喬 蕾 李 曼 王雪飛 劉 萍

（德州市婦幼保健院，德州 253000）

子癇前期是妊娠性特異性疾病，臨床主要表現是蛋白尿和血壓升高，對圍產兒和孕產婦的生命安全具有嚴重的威脅[1，2]。正常的妊娠會伴有輕度的全身炎癥反應，而子癇前期通常伴有嚴重的炎癥反應，且子癇前期孕婦免疫耐受及機體免疫平衡嚴重失調，導致炎癥因子大量產生，加快子癇前期疾病的發(fā)生及發(fā)展進程[3-4]。黃芩苷可抑制核因子κB（NF-κB）蛋白表達，減輕炎癥反應[5]。磷酸肌醇三激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt/PKB）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是重要的自噬通路，在機體炎癥反應中具有重要作用，研究顯示PI3K/Akt 信號通路的激活可能與 NF-κB 信號通路的抑制存在直接或間接的關系[6-7]，推測黃芩苷有可能通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路進而抑制炎癥反應。本文探討黃芩苷通過PI3K/Akt/mTOR通路對子癇前期大鼠免疫狀態(tài)及炎癥反應的調控及機制。

1 材料和材料

1.1 動物與材料

取SPF級SD大鼠60只，3~4月齡，雌性36只，體質量（180±20）g，雄性24只，體質量（280±20）g，動物許可證號（SYXK（京）2019-0054）。黃芩苷注射液（美國 Sigma-Aldrich公司）；L-精氨酸甲酯（南京奧多福生物技術有限公司）。

1.2 模型的建立、分組與給藥方案

將雌雄大鼠同籠飼養(yǎng)，每天進行陰道涂片，當涂片上有陰道上皮細胞和精子時記為妊娠第1天。將36只雌性大鼠隨機分為對照組、模型組和處理組，每組12只。處理組和模型組大鼠妊娠13~21 d時給予L-精氨酸甲酯，皮下注射，給藥劑量為100 mg/kg，對照組大鼠皮下注射等量的生理鹽水，連續(xù)給藥至妊娠21 d；處理組大鼠于妊娠17~21 d 時給予黃芩苷注射液，腹腔注射，給藥劑量為 100 mg·kg-1·d-1），同時對照組和模型組大鼠均給予等量的生理鹽水，3組均持續(xù)給藥至妊娠21 d。

1.3 取大鼠腹主動脈血和胎盤

妊娠21 d時，采用電腦尾袖式血壓計測定各組大鼠的血壓，然后麻醉大鼠，取大鼠腹主動脈血，離心后取上清液備用；然后取出大鼠完整胎盤，備用。

1.4 測定血清尿素氮水平

采用全自動生化分析儀測定各組大鼠血清中尿素氮（BUN）水平。

1.5 炎癥因子水平的測定

采用酶聯免疫吸附法，測定大鼠血清中胎盤組織中炎癥因子白細胞介素（IL）-6、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，試劑盒購于羅氏生物檢測應用公司。

1.6 用BCA法測定大鼠胎盤組織勻漿中蛋白含量

將大鼠胎盤組織研磨，加蛋白酶抑制劑的裂解液進行裂解，于3 500 r/min、4℃離心15 min。取上清液，采用BCA法測定大鼠胎盤組織勻漿中蛋白含量，采用SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，將目的條帶分離出，胎牛血清封閉2 h，加入相應一抗孵育一夜，PBST洗滌3次，加入熒光二抗孵育2 h，PBST洗滌，化學發(fā)光法顯影，測定灰度值變化。然后用相應試劑盒測定勻漿中Akt、mTOR蛋白含量和尿蛋白水平和炎癥介質NF-κB和IκB-α蛋白表達水平，β-actin為內參，免疫熒光成像系統顯示灰度值，用Image J圖像軟件計算灰度值。

