栗 寧，周景明，王愛萍

(鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450001)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是豬的一種烈性病毒病，其臨床癥狀主要有發(fā)熱、出血、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂等，病死率可達100%，危害十分嚴重。1921年，該病首次暴發(fā)于非洲肯尼亞，目前該病已經(jīng)在整個非洲、歐洲、南美洲等多個國家和地區(qū)蔓延，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。2018年我國報道了首例ASF[1]，之后在全國范圍內(nèi)迅速蔓延，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的打擊。在沒有有效的疫苗或防控措施的情況下，不得不用撲殺豬來控制疫情的暴發(fā)，據(jù)報道，在2018年-2019年間有超過3 000萬頭豬被撲殺，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了近20億美元的經(jīng)濟損失。ASF被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報告的動物疫病[2]。

ASF的致病病原是非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)。ASFV可感染家豬、野豬、叢林豬等。病豬及隱性帶毒野豬是該病的傳染源，而軟蜱是ASFV的重要傳播媒介。ASFV屬于非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfarvirus)的唯一成員，是一種巨大且復(fù)雜的DNA病毒，其基因組是單股雙鏈線性DNA，長度約180 kb，包含151～167個開放閱讀框(open reading frames，ORFs)，病毒粒子為正20面體結(jié)構(gòu)，直徑約260 nm。病毒基因組核心的外圍包裹著三層膜結(jié)構(gòu)，分別為兩側(cè)的脂質(zhì)膜，以及中間的蛋白衣殼[1,3]。

1 ASFV p72蛋白B細胞表位的研究進展

2019年Wang N等人[4]利用冷凍電鏡三維重建技術(shù)，首次解析了ASFV的衣殼結(jié)構(gòu)，其衣殼由17 280個蛋白質(zhì)組成，包括主要衣殼蛋白(p72)和次要衣殼蛋白(M1249L，p17，p49和H240R)，次要的衣殼蛋白在衣殼下方形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，將相鄰的衣殼蛋白聚集在一起來穩(wěn)定衣殼結(jié)構(gòu)。該項工作為ASFV的組裝機制及感染機制的研究提供了重要的數(shù)據(jù)支撐。

ASF是一種高度傳染性和致死性的豬病毒性疾病，在沒有有效的ASF疫苗的情況下，ASF診斷產(chǎn)品的研發(fā)成為了當(dāng)前的研究熱點之一，可靠的實驗室診斷和嚴格的生物安全管控對于該病的預(yù)防和控制至關(guān)重要。在結(jié)構(gòu)蛋白中，p72、p30和p54被證明具有高度免疫原性及抗性[5]，雖然其產(chǎn)生的中和抗體不足以對機體產(chǎn)生足夠的保護，但卻可以成為ASF檢測和監(jiān)控的候選靶標。

p72蛋白是ASFV的主要衣殼蛋白，由B646L基因編碼，大小約72 ku，據(jù)報道p72蛋白具有構(gòu)象中和表位，它能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體[5]，是檢測試劑及疫苗開發(fā)的重要靶標[6]。

Phillips M E等人[7]利用豬多抗血清和抗p72的單克隆抗體(mAb)鑒定出p72的B細胞表位，首先利用原核表達系統(tǒng)制備了p72蛋白N-端1-345 aa的5個重疊多肽。利用間接ELISA和Western blot鑒定了單克隆抗體、豬多抗血清與重疊多肽的反應(yīng)。利用多抗血清鑒定出2個p72的B細胞表位區(qū)域，分別是1-83 aa、250-280 aa；利用抗p72單克隆抗體鑒定出3個p72的B細胞表位區(qū)域，分別為100-171 aa、180-250 aa、280-345 aa。最終用寡肽進行精細定位鑒定出6個不同的線性表位，分別為280-289 aa、295-303 aa、160-165 aa、250-255 aa、165-171 aa、275-280 aa。這些表位的精確定位有助于開發(fā)檢測抗ASFV抗體的ELISA試劑盒。

