郭振環(huán)，呂一舟，馬 霞，張志強，李向輝，劉永錄，范云鵬

(1.河南牧業(yè)經濟學院，河南鄭州 450046；2.河南省康星藥業(yè)股份有限公司，河南鄭州 451464；3.西北農林科技大學，陜西楊凌 712100)

《中國獸藥典》2015年版二部收載的茵陳蒿散[1]，源于張仲景的《傷寒論》，由茵陳、梔子、大黃組成。有清熱解毒、利膽、退黃等功效[2-3]，臨床常用于病毒性肝炎、黃疸性肝炎、膽汁淤積等濕熱內蘊證[4-6]。加味茵陳蒿口服液是在茵陳蒿散基礎上加味甘草，新方劑以茵陳為君藥，可清除肝膽濕熱；梔子為臣藥，可清泄三焦?jié)駸幔淮簏S為佐藥，可蕩滌腸胃瘀熱；甘草為使藥，益氣補脾，止痛，有調和諸藥之功效。前3味藥均有苦寒之性，可清除濕熱，而甘草性平，可調和苦寒之性，解梔子苷毒性[7]，還可調節(jié)口味，制成口服液便于臨床使用。

目前《中國獸藥典》收載的茵陳蒿散中只有顯微鑒別和梔子、大黃的薄層色譜鑒別[1]，沒有相應的含量測定方法。本試驗對加味茵陳蒿口服液進行初步質量控制標準研究，從口服液的相對密度、pH、薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)定性鑒別、再到高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)定量檢測，以期為口服液的進一步開發(fā)提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 茵陳、梔子、大黃、甘草均為亳州藥強中藥材有限公司產品；梔子苷(MUST-19102310)、甘草酸單銨鹽對照品(MUST-19073110)，均為成都曼斯特生物科技有限公司產品；大黃素對照品(CDAA-281250)，上海安譜實驗科技股有限公司產品；乙醚、乙酸乙酯、正己烷、正丁醇、丙酮、甲酸、冰醋酸等為分析純，均為山東雙雙化工有限公司產品；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，均為天津市康科德科技有限公司產品。

1.1.2 主要儀器 高效液相色譜儀(agilent technologies 1260)，安捷倫科技中國有限公司產品；超聲波清洗器(SYU-3-100D)，鄭州生元儀器有限公司產品；萬分之一天平(BSA224S)，賽多利斯科學儀器有限公司產品；暗箱四用紫外分析儀(ZF-8)，上海勤科分析儀器有限公司產品；雷磁酸度計(PHS-3C)，上海儀電科學儀器股份有限公司產品；循環(huán)水真空泵(SHZ-D)、低溫冷卻液循環(huán)泵(DLSB-5/10)、旋轉蒸發(fā)器(RE-5299)，均為鄭州科達機械儀器設備有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 加味茵陳蒿口服液及陰性藥液的制備

(1)加味茵陳蒿口服液制備：取茵陳120 g，梔子60 g，大黃45 g，甘草25 g，按照前期試驗中確定的最佳制備工藝進行10批口服液的制備：補足2倍吸水量后加12倍水，浸泡0.5 h，煎煮2次，每次1 h，2次藥液合并后濃縮至1 mL相當于原藥材1g。

(2)陰性藥液制備：按上述工藝分別制備缺梔子、缺大黃、缺甘草的陰性對照藥液。

1.2.2 口服液的一般檢查

(1)相對密度的測定：取潔凈、干燥并精密稱定重量的比重瓶，裝滿測試樣品;裝上溫度計(瓶中應無氣泡)，置20℃的水浴中放置10 min～20 min，使瓶內被測物的溫度達到20℃；用濾紙除去溢出側管的液體，立即蓋上罩;將比重瓶自水浴中取出，用濾紙將比重瓶的外面擦干，精密稱定，減去比重瓶的重量，求得供試品的重量；將供試品傾去，洗凈比重瓶，并裝滿新煮沸過的冷水，照上法測得同一溫度時水的重量，按下式計算，即得。