1.7 采用RT-qPCR法測定大鼠胎盤組織中α7nAChR RNA表達水平

將胎盤組織研磨，根據RNeasy mini試劑盒操作說明提取總RNA，采用分光光度計法測定組織中RNA濃度，取部分總RNA，加入RNA模 板，反 轉 錄 為cDNA，RT-qPCR實 驗 采用QuantiFast SYBR Green PCR Kit。β-actin為 內參，α7nAChR引 物 序 列 （5'-3'）：CTCACAGCAT- GCAATCCAAGTACACTA（F），CAGGACCGAAGGCTAAAAGAGCA（R）；β-actin引 物 序 列 （5'-3'）：CCGGAGCTTCACCAATTGACACA（F），CAGACGCAGGAGCAGTTAATCA（R）。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變形10 s，60℃退火/延伸30 s，進行40循環(huán)，數據分析采用公式2-ΔΔCt計算α7nAChR RNA相對表達水平。

1.8 采用流式細胞儀測定大鼠全血中T淋巴細胞的比例

大鼠眼眶取血1.5 mL至潤有肝素鈉的管中，加入等體積Hanks液稀釋，加入3 mL淋巴細胞分離液，2 000 r/min離心20 min，將交界處的單個核細胞吸取出來，加入3 mL Hanks液，混勻，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入1640培養(yǎng)基重懸，根據細胞數量調整細胞濃度，加入到24孔板中，5×105細胞/孔，然后加入1640培養(yǎng)基至1 mL，加20 μL FITC標記的各因子抗體，避光室溫孵育30 min，加1%BAS-PBS液進行洗滌，稀釋至300 μL后移入到試管中，采用BD-FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）進行分析。

1.9 統計學處理

采用SPSS 22統計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血壓、尿蛋白和BUN水平

模型組大鼠舒張壓、收縮壓、BUN和尿蛋白水平顯著高于對照組（P＜0.05），處理組舒張壓、收縮壓、BUN和尿蛋白水平與模型組相比均顯著降低（P＜0.05）（表1）。

2.2 各組大鼠炎癥因子水平

模型組大鼠血清中和胎盤中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著高于對照組（P＜0.05），處理組IL-6、IL-1β和TNF-α水平與模型組相比均顯著降低（P＜0.05）（表2）。

2.3 各組大鼠Akt和mTOR蛋白表達水平

模型組大鼠Akt和mTOR蛋白表達水平顯著低于對照組（P＜0.05），處理組Akt和mTOR蛋白表達水平與模型組相比均顯著升高（P＜0.05）（圖1，表4）。

表1 各組大鼠血壓、BUN和尿蛋白水平（n=12，±s）

表1 各組大鼠血壓、BUN和尿蛋白水平（n=12，±s）

*P＜0.05 vs對照組；#P＜0.05 vs模型組

組別 舒張壓（mmHg） 收縮壓（mmHg） BUN（mmol/L） 尿蛋白（mg/mL）對照組 71.45±9.53 106.58±11.24 4.21±0.48 3.25±0.39模型組 155.57±12.58* 203.58±12.44* 13.02±0.74* 9.70±1.04*處理組 71.63±12.02# 107.48±11.48# 4.67±0.45# 3.54±0.35#

表2 各組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平（n=12，±s，pg/mL）

表2 各組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平（n=12，±s，pg/mL）

*P＜0.05 vs對照組；#P＜0.05 vs模型組

組別 IL-6 IL-1β TNF-α對照組 43.58±7.44 164.34±23.45 101.29±12.42模型組 99.38±12.59* 275.83±32.00* 198.48±11.55*處理組 59.48±9.56# 189.57±29.57# 135.67±12.52#

表3 各組大鼠胎盤組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平（n=12，±s，pg/mL）

表3 各組大鼠胎盤組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平（n=12，±s，pg/mL）

*P＜0.05 vs對照組；#P＜0.05 vs模型組

組別 IL-6 IL-1β TNF-α對照組 6.03±0.98 21.05±4.25 5.03±0.92模型組 20.19±2.48* 39.55±5.01* 15.34±2.44*處理組 10.48±1.97# 25.49±3.29# 7.35±2.22#

