 ℃，升溫速率為20 ℃/min，全程在20 mL/min的N2環(huán)境下進(jìn)行，記錄升溫曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理計(jì)算，采用SPSS 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05，差異顯著），利用Origin 2017軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 明膠對(duì)凍融循環(huán)過程中肌原纖維蛋白的影響

2.1.1 肌原纖維蛋白溶解度分析

圖1 明膠添加量對(duì)不同凍融循環(huán)處理的魚糜肌原纖維蛋白溶解度的影響Fig. 1 Effect of gelatin on the solubility of myofibril protein subjected to different freeze-thaw cycles

肌原纖維蛋白溶解度變化是反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的重要指標(biāo)，可反映蛋白質(zhì)的變性程度。由圖1可知，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，魚糜肌原纖維蛋白溶解度總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。其中，對(duì)照組肌原纖維蛋白溶解度下降最為顯著；經(jīng)過8 次凍融循環(huán)后，對(duì)照組和添加0.5%、1%、2%明膠實(shí)驗(yàn)組以及商業(yè)抗凍劑組的蛋白溶解度分別下降至未凍融初始值的30.2%、40.4%、50.8%、45.5%和66.4%。結(jié)果表明，明膠的添加可在一定程度上減少凍融過程中肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)變化。在凍融過程中，肌原纖維蛋白在冰晶破壞作用和冷凍誘導(dǎo)的變性作用等多重作用下蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵以及離子相互作用形成，從而使其溶解度降低[17-18]。明膠富含親水性氨基酸，親水性氨基酸殘基側(cè)鏈與蛋白質(zhì)表面水分子相互作用，穩(wěn)定了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；同時(shí)，明膠自身的成凝膠性降低了水分遷移及冰晶形成能力，從而抑制了冷凍誘導(dǎo)的蛋白變性[19]。但明膠組的蛋白質(zhì)溶解度仍低于商業(yè)抗凍劑組，有必要在未來的研究中對(duì)明膠進(jìn)一步修飾改性，以進(jìn)一步增強(qiáng)明膠的抗凍能力。

2.1.2 總巰基含量分析

由圖2可知，在凍融處理過程中，對(duì)照組的總巰基含量下降最顯著，而添加商業(yè)抗凍劑組和不同比例明膠的實(shí)驗(yàn)組的總巰基含量下降相對(duì)緩慢。經(jīng)8 次凍融循環(huán)處理后，添加0.5%、1%、2%明膠實(shí)驗(yàn)組和商業(yè)抗凍劑組的總巰基含量顯著高于對(duì)照組，分別比初始值降低了22.4%、17.4%、21.8%、12.3%和28.3%。

圖2 明膠添加量對(duì)不同凍融循環(huán)處理的魚糜肌原纖維蛋白總巰基含量的影響Fig. 2 Effect of gelatin on the sulfydryl content of myofibril protein subjected to different freeze-thaw cycles

巰基是肌原纖維蛋白中最為活躍的反應(yīng)性基團(tuán)之一，在長(zhǎng)期的凍藏和凍融過程中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化導(dǎo)致埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基暴露在表面，半胱氨酸的巰基發(fā)生氧化或二硫鍵的交換轉(zhuǎn)化為二硫鍵[15,19]。在凍融過程中，冰晶的反復(fù)形成導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的巰基暴露在活性氧中，被氧化形成二硫鍵。明膠的添加能夠通過水約束效應(yīng)在一定程度上抑制冰晶的破壞作用，同時(shí)穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而抑制凍融過程中巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵。

2.1.3 表面疏水性分析

肌原纖維蛋白的表面疏水性通常與蛋白質(zhì)溶解度的下降呈負(fù)相關(guān)[15]。如圖3所示，對(duì)照組、添加商業(yè)抗凍劑組和不同比例明膠的實(shí)驗(yàn)組在凍融循環(huán)過程中表面疏水性總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但在整個(gè)凍融過程中對(duì)照組表面疏水性始終高于其他組別。凍融8 個(gè)循環(huán)后，對(duì)照組和添加0.5%、1%、2%明膠實(shí)驗(yàn)組和商業(yè)抗凍劑組的表面疏水性分別比各自初始值增加了100.6%、88.1%、57.9%、86.3%和58.5%。

圖3 明膠添加量對(duì)不同凍融循環(huán)處理的魚糜肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig. 3 Effect of gelatin on the surface hydrophobicity of myofibril protein subjected to different freeze-thaw cycles