樣品的相對密度=供測試樣品重量/水重量

(2)pH的測定：采用酸度計檢測每批樣品pH。

1.2.3 薄層色譜法鑒別

(1)梔子的鑒別：精密量取濃縮液3 mL，加乙醚20 mL，超聲20 min，棄乙醚后揮干溶劑，再加入乙酸乙酯30 mL，加熱回流1 h，放冷后取乙酸乙酯層蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，濾過，濾液作為樣品溶液。同法制得梔子對照藥材和缺梔子的陰性對照溶液。取梔子苷對照品適量，加甲醇制成每 1 mL 含0.3 mg的梔子苷對照品溶液。吸取上述4種溶液各2 μL分別點于同一硅膠G板上，以乙酸乙酯-丙酮-水(5∶5∶0.6)為展開劑展開，取出晾干后噴100 g/L的硫酸乙醇溶液，加熱至105℃使薄層板上有斑點顯色。

(2)大黃的鑒別：精密量取濃縮液3 mL，加甲醇25 mL，加熱回流1 h，放冷濾過后把濾液蒸干。殘渣加水5 mL溶解，再加鹽酸1 mL，水浴加熱30 min立即冷卻。用乙醚提取2次，每次5 mL，合并乙醚液，蒸干。殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。同法制得大黃對照藥材和缺大黃的陰性對照溶液。取大黃素對照品適量，加甲醇制成每 1 mL 含0.8 mg的大黃素對照品溶液。吸取上述4種溶液各2 μL分別點于同一硅膠GF254板上，正己烷-乙酸乙酯-甲酸(30∶10∶0.5)為展開劑展開，取出晾干后置于365 nm紫外燈下觀察。

(3)甘草酸銨的鑒別：精密量取濃縮液2 mL，加乙醚8 mL，加熱回流1 h，棄乙醚后蒸干溶液，藥渣加甲醇6 mL，加熱回流1 h，濾過后濾液蒸干；殘渣加水8 mL溶解，正丁醇提取3次，每次4 mL，合并正丁醇液；用水洗滌3次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解作為供試品溶液。同法制得甘草對照藥材和缺甘草的陰性對照溶液。取甘草酸銨對照品適量，加甲醇制成每 1 mL 含2.0 mg的甘草酸銨對照品溶液。吸取上述4種溶液各2 μL分別點于同一硅膠GF254板上，正丁醇-冰醋酸-水(6∶1∶3)為展開劑展開，取出晾干后置于254 nm紫外燈下觀察。

1.2.4 含量測定

(1)色譜條件：梔子苷的流動相為乙腈∶1 mL/L磷酸水(15∶85)，檢測波長為238 nm；大黃素流動相為甲醇-1 mL/L磷酸水(85∶15)，檢測波長為254 nm；甘草酸單銨鹽流動相為乙腈-1 mL/L磷酸水(37∶63)，檢測波長為250 nm。色譜柱均為C18柱(4.6×250 mm，5 μm)，流速1 mL/min，柱溫30℃，進樣10 μL。

(2)供試品溶液和陰性對照溶液的制備：

①精密量取濃縮液0.5 mL，用甲醇溶液定容至 10 mL，超聲處理30 min。放冷，搖勻濾過，取濾液，作為測定梔子苷的供試品溶液。

②精密量取濃縮液1 mL，用甲醇溶液定容至 10 mL，加熱回流1 h。放冷，離心后過濾取續(xù)濾液蒸干，加80 mL/L鹽酸溶液5 mL，超聲2 min；在鹽酸溶液中加三氯甲烷5 mL，取三氯甲烷層，提取3次合并三氯甲烷液，蒸干，加甲醇1 mL搖勻濾過，取濾液，作為測定大黃素的供試品溶液。

③精密量取濃縮液0.5 mL，用 700 mL/L乙醇定容至 10 mL，超聲處理30 min。放冷，搖勻，濾過，取濾液，作為測定甘草酸單銨鹽的供試品溶液。

(3)對照品溶液的制備：精密稱定對照品適量，加甲醇制成30 μg/mL的梔子苷對照品溶液；加甲醇制成40 μg/mL的大黃素對照品溶液；加700 mL/L乙醇制成0.2 mg/mL的甘草酸單銨鹽對照品溶液(甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207)。

(4)專屬性考察：分別吸取供試品溶液、陰性對照溶液及相應的對照品溶液各10 μL，按照上述色譜條件檢測。

(5)線性關系考察：精密吸取梔子苷對照品6 、10 、14、16、20、22 μL，按照含量測定方法，依次注入液相色譜儀進行測定。分別精密吸取大黃素和甘草酸銨對照品1、2、4、8、10 μL，按照含量測定方法，依次注入液相色譜儀進行測定。以峰面積為縱坐標，進樣量(μg)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。

