★ 丘花花 李海兵 楊金火(.鷹潭一八四醫(yī)院 江西 鷹潭 335000;.江西康恩貝天施康藥業(yè)有限公司 江西 鷹潭 335000)
蓮子心來源于睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的成熟種子中的干燥幼葉及胚根,功效清心安神、交通心腎、澀精止血。用于熱入心包,神昏譫語,失眠遺精,心腎不交,血熱吐血[1]。主要含有生物堿類[2-3]、黃酮、甾醇、揮發(fā)油等成分[4]。其原植物蓮為多年生水生草本,廣布于我國南北各地[5],研究采用藥材來源于蓮子心主產(chǎn)區(qū)江西廣昌,以保證產(chǎn)品療效。
中藥配方顆粒是由中藥飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒而成,在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下,經(jīng)臨床處方調(diào)配、使用。中藥配方顆粒在保留傳統(tǒng)湯劑辨證論治、隨證加減的基礎(chǔ)上,同時具有制備、攜帶、服用、儲存等多方面的優(yōu)勢[6]?,F(xiàn)代臨床及藥理研究顯示,中藥配方顆粒在成分保留、藥理藥效、臨床療效等方面優(yōu)于傳統(tǒng)湯劑或基本相當[7-9]。本文對蓮子心配方顆粒制備工藝及其質(zhì)量標準的研究,為企業(yè)進入配方顆粒市場提供技術(shù)參考。
Agilent 1200 高效液相色譜儀(美國Agilent 科技)、Dikma-C18(250 mm×4.6 mm)色譜柱(北京迪馬科技有限公司)、AB265-S 分析天平(METTLER TOLEDO)、DZF-6050 型減壓干燥箱(太倉精宏)、KQ3200DE 型數(shù)控超聲儀(昆山市超聲儀器)、蓮心堿高氯酸鹽對照品(批號:111696-201502,中檢院)、蓮子心對照藥材(批號:121423-200702,中檢院)、蓮子心飲片(批號:YZ-150901,安徽紀淞堂中藥飲片有限公司,經(jīng)江西省藥檢院袁桂平老師鑒定)、乙腈(TEDIA Company)。
2.1.1 提取工藝考察 采用水煎煮法提取蓮子心飲片,設(shè)定考察指標:蓮心堿轉(zhuǎn)移率。考察加水量(A)、煎煮時間(B)、煎煮次數(shù)(C)3 個因素。見表1。取蓮子心飲片18 份,每份約50 g,按L9(34)正交表的方案試驗,計算蓮心堿轉(zhuǎn)移和方差分析。見表2、表3。
表1 正交試驗因素水平表
表2 蓮子心提取正交試驗結(jié)果(n=2)
表3 蓮子心蓮心堿轉(zhuǎn)移率方差分析
因素B、C 對蓮心堿轉(zhuǎn)移率有顯著性影響,結(jié)合實際大生產(chǎn),確定提取工藝為A1B3C2,即水煎煮2 次,每次1.5 h,加水量為8 倍量飲片。
2.1.2 提取工藝驗證 取蓮子心飲片3 份,每份約50 g,按照選定的工藝進行驗證,測得3 份樣品蓮心堿轉(zhuǎn)移率分別為31.0%、31.4%、32.6%,均值31.67%,RSD為2.63%,說明提取工藝重現(xiàn)性較好。
2.1.3 濃縮、干燥工藝考察 試驗對濃縮溫度進行了考察,結(jié)果顯示,60 ℃和80 ℃濃縮對蓮心堿含量沒有影響,折算為藥材里的含量分別為0.91 mg/g和0.90 mg/g,由于80 ℃濃縮效率更高,故選擇80 ℃,真空度-0.06 MPa 至-0.08 MPa 條件下濃縮。干燥選擇80 ℃,-0.1 MPa 條件下帶式干燥。
2.1.4 制粒工藝考察 蓮子心配方顆粒成型工藝采用一步干法制粒,以干法制粒一次性成型率、顆粒流動性(豪斯納比)、吸濕性(65%相對濕度和93%相對濕度)、溶化性為考察指標,對影響蓮子心配方顆粒干法制粒的輔料、干膏粉比例、干法制粒參數(shù)進行考察。
2.1.4.1 輔料的選擇 比較可溶性淀粉、糊精對蓮子心干法制粒的影響,取蓮子心干膏粉、糊精、可溶性淀粉分別按照1∶1∶1 的比例,設(shè)置參數(shù):壓力8 kg/cm2,擠壓速度10 r/min,送料速度10 r/min。
兩種輔料制粒的一次成型率、吸濕率、顆粒流動無明顯差別,考慮到成本問題,生產(chǎn)選用糊精作為蓮子心配方顆粒干法制粒的輔料。見表4。
表4 輔料選擇結(jié)果
2.1.4.2 糊精干膏粉比例選擇 分別按不同輔料比加入干膏粉,設(shè)置制粒參數(shù)為:壓力8 kg/cm2,擠壓速度10 r/min,送料速度10 r/min。
可知,隨著糊精比例降低,成型率升高,同時流動性更差和吸濕性更強,故根據(jù)實際情況選擇30%~50%的輔料,更有利于產(chǎn)品分裝和保存。見表5。
表5 輔料比例選擇結(jié)果
2.1.4.3 制粒參數(shù)的選擇 按照輔料30%的比例,考察擠壓壓力、擠壓速度、送料速度對制粒的影響。試驗1 壓力不夠出現(xiàn)裂片,試驗4 壓力太大片子開始變黑,試驗2、3、5 制粒參數(shù)較合適,壓片能成型又無明顯變色。隨著擠壓速度和送料速度增加,一次性成型率提高,顆粒吸濕性變化不明顯,暫定干法制粒參數(shù):壓力6~10 kg/cm2,送料速度8~10 r/min,擠壓速度8~10 r/min。見表6。
表6 干法制粒工藝考察結(jié)果