肌原纖維蛋白表面疏水性的增加表明肌原纖維蛋白的展開和非極性氨基酸的增加，凍融過程中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)肽鏈展開變性導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)型發(fā)生轉(zhuǎn)變，埋藏在分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基逐漸暴露于蛋白質(zhì)表面并發(fā)生氧化，從而導(dǎo)致肌原纖維蛋白表面疏水性的增加[20-21]。明膠的添加可以抑制水分子的遷移，延緩凍融過程中冰晶對(duì)蛋白質(zhì)表面水分子保護(hù)層的破壞，從而減少蛋白質(zhì)的展開并保護(hù)疏水性氨基酸不被暴露于蛋白質(zhì)表面[22]；此外，明膠中豐富的親水性氨基酸殘基與蛋白質(zhì)表面的親水基團(tuán)相互作用，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)限制蛋白質(zhì)肽鏈的展開，并降低蛋白質(zhì)之間利用分子間疏水作用導(dǎo)致的蛋白質(zhì)聚集[23]。

2.1.4 Ca2+-ATP酶活性分析

肌球蛋白球狀頭部具有Ca2+-ATP酶活性，Ca2+-ATP酶活性可以反映凍融過程中肌原纖維蛋白完整性[24]。如圖4所示，在8 次凍融循環(huán)過程中，所有組別的Ca2+-ATP酶活性總體呈下降趨勢(shì)，但不同處理組間肌球蛋白的變性程度有所差異。其中，凍融8 個(gè)循環(huán)后，對(duì)照組的Ca2+-ATP酶活性損失最大，達(dá)到了49.4%。而添加0.5%、1%、2%明膠實(shí)驗(yàn)組和商業(yè)抗凍劑組的Ca2+-ATP酶活性分別損失了42.8%、31.2%、40.1%和18.0%。因此，明膠的添加能夠較為有效地保持凍融過程中肌球蛋白的完整性。

圖4 明膠添加量對(duì)不同凍融循環(huán)處理的魚糜肌原纖維蛋白Ca2＋-ATP酶活性的影響Fig. 4 Effect of gelatin on the Ca2+-ATPase activity of myofibril protein subjected to different freeze-thaw cycles

冷凍或凍融過程中，Ca2+-ATP酶活性的喪失主要與肌球蛋白球狀頭部的構(gòu)象變化及聚集有關(guān)。此外，凍融過程中蛋白質(zhì)間相互作用的蛋白質(zhì)重排以及體系離子強(qiáng)度的增強(qiáng)會(huì)使Ca2+-ATP酶活性喪失[25]。Ca2+-ATP酶活性與肌球蛋白頭部的巰基密切相關(guān)，肌球蛋白球狀頭部活性位點(diǎn)上反應(yīng)性巰基的氧化可能導(dǎo)致該區(qū)域Ca2+-ATP酶活性的降低[26]，這一結(jié)果與上述肌原纖維蛋白總巰基含量的變化一致。明膠的添加可以延緩魚糜肌球蛋白Ca2+-ATP酶活性的喪失，可能是通過明膠中大量的親水性氨基酸穩(wěn)定蛋白質(zhì)周圍的水合水分子從而維持肌球蛋白的完整性和Ca2+-ATP酶的活性。

2.1.5 羰基含量分析

在冷凍或凍融過程中，一些氨基酸（如賴氨酸、脯氨酸、組氨酸和精氨酸）被氧化形成羰基化合物[27]。由圖5可知，在凍融初期魚糜肌原纖維蛋白羰基含量基本保持不變，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)羰基含量整體呈明顯上升趨勢(shì)。凍融8 次循環(huán)后，對(duì)照組、添加0.5%、1%、2%明膠實(shí)驗(yàn)組和商業(yè)抗凍劑組的羰基含量分別增加了2.77、1.97、0.69、0.85 nmol/mg和1.32 nmol/mg；其中，1%的明膠處理組抑制肌原纖維蛋白的氧化能力顯著高于商業(yè)抗凍劑組和對(duì)照組。

圖5 明膠添加量對(duì)不同凍融循環(huán)處理的魚糜肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig. 5 Effect of gelatin on the carbonyl content of myofibril protein subjected to different freeze-thaw cycles

凍融過程中，大量細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成會(huì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成破壞，使得各促氧化劑得到釋放，進(jìn)一步促進(jìn)了蛋白質(zhì)氧化[28]。明膠的添加可能通過控制冰晶的生成，抑制其對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，從而延緩促氧化劑對(duì)蛋白質(zhì)氧化的作用。