(6)精密度試驗：精密吸取各對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，計算RSD值。

(7)穩(wěn)定性試驗：取同一供試品(批號：20200610)溶液10 μL，分別在0、3、6、9、12、24 h進樣，分別記錄梔子苷、大黃素、甘草酸銨的峰面積，計算RSD值。

(8)加樣回收率：取已知梔子苷/大黃素/甘草酸單銨鹽含量加味茵陳蒿口服液1 mL(批號：20200610)，按照添加對照品的量為供試品有效成分含量的80%、100%、120%分為3組，每組重復3次。按供試品溶液的制備及樣品測定項下操作，測定其含量，計算平均回收率和RSD值。

(9)含量限度測定：取實驗室小試生產的10批口服液樣品進行含量測定，根據試驗結果制定各成分含量限度。

2 結果與分析

2.1 口服液的一般檢查結果

2.1.1 相對密度 經檢測口服液的相對密度為1.06 g/mL～1.10 g/mL。

2.1.2 pH檢查 經檢測口服液pH為4.87～4.90。

2.2 薄層色譜法鑒別結果

梔子的鑒別結果如圖1A顯示，供試品色譜中，在與梔子苷對照品、梔子對照藥材色譜相對應的位置顯示相同顏色斑點，缺梔子陰性對照無干擾。

大黃的鑒別結果如圖1B顯示，供試品色譜中，在與大黃素對照品、大黃對照藥材色譜相對應的位置顯示黃色熒光斑點，缺大黃陰性對照無干擾。

甘草的鑒別結果如圖1C顯示，供試品色譜中，在與甘草酸單銨鹽對照品、甘草對照藥材色譜相對應的位置顯示相同暗褐色斑點，缺甘草陰性對照無干擾。

2.3 含量測定結果

2.3.1 專屬性考察結果 專屬性考察結果顯示加味茵陳蒿口服液色譜峰中梔子苷與雜質分離度較好；有蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚這五種蒽醌類成分，并且陰性對照中在蘆薈大黃素和大黃酸位置上有相同成分出現，這兩種成分專屬性不好，而大黃素分離度較好，故選取專屬性好，且含量多的大黃素作為后續(xù)樣品測定依據；色譜峰中甘草酸單銨鹽與雜質分離完全，分離度大于1.5。陰性樣品均無干擾，表明梔子苷、大黃素、甘草酸單銨鹽的專屬性好。

2.3.2 線性關系考察 梔子苷進樣量在0.18～0.66 μg內線性關系良好(r=0.999)，其回歸方程為γ=2938.8χ+283.45。大黃素進樣量在0.04～0.40 μg內線性關系良好(r=0.9998)，其回歸方程為γ=2420.6χ-7.965。甘草酸單銨鹽進樣量在0.20～2.00 μg內線性關系良好(r=0.9999)，其回歸方程為γ=483.11χ-1.1483。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取各對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，梔子苷對照品峰面積RSD為0.34%；大黃素峰面積RSD為0.29%；甘草酸單銨鹽峰面積RSD為0.38%。結果表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品(批號：20200610)溶液10 μL，分別在0、3、6、9、12、24 h進樣，梔子苷峰面積RSD為0.48%；大黃素峰面積RSD為0.75%；甘草酸單銨鹽峰面積RSD為0.95%。結果表明口服液中在24 h內穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率 梔子苷、大黃素、甘草酸單銨鹽平均回收率和RSD值，見表1、2、3。梔子苷平均回收率為95.03%～96.93%，RSD范圍在0.25%～0.67%；大黃素平均回收率為95.03%～96.93%，RSD范圍在1.39%～2.06%；甘草酸單銨鹽平均回收率在95.03%～96.93%，RSD范圍在0.33%～0.66%。結果表明方法準確度高。

表1 口服液中梔子苷加樣回收率試驗結果Table 1 Experimental results of the recovery rate of geniposide in oral liquid

2.3.6 含量限度測定 測得梔子苷含量范圍為1.343 mg/mL～1.380 mg/mL，梔子苷含量平均值為1.361 mg/mL，最低限度為1.09 mg/mL；大黃素含量范圍為8.625 μg/mL～9.298 μg/mL，大黃素含量平均值為8.903 μg/mL，最低限度為7.12 μg/mL；甘草酸單銨鹽含量范圍為0.875 mg/mL～0.960 mg/mL，甘草酸單銨鹽含量平均值為0.929 mg/mL，最低限度為0.73 mg/mL。