2.2.1 薄層色譜鑒別 取本品2 g,加甲醇30 mL,超聲處理30 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇1 mL溶解,作為供試品溶液。取蓮子心對照藥材2 g,加水30 mL 回流提取1 h,濾過,濾液蒸干,自“加甲醇30 mL”起,同法制成對照藥材溶液。另取蓮心堿高氯酸鹽對照品,用甲醇制成濃度1 mg/mL 溶液,作為對照品溶液。取糊精0.2 g,同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗,分別吸取上述溶液各5 μL,分別點于同一硅膠G 薄層板上,展開劑為三氯甲烷-乙酸乙酯-二乙胺(5∶4∶1),展開,取出晾干,噴稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中,在與對照藥材色譜及對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點,陰性對照無干擾。見圖1。
圖1 蓮子心配方顆粒的TLC圖
2.2.2 檢查 按《中國藥典》2020年版四部通則0104 顆粒劑項下的有關(guān)規(guī)定,對本品3 批樣品的粒度、水分、溶化性、裝量差異、微生物限度等進行檢查。測得3 批樣品粒度分別為:7.3%、6.6%、6.4%,水分分別為4.1%、3.7%、4.4%,3 批顆粒粒度、水分、溶化性、裝量差異、微生物限度均符合規(guī)定。
2.2.3 含量測定
2.2.3.1 含量測定方法 (1)色譜條件:色譜柱為Dikma- C18(250 mm×4.6 mm);流動相為乙腈-0.015 mol/L 十二烷基磺酸鈉溶液-冰醋酸(56∶43∶1);檢測波長282 nm。
(2)對照品溶液的制備:取蓮心堿高氯酸鹽對照品,加甲醇制成每1 mL 含25 μg 的溶液,即得。
(3)供試品溶液的制備:取本品約1.0 g,精密稱定,精密加入2%鹽酸甲醇溶液25 mL,稱定重量,回流30 min,放冷,再稱定重量,用2%鹽酸甲醇溶液補足重量,搖勻,濾過,精密量取濾液5 mL,置10 mL 量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,即得。
(4)陰性對照溶液的制備:取糊精0.2 g,同法制備成陰性對照溶液,即得。
(5)測定法:分別精密吸取上述溶液各10 μL,檢測、分析。
2.2.3.2 專屬性試驗 按照選定的方法分別制備供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液,按照以上色譜條件,分別進樣,結(jié)果顯示,目標成分分離度良好,陰性無干擾。見圖2。
圖2 蓮子心配方顆粒HPLC圖譜
2.2.3.3 線性與范圍 精密稱取蓮心堿高氯酸鹽對照品,用甲醇配制成濃度為0.033 76 mg/mL 的對照品溶液。吸取上述對照品溶液,照選定的色譜方法,分別進樣2.5,5,10,20,30 μL,進行RP-HPLC 分析,測得峰面積分別為63.4、126.6、239.0、478.3、721.7,以蓮心堿高氯酸鹽峰面積(Y)為縱坐標,進樣量(X)為橫坐標,繪制標準曲線:Y=706.7X+3.645,r=0.999 0。表明蓮心堿高氯酸鹽在0.084 4 μg~1.012 8 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.2.3.4 儀器精密度試驗 取蓮子心配方顆粒,依據(jù)選定的方法制備供試品溶液,連續(xù)檢測分析6 次,測得蓮心堿高氯酸鹽峰面積分別為146.0、145.9、145.9、145.8、145.5、145.9,RSD為0.12%(n=6)。說明儀器精密度良好。
2.2.3.5 重復(fù)性試驗 取蓮子心配方顆粒,依據(jù)選定的方法制備6 份供試品溶液,檢測分析,測定6 份樣品含量分別為0.78、0.78、0.76、0.77、0.78、0.77 mg/g,平均含量為0.77 mg/g,RSD為0.82%(n=6)。
2.2.3.6 回收率試驗 取已知蓮心堿含量的蓮子心配方顆粒,共6 份,精密稱定,分別按表7加入對照品,自“精密加入2%鹽酸甲醇溶液25 mL”起同供試品制備方法制備樣品,按選定的色譜方法進行操作與分析,測定蓮心堿的含量,計算6 份樣品中蓮心堿的加樣回收率均值為98.46%,RSD=1.42%,說明該方法準確性好。見表7。
表7 加樣回收率試驗
2.2.3.7 成品含量測定 取蓮子心配方顆粒,依據(jù)選定的方法制備供試品溶液,并以選定的色譜條件檢測,測得三批蓮子心配方顆粒蓮心堿含量分別為0.77、0.79、0.76 mg/g。
生物堿為蓮子心的主要藥效成分,現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)蓮子心中蓮心堿具有較好的抗炎[10]、降壓[11]、抗心律失常[12]、抗氧化[13]、抗腫瘤[14]以及抑制血小板聚集[15]等作用,試驗以蓮心堿為蓮子心配方顆粒的指標成分優(yōu)化了其制備工藝,優(yōu)化后的工藝穩(wěn)定可行。同時建立了成品的質(zhì)量控制方法,其中蓮心堿含量測定方法經(jīng)驗證,專屬性、精密度、準確度、線性與范圍均符合相關(guān)要求。成品三批數(shù)據(jù)穩(wěn)定,鑒于產(chǎn)品批次較少,暫定本品含蓮心堿不得少于0.50 mg/g。
綜上,優(yōu)化后的蓮子心配方顆粒制備工藝穩(wěn)定,質(zhì)量控制方法可操作性強,可為配方顆粒企業(yè)生產(chǎn)和檢驗提供參考。