2.1.6 SDS-PAGE分析

由圖6可知，SDS-PAGE上肌原纖維蛋白的成分主要包括肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC，約220 kDa）、肌動(dòng)蛋白鏈（約45 kDa）和原肌球蛋白鏈（tropomyosin，TM，約37 kDa）；此外還有一些顏色較淺的條帶，如100～135 kDa范圍內(nèi)的副肌球蛋白鏈，是典型的肌原纖維蛋白條帶分布[29-30]。與新鮮魚糜肌原纖維蛋白相比，凍融8 次后魚糜肌原纖維蛋白條帶具有明顯差異，主要表現(xiàn)在MHC條帶的減弱和副肌球蛋白條帶的增強(qiáng)。表明凍融處理導(dǎo)致魚糜肌原纖維蛋白中MHC發(fā)生一定程度的降解，魚糜在凍藏過程中主要是肌球蛋白發(fā)生了變性。而對(duì)比凍融8 次后的各組樣品可以觀察到對(duì)照組MHC條帶含量最低，發(fā)生降解程度較大。結(jié)果與蛋白溶解度、總巰基含量以及Ca2+-ATP活性等一致，表明一定量明膠的添加可以有效抑制肌球蛋白含量的下降，減緩凍融期間蛋白質(zhì)的降解。

圖6 凍融處理后魚糜肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig. 6 SDS-PAGE patterns of myofibril protein subjected to freeze-thaw treatment

2.2 明膠對(duì)凍融循環(huán)過程中魚糜動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性的影響

圖7 不同溫度掃描下魚糜凝膠的G’Fig. 7 G’ of surimi gels as a function of temperature

圖7顯示了魚糜中G’的溫度依賴性。同一溫度下，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，所有樣品的G’總體呈上升趨勢(shì)，表明經(jīng)過一定程度的凍融循環(huán)魚糜樣品的彈性有所增加，魚糜變得更硬。這可能是由于冷凍過程中肌原纖維蛋白容易發(fā)生變性，表面疏水性增加，蛋白質(zhì)分子間通過二硫鍵和離子鍵等相互作用發(fā)生交聯(lián)聚集[31-32]，導(dǎo)致魚糜變硬。此外，反復(fù)凍融導(dǎo)致魚糜機(jī)械結(jié)構(gòu)的破壞造成水分大量流失，也可能是魚糜變硬的原因之一。其中，對(duì)照組魚糜樣品的G’變化最大，經(jīng)過8 次凍融循環(huán)后對(duì)照組樣品G′較初始值上升93.7%（80 ℃），而添加0.5%、1%、2%明膠實(shí)驗(yàn)組和商業(yè)抗凍劑組分別增長(zhǎng)65.1%、64.1%、67.6%和41.6%。因此，明膠的添加能夠有效延緩魚糜硬化。明膠具有抑制冰晶形成和穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的能力，從而能在一定程度上延遲蛋白質(zhì)變性和分子間交聯(lián)。

2.3 明膠對(duì)凍融循環(huán)過程中魚糜凝膠特性的影響

2.3.1 凝膠強(qiáng)度分析

在長(zhǎng)期冷凍貯藏或凍融過程中，魚類蛋白質(zhì)很容易受到冷凍誘導(dǎo)變性的影響，進(jìn)而降低凝膠形成能力[33]。凍融過程中魚糜凝膠的相對(duì)凝膠強(qiáng)度能夠反映魚糜凝膠的形成能力。由圖8可知，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度整體呈下降趨勢(shì)，凍融循環(huán)顯著降低了魚糜凝膠的形成能力。凍融循環(huán)8 次后，添加0.5%、1%、2%明膠的實(shí)驗(yàn)組和商業(yè)抗凍劑組的凝膠強(qiáng)度分別為未凍融處理組凝膠強(qiáng)度的77.8%、82.1%、81.3%和80.86%；而對(duì)照組的凝膠強(qiáng)度最低，為67.0%。

圖8 凍融循環(huán)過程中明膠對(duì)魚糜凝膠強(qiáng)度的影響（n＝3）Fig. 8 Effect of gelatin on surimi gel strength during freeze-thaw cycles (n = 3)

明膠的添加有效抑制了魚糜蛋白凝膠形成能力的下降，這得益于明膠中的大量親水性氨基酸等活性成分與蛋白質(zhì)外層相互作用，抵抗凍融過程對(duì)魚糜蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，延緩魚糜蛋白冷凍變性。此外，明膠蛋白與魚糜蛋白的相互作用、蛋白質(zhì)與內(nèi)在水分的相互作用等也可能對(duì)魚糜凝膠的形成和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起到了積極作用[15]。此前也有研究表明，肌球蛋白的完整性與魚糜肌球蛋白凝膠化有著密切的聯(lián)系[14]，而肌球蛋白球狀頭部的Ca2+-ATP酶活性又是反映肌球蛋白完整性的主要指標(biāo)。在本研究中，魚糜凝膠強(qiáng)度隨凍融循環(huán)變化的下降趨勢(shì)與Ca2+-ATP酶活性的變化一致。