圖 1 各組大鼠Akt和mTOR蛋白表達水平

表4 各組大鼠Akt和mTOR蛋白表達水平（n=12，±s）

表4 各組大鼠Akt和mTOR蛋白表達水平（n=12，±s）

*P＜0.05 vs對照組比較；#P＜0.05 vs模型組

組別 Akt mTOR對照組 1.20±0.22 1.12±0.21模型組 0.47±0.08* 0.46±0.09*處理組 0.85±0.09# 0.89±0.10#

2.4 各組大鼠炎性介質NF-κB和IκB-α蛋白表達水平

模型組大鼠NF-κB和IκB-α蛋白表達水平顯著高于 對照組（P＜0.05），處理組NF-κB和IκB-α蛋白表達水平與模型組相比均顯著降低（P＜0.05）（圖2，表5）。

圖 2 各組大鼠炎性介質NF-κB和IκB-α蛋白表達水平

表5 各組大鼠炎性介質NF-κB和IκB-α蛋白表達水平 （n=12，±s）

表5 各組大鼠炎性介質NF-κB和IκB-α蛋白表達水平 （n=12，±s）

*P＜0.05 vs對照組；#P＜0.05 vs模型組

組別 NF-κB IκB-α對照組 0.32±0.07 0.28±0.08模型組 1.25±0.21* 0.98±0.12*處理組 0.63±0.11# 0.34±0.07#

2.5 各組大鼠胎盤組織中α7nAChR RNA表達水平

模型組與對照組胎盤組織中α7nAChR RNA表達水平相當（P＞0.05）；研究組大鼠胎盤組織中α7nAChR RNA表達水平（6.65±0.91）顯著高于模型組（2.02±0.61）和對照組（1.53±0.67）（P＜0.05）。

2.6 各組大鼠血中免疫功能參數水平

結果顯示（表6），模型組大鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水 平 均 顯 著 高 于 對 照 組（P＜0.05），CD8+水平顯著低于對照組（P＜0.05）；處理組大鼠與模型組相比，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均顯著降低（P＜0.05），CD8+水平顯著升高（P＜0.05）。

3 討論

子癇前期主要癥狀是水腫、蛋白尿和高血壓[8，9]。黃芩苷屬于天然植物藥，對子癇前期大鼠胎盤中的滋養(yǎng)層細胞的凋亡具有抑制作用，且可調節(jié)X-連鎖凋亡，進而對蛋白的表達起到抑制作用，并降低caspase-9的表達，改善線粒體超微結構，達到治療子癇前期的作用[10]。本研究結果顯示，子癇前期模型大鼠舒張壓、收縮壓、BUN和尿蛋白水平均明顯高于對照組，而處理組舒張壓、收縮壓、BUN和尿蛋白水平與模型組相比均顯著降低，提示黃芩苷可以降低子癇前期大鼠舒張壓、收縮壓、BUN和尿蛋白水平。

表6 各組大鼠CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平（n=12，±s）

表6 各組大鼠CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平（n=12，±s）

*P＜0.05，與對照組比較；#P＜0.05，與模型組比較。

組別 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+對照組 56.38±2.43 31.19±1.87 22.25±1.74 1.45±0.06模型組 67.03±2.64* 49.33±1.64* 18.45±1.54* 2.65±1.00*處理組 60.44±2.53# 39.42±2.01# 21.38±1.64# 1.87±0.32#