3 討論

楊海玲等[8]研究表明，梔子茵陳中均含有綠原酸，不具備專屬性，因此在定性鑒別和定量檢測中沒有進行綠原酸的檢測。

首先參照了《中國獸藥典》2015年版第二部中梔子藥材的薄層色譜方法，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)作為展開劑，再噴以100 mL/L硫酸乙醇溶液105℃加熱顯色，結果加味茵陳蒿湯樣品溶液中斑點清楚，但陰性對照有干擾。然后參照趙穎等[9]在清火抗毒丸中梔子薄層色譜法樣品處理方法，并考察了以下展開劑：乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)(Ⅰ)[10]，三氯甲烷-甲醇-冰醋酸-水(10∶4∶1∶1)(Ⅱ)，乙酸乙酯-丙酮-水(5∶5∶0.6)(Ⅲ)，三氯甲烷-甲醇(3∶1)(Ⅳ)[11]。使用展開劑(Ⅰ)和(Ⅱ)，斑點清晰，但陰性有干擾。使用展開劑(Ⅳ)樣品分離不開，且有拖尾。使用展開劑(Ⅲ)后，樣品斑點較圓且清晰，陰性對照無干擾。所以選擇乙酸乙酯-丙酮-水(5∶5∶0.6)為加味茵陳蒿口服液中梔子苷展開劑。

表2 口服液中大黃素加樣回收率試驗Table 2 Experimental results of the recovery rate of emodin in oral liquid

表3 口服液中甘草酸單銨鹽加樣回收率試驗結果Table 3 Experimental results of the recovery rate of Mono-ammonium glycyrrhizinate in oral liquid

大黃素的薄層鑒別，考察了以下展開劑：石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液(Ⅰ)和正己烷-乙酸乙酯-甲酸(30∶10∶0.5)(Ⅱ)[12]。使用展開劑(Ⅰ)，拖尾嚴重，斑點不清晰。使用展開劑(Ⅱ)，斑點圓且顯色清晰，分離度較好，陰性對照無干擾。所以選擇正己烷-乙酸乙酯-甲酸(30∶10∶0.5)為加味茵陳蒿口服液中大黃素的展開劑。

甘草酸單銨鹽的薄層鑒別，考察了以下展開劑：乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)(Ⅰ)，氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)下層溶液(Ⅱ)[13]，正丁醇-冰醋酸-水(6∶1∶3)(Ⅲ)[14]。使用展開劑(Ⅰ)，斑點不清晰且陰性有干擾。使用展開劑(Ⅱ)，層析不上去。使用展開劑(Ⅲ)，效果較好，所以選擇正丁醇-冰醋酸-水(6∶1∶3)為加味茵陳蒿口服液中甘草酸單銨鹽的展開劑。

梔子苷的含量測定，考察了以下流動相：乙腈-水(15∶85)(Ⅰ)和乙腈-1 mL/L磷酸水(15∶85)(Ⅱ)。使用流動相(Ⅰ)，分離度不好，供試品圖中有雜峰干擾。使用流動相(Ⅱ)，分離度好，陰性對照無干擾。所以選擇乙腈-1 mL/L磷酸水(15∶85)為加味茵陳蒿口服液中梔子苷的流動相。

甘草酸單銨鹽的含量測定，參照了《中國獸藥典》2015年版第二部中甘草藥材的含量測定方法進行供試品溶液處理，考察了以下色譜條件，流動相均為乙腈(A)-1 mL/L磷酸水(B)梯度洗脫(0～8 min，19% A；8～35 min，50% A；35～36 min，100% A；36～40 min，19% A)；波長237 nm(Ⅰ)[1]；梯度洗脫(0～10 min，20% A；10～60 min，45% A)；波長265 nm(Ⅱ)[15]；乙腈-1 mL/L磷酸水(37∶63)，波長250 nm。使用色譜條件(Ⅰ)，甘草酸單銨鹽對照品不出峰。使用流動相(Ⅱ)，基線不穩(wěn)，雜峰多。使用流動相(Ⅱ)，分離度高，陰性對照無干擾。所以選擇乙腈-1 mL/L磷酸水(37∶63)，檢測波長為250 nm作為加味茵陳蒿口服液中甘草酸單銨鹽的色譜條件。

結果表明，上述試驗方法有效且可靠，可作為加味茵陳蒿口服液的質量控制標準。