Rowland等人[8]利用桿狀病毒表達了p72蛋白N-端殘基20-303 aa，并用該重組蛋白免疫小鼠，通過細胞融合技術(shù)制備了29株單克隆抗體，建立了抗p72(N-端殘基20-303 aa)單克隆抗體庫。并利用ASFV Lisbon感染的Vero細胞，通過間接免疫熒光試驗(IFA)對抗體進行了檢測。結(jié)果顯示6種抗體均為IFA陽性(可以與ASFV Lisbon感染的Vero細胞發(fā)生反應(yīng))，并選擇用于進一步表征。利用重疊多肽法進行表位作圖，獲得p72蛋白的B細胞表位為165-171 aa、265-280 aa、280-294 aa、290-303 aa。所有mAb所識別的位點均位于p72的高度保守的區(qū)域內(nèi)。該抗體組的建立為ASFV檢測試劑的開發(fā)提供材料基礎(chǔ)。

2 ASFV p54蛋白B細胞表位的研究進展

p54蛋白是一個主要感染蛋白，是病毒存活和復(fù)制必不可少的成分[9]，其與病毒的吸附作用相關(guān)。p54蛋白由E183L基因所編碼，大小約為25 ku。該蛋白具有跨膜區(qū)，主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜處，該跨膜區(qū)在病毒包膜前體的轉(zhuǎn)化過程中具有重要作用[10]。p54蛋白對ASFV在宿主細胞內(nèi)的運輸過程中發(fā)揮重要作用。據(jù)報道，由大腸埃希氏菌系統(tǒng)和桿狀病毒表達的p54重組蛋白可應(yīng)用于ASFV的血清學(xué)的診斷。

在沒有有效的ASF疫苗的情況下，診斷工具對于及早發(fā)現(xiàn)和實施控制措施至關(guān)重要。p54出現(xiàn)在病毒復(fù)制早期，是進行ASF檢測和監(jiān)視的具有優(yōu)勢的血清學(xué)靶標之一。有研究顯示[11]，利用桿狀病毒表達了p54截短多肽片段60-178 aa，并用該重組蛋白免疫小鼠，通過細胞融合技術(shù)制備了12種單克隆抗體(mAb)。其中5個mAb對ASFV感染的細胞和重組p54蛋白具有陽性反應(yīng)性。表位作圖研究顯示，mAb#154-1識別p54蛋白上的保守序列(65-75 aa)；mAb#101和mAb#117識別p54蛋白上的多肽序列(118-127aa)。利用感染低毒OURT 88/3株的豬抗血清，可鑒定出p54的B細胞表位(118-127 aa)。該研究結(jié)果確定了位于p54上的重要抗原區(qū)域和免疫原性區(qū)域，這些區(qū)域為ASFV診斷試劑的研究提供了候選靶標。

ASFV單克隆抗體和重組蛋白的研究與制備將有助于抗原的表征與分析，進而有助于新型診斷試劑的研發(fā)。有研究團隊[12]制備了p54的重組蛋白，并針對該蛋白制備了大量單克隆抗體。該研究建立了一種單克隆雜交瘤細胞株的篩選方法，該方法利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和間接免疫熒光試驗(IFA)篩選出能夠與被ASFV感染的細胞株反應(yīng)的單克隆抗體，最終篩選出5株抗p54的單抗，在2種測定中均為陽性。又利用免疫組化(IHC)試驗進一步鑒定了上述單克隆抗體與ASFV感染的豬組織的反應(yīng)性。然后，分別在細菌及哺乳動物細胞中表達了p54的多肽片段，利用篩選的單克隆抗體鑒定了p54的線性B細胞表位(54-113 aa、83-143 aa、113-183 aa、60-75 aa、65-79 aa、113-127 aa、118-132 aa)，同時證明了這些線性表位也可以被ASFV感染豬的多抗血清捕獲，并獲得了p54的免疫顯性區(qū)：113-132 aa。該研究結(jié)果為ASFV診斷試劑的研究、監(jiān)測和疫苗開發(fā)提供了有效的數(shù)據(jù)支撐。