子癇前期大鼠伴有嚴重的全身炎癥反應，包括內皮細胞和白細胞的激活，且有大量中性粒細胞活化，介導機體炎癥反應。過度的炎癥反應會損傷胚胎組織滋養(yǎng)細胞，并降低其浸潤能力，進而過度凋亡，且會損傷血管內皮，誘導促炎因子、細胞因子和細胞黏附因子等大量分泌，造成嚴重的炎癥反應，使子癇前期大鼠胎盤缺氧缺血造成的損傷進一步加重，造成胎盤組織血流灌注嚴重不足，使細胞損傷及凋亡加速，導致各臟器血流灌注均降低，加速子癇前期疾病的發(fā)生發(fā)展進程，出現蛋白尿、高血壓等 癥 狀[11-12]。IL-6、IL-1β和TNF-α在 子 癇 前 期 的炎癥反應中起到重要作用，可用于反映子癇前期嚴重程度[13-14]。以往研究結果顯示，子癇前期大鼠給予MgSO4治療可以降低炎癥因子IL-1β和TNF-α水平，給予抗炎細胞因子IL-10可以改善尿蛋白排泄和血壓，給予免疫抑制劑治療可以減輕炎癥反應、改善癥狀。這些研究結果顯示抑制子癇前期大鼠炎癥反應可以有效改善臨床癥狀[15]。NF-κB是細胞中廣泛存在的一種蛋白因子，其家族中p65亞單位具有重要的促炎作用，可激活多種炎癥因子，IL-1和TNF-α是NF-κB的 靶 基 因 和 激 動 劑，NF-κB激 活后會促進IκB-α表達，IκB-α又會轉移至細胞質形成負反饋調節(jié)[16]。巨噬細胞上的α7nAChR可與胎盤內源性釋放的乙酰膽堿結合抑制細胞因子產生，α7nAChR對NF-κB途徑具有一定的控制作用[17]。

PI3K是磷脂酰肌醇激酶，同時具有絲/蘇氨酸激酶和磷脂酰肌醇激酶活性，在細胞內信號轉導中具有重要作用。正常條件下，PI3K在細胞內表達量較少，而當細胞受損時，細胞因子、生長因子和激素等細胞外信號分子被激活，促使PI3K表達上調。Akt是PI3K下游信號分子，在PI3K/Akt/mTOR通路中處于核心地位，PI3K激活后會產生第二信使PIP3，進而使Akt完全活化，活化后的Akt會轉移至細胞核或細胞質內，對其下游靶分子進行調控。mTOR屬于磷脂酰肌醇激酶相關的激酶家族，多條信號通路匯聚于此，激活后的Akt進一步激活mTOR，然后繼續(xù)調控其下游靶蛋白，發(fā)揮生物學效應。PI3K/Akt/mTOR通路在細胞凋亡、增殖及血管生成等過程具有重要的作用，有研究顯示通過降低Akt水平和mTOR水平即抑制PI3K/Akt/mTOR通路可以抑制滋養(yǎng)細胞的侵襲能力，降低血管生成能力[18]。而黃芩苷對該信號通路具有促進作用，進而改善胎盤滋養(yǎng)層細胞侵襲能力和血管生成能力[19-20]。本研究結果顯示，處理組IL-6、IL-1β、TNF-α水 平 和NF-κB、IκB-α蛋 白 表 達 水平與模型組相比均顯著降低，處理組大鼠胎盤組織中α7nAChR RNA表達水平顯著高于模型組和對照組，處理組Akt和mTOR蛋白表達水平與模型組相比均顯著升高。另有研究顯示，PI3K/Akt 信號通路的激活可能與 NF-κB 信號通路的抑制存在直接或間接的關系[7]，提示黃芩苷可以上調Akt和mTOR表達水平，促進PI3K/Akt/mTOR信號通路，降低血管內皮損傷，改善血管內皮功能，從而降低炎性反應。

子癇前期大鼠伴有免疫功能失調，機體正常條件下CD4+/CD8+處于穩(wěn)態(tài)平衡，免疫失調時，該平衡會被打破[21]。NF-κB的活化與機體免疫有密切關系，其在T細胞的活化和樹突狀細胞的抗原呈遞方面具有重要的參與作用。樹突狀細胞大量表達IκB-α后會對NF-κB的活性起到抑制作用，引發(fā)免疫耐受[22-23]。mTOR信號途徑在維持T細胞的生長及其活化、分化及代謝等生理過程發(fā)揮作用，活化的T細胞可刺激信號CD28，進而活化PI3K/Akt/mTOR信號通路，而黃芩苷可促進該信號通路，進而提高機體免疫功能[24，25]。本研究結果顯示，處理組大鼠與模型組相比，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均顯著降低，CD8+水平顯著升高，提示黃芩苷可通過促進PI3K/Akt/mTOR信號通路提高子癇前期大鼠機體免疫功能。

綜上，黃芩苷可以通過促進PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制機體炎癥反應，改善機體免疫功能。