2.3.2 凝膠持水性分析

魚糜凝膠持水性的下降表明魚糜凝膠結(jié)構(gòu)中水的穩(wěn)定性降低和流動(dòng)性增加[34]，因此魚糜凝膠的持水性可以反映凝膠結(jié)構(gòu)的強(qiáng)弱及其穩(wěn)定性。如圖9所示，在未凍融的新鮮魚糜中，添加明膠實(shí)驗(yàn)組魚糜凝膠的持水性高于對(duì)照組和商業(yè)抗凍劑組，明膠具有豐富的親水基團(tuán)，可以將魚糜凝膠中的游離水轉(zhuǎn)化為結(jié)合水，從而提高魚糜凝膠的持水性[35]。在整個(gè)凍融過程中除了商業(yè)抗凍劑組，其余處理組魚糜凝膠持水性都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；經(jīng)過8 次凍融循環(huán)后，對(duì)照組魚糜凝膠持水性顯著下降（P＜0.05），而添加1%、2%明膠實(shí)驗(yàn)組和商業(yè)抗凍組在整個(gè)凍融過程中持水性變化差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果與魚糜凝膠強(qiáng)度的變化趨勢(shì)一致。

圖9 凍融循環(huán)過程中明膠對(duì)魚糜凝膠持水性的影響（n＝3）Fig. 9 Effect of gelatin on the WHC of surimi gel during freeze-thaw cycles (n = 3)

2.3.3 魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析

圖10 凍融循環(huán)過程中明膠對(duì)魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig. 10 Effect of gelatin on the microstructure of surimi gel during freeze-thaw cycles

如圖10所示，新鮮未凍融魚糜凝膠表面呈現(xiàn)光滑致密的結(jié)構(gòu)，隨著凍融次數(shù)的增加，魚糜凝膠表面變得粗糙，凝膠孔隙逐漸增大，蛋白聚集形成團(tuán)簇。這可能是由于凍融處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，嚴(yán)重影響其凝膠形成能力。相比于對(duì)照組凝膠樣品，8 次凍融后添加商業(yè)抗凍劑和明膠的組別凝膠孔隙分布較為均勻，蛋白質(zhì)聚集程度相對(duì)較小，反映了凍融處理對(duì)其凝膠形成能力的影響較小。通過對(duì)凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察進(jìn)一步直觀反映了明膠對(duì)魚糜在凍融過程中的低溫保護(hù)作用。

2.4 差示掃描量熱分析

由圖11可知，未凍融處理前，與對(duì)照組相比，添加明膠組的肌原纖維蛋白的峰值溫度從47.9 ℃增加至58.3 ℃，表明明膠與肌原纖維蛋白間存在一定的非共價(jià)相互作用[36]。經(jīng)3 次凍融循環(huán)后，對(duì)照組與明膠組的肌原纖維蛋白變性溫度均增大，這可能是由于凍融過程中巰基含量增加，表面疏水性增強(qiáng)，蛋白質(zhì)氧化修飾導(dǎo)致肌原纖維蛋白發(fā)生一定程度的交聯(lián)[37]。明膠組肌原纖維蛋白熱變性峰值溫度均明顯高于對(duì)照組，表明明膠與肌原纖維蛋白之間的相互作用增強(qiáng)。楊玉玲等[38]的研究結(jié)果表明，疏水相互作用可能是維持高溫條件下明膠與肌原纖維蛋白的主要作用力。這一結(jié)果與魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的結(jié)果一致。

圖11 明膠-肌原纖維蛋白復(fù)合物的差示掃描量熱曲線Fig. 11 Differential scanning calorimetry curves of gelatin-myofibrillar protein complex

3 結(jié) 論

魚鱗明膠的添加能夠有效抑制凍融期間魚糜肌原纖維蛋白的氧化和變性，8 次凍融后，魚糜肌原纖維蛋白溶解度、總巰基含量和Ca2+-ATP酶活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），具有較低的表面疏水性和羰基含量，其動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性、凝膠強(qiáng)度和持水性均優(yōu)于對(duì)照組；其中，添加1%明膠魚糜實(shí)驗(yàn)組在抑制蛋白質(zhì)氧化、凝膠強(qiáng)度與持水性方面均優(yōu)于商業(yè)抗凍劑組，但明膠對(duì)魚糜的整體冷凍保護(hù)能力仍不及商業(yè)抗凍劑組。因此，未來的研究應(yīng)聚焦于明膠的修飾改性以進(jìn)一步提高其抗凍能力。