3 ASFV p30蛋白B細胞表位的研究進展

在構(gòu)成ASFV病毒體的結(jié)構(gòu)蛋白中，p30是最具免疫原性的蛋白之一，是在ASFV感染的早期產(chǎn)生的。這兩個特征使p30成為檢測ASFV感染較為理想的靶標[13]。

p30是ASFV的早期病毒蛋白，由CP204L基因編碼，該蛋白的分子質(zhì)量約為30 ku，經(jīng)證實該蛋白具有良好的抗原性。通常在ASFV感染細胞后約2 h至4 h觀察到蛋白質(zhì)的表達，然后在整個感染周期中持續(xù)表達[14]。研究人員發(fā)現(xiàn)重組p30蛋白在通過ELISA檢測抗體方面比p54蛋白更有效。有人在體外試驗中評估了重組p30、p54和p72蛋白的反應(yīng)原性，結(jié)果表明p30最適合被用作為診斷抗原[15]。有研究表明，針對p30蛋白的抗體可以抑制病毒內(nèi)化，表明該蛋白在ASFV病毒的入胞過程中起重要作用[5]。

Petrovan V等人[13]制備了p30的重組蛋白，并針對這種蛋白制備了3株單克隆抗體。間接免疫熒光試驗結(jié)果顯示，這些單克隆抗體可識別經(jīng)BA71 V(基因型Ⅰ)株和Georgia /2007(基因型Ⅱ)株感染的Vero細胞和豬巨噬細胞。又利用免疫組化(IHC)試驗進一步鑒定了上述單克隆抗體與ASFV感染的豬組織樣本的反應(yīng)性。分別在細菌及哺乳動物細胞中表達了p30的多肽片段，利用篩選的單克隆抗體鑒定了p30的B細胞表位區(qū)域(61-93 aa、120-204 aa)，同時檢測了表位多肽與ASFV感染豬的多抗血清的反應(yīng)性，最終獲得了p30的免疫顯性區(qū)101-150 aa。該研究結(jié)果為ASFV診斷試劑的研發(fā)提供了有效的數(shù)據(jù)支撐。

在一項研究中，Wu等人[16]制備了21種針對ASFV p30的單克隆抗體(mAb)，利用這些單抗鑒定了p30的4個表位區(qū)域，即84-91 aa、96-105 aa、116-125 aa、146-160 aa，其中，位于p30蛋白C-端的表位能引起宿主抗體有效的體液免疫應(yīng)答，是免疫優(yōu)勢區(qū)域，且其氨基酸序列高度保守。該研究獲得的mAb和p30抗原表位，為開發(fā)ASF的診斷產(chǎn)品提供了幫助。

4 討論

非洲豬瘟是豬的一種烈性病毒病，其臨床癥狀主要有發(fā)熱、出血、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂等，病死率可達100%，危害十分嚴重。ASF在世界范圍內(nèi)的肆虐，給全世界的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。ASF的防控依舊是世界性難題，目前尚無有效的疫苗和藥物。病毒表位信息是診斷試劑和疫苗的研發(fā)基礎(chǔ)?？乖砦皇乾F(xiàn)代分子免疫學(xué)、疫苗學(xué)的研究熱點之一[17]，其是大分子抗原物質(zhì)的抗原決定簇也是基礎(chǔ)作用元件，能與BCR及主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子高效結(jié)合，從而較為全面地激活機體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生具有一定功能的免疫細胞及抗體。

傳染性疾病防控的核心是疫苗，而中和性抗原表位則是疫苗研究的基礎(chǔ)。中和性抗原表位是一類功能性B細胞表位，其可以刺激機體產(chǎn)生中和抗體，高滴度的中和抗體可以保護機體免受病原的攻擊，因而中和性抗原表位是制備預(yù)防性疫苗的重要靶點。然而，研究證明了ASFV p30、p72、p54蛋白可以刺激機體產(chǎn)生特異性中和抗體，但是并不能對機體提供足夠的保護[5]，所以，ASF疫苗的制備仍然是世界性難題。ASFV p30、p72、p54重組蛋白用于制備檢測產(chǎn)品是一條可行的方案[6-8,11-13,15-16]。表位的研究有助于提高檢測試劑的檢測效率，同時有助于新型檢測試劑的開發(fā)。