王 藝 董凱玥 吳建軍 趙旭民 李羅新金佳利 褚志鵬 柴 毅 劉 偉*

(1.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院/動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，荊州434020；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430223；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；4.武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司，武漢430074；5.浙江華太生物科技有限公司，金華322005)

與畜禽相比，魚(yú)類對(duì)糖利用率不高，尤其是肉食性魚(yú)類[1-2]。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖和飼料業(yè)的不斷發(fā)展,魚(yú)粉的價(jià)格日益上漲，在魚(yú)類飼料中常以植物蛋白質(zhì)原料替代部分魚(yú)粉[3-4],但植物蛋白質(zhì)原料含有較多的糖類[5]；另外，為達(dá)到膨脹和黏合的目的，在水產(chǎn)膨化飼料加工過(guò)程中也需要加入一定水平糖類來(lái)增強(qiáng)物料的黏性，幫助膨化飼料形成一定硬度并增加其在水中的穩(wěn)定性[6]。因此，這更容易造成肉食性魚(yú)類飼料中的糖含量超過(guò)其耐受能力[7-9]。

大口黑鱸(Micropterussalmoides)是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，作為典型的肉食性魚(yú)類，大口黑鱸相較于大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[10]、軍曹魚(yú)(Rachycentroncanadum)[11]等肉食性魚(yú)類，對(duì)糖的利用能力更差[12]。長(zhǎng)期攝食高糖飼料，會(huì)導(dǎo)致大口黑鱸生長(zhǎng)受阻，肝糖原和脂肪含量增加[13]，造成肝臟肥大、顏色蒼白以及肝細(xì)胞空泡區(qū)增加[7, 14]，引發(fā)肝臟功能性損傷[12,15-16]。同時(shí)，攝食高糖水平飼料會(huì)改變大口黑鱸腸道形態(tài)，增加腸道炎癥相關(guān)基因表達(dá)，降低腸道益生菌豐度和腸道對(duì)有害細(xì)菌的抵抗力[17]。因此，如何提高大口黑鱸對(duì)飼料中糖的適應(yīng)性，改善肝臟和腸道健康，對(duì)發(fā)展其規(guī)?；】叼B(yǎng)殖尤為重要。

植物甾醇是一種廣泛存在于各種植物油、堅(jiān)果和植物種子中的甾體化合物。近年來(lái)，因其具有良好的降血脂功效而較多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和食品生產(chǎn)中[18]。目前，在畜禽動(dòng)物中，已有許多研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量植物甾醇，可以顯著提高其生長(zhǎng)性能[19-20]、增強(qiáng)抗氧化能力[21]、降低血脂水平[22]和改善肉質(zhì)[23]。而進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，植物甾醇可以減少肝臟炎癥發(fā)生[24]并可降低肝糖原沉積[25]。目前關(guān)于植物甾醇在水產(chǎn)動(dòng)物方面的報(bào)道不多，但也發(fā)現(xiàn)飼料中添加適量的植物甾醇可顯著提高如團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[26]、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[27]和大口黑鱸[28]等的生長(zhǎng)性能和抗氧化能力，并具有降低血脂含量的作用。但現(xiàn)在仍不清楚植物甾醇是否可以降低魚(yú)類肝糖原積累，以及對(duì)魚(yú)類肝臟和腸道健康是否有改善作用。

因此，本研究在龔紅等[28]的研究基礎(chǔ)上，再次以大口黑鱸為研究對(duì)象，重新評(píng)估植物甾醇對(duì)其生長(zhǎng)性能、飼料利用、體成分、肝臟和腸道健康以及肌肉質(zhì)構(gòu)的影響，以期為植物甾醇在魚(yú)類飼料中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

本試驗(yàn)以魚(yú)粉和雞肉粉等為主要蛋白質(zhì)源，魚(yú)油和豆油為脂肪源，配制基礎(chǔ)飼料。根據(jù)植物甾醇在團(tuán)頭魴[26]、吉富羅非魚(yú)[27]和大口黑鱸[28]等水產(chǎn)動(dòng)物中的研究結(jié)果，本試驗(yàn)在基礎(chǔ)飼料中分別添加0(對(duì)照)、22.5、45.0、67.5和90.0 mg/kg的植物甾醇，共配制出5種試驗(yàn)飼料，分別記作TZ0、TZ22、TZ45、TZ67和TZ90。

飼料配制之前，先將魚(yú)粉和豆粕等飼料原料進(jìn)行粉碎處理，過(guò)60目篩，然后按照配方逐級(jí)混勻。其中，先以面粉為稀釋劑將植物甾醇預(yù)混料(含總甾醇15%，其中菜油甾醇6%，谷甾醇8%，豆油甾醇1%)逐級(jí)混勻后與其他原料再次混勻。將魚(yú)油和豆油混合均勻后加入到配合好的原料中，再次混勻，加入適量的自來(lái)水后，使用飼料機(jī)(TSE65，北京現(xiàn)代洋工機(jī)械科技發(fā)展有限公司)將其加工制成直徑2 mm的顆粒飼料，70～80 ℃干燥15 min(帶式干燥機(jī)，DW型，常州蘇式干燥設(shè)備有限公司)，放至室溫后儲(chǔ)藏于-20 ℃冰箱中備用。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items組別 GroupsTZ0TZ22TZ45TZ67TZ90植物甾醇預(yù)混料 Phytosterol premix0.0150.03 0.0450.06面粉 Wheat flour 7.00 7.000 7.00 7.0007.00 木薯粉 Tapioca7.00 7.000 7.00 7.000 7.00 酵母 Yeast1.00 1.000 1.00 1.000 1.00 膨潤(rùn)土 Bentonite0.50 0.500 0.50 0.500 0.50 磷酸二氫鈣 Ca(H2PO4)21.50 1.500 1.50 1.500 1.50 魚(yú)油 Fish oil3.00 3.000 3.00 3.000 3.00 大豆油 Soybean oil3.00 3.000 3.00 3.000 3.00 維生素預(yù)混料 Vitamin premix3)1.00 1.000 1.00 1.000 1.00 礦物質(zhì)預(yù)混料 Mineral premix4)1.00 1.000 1.00 1.000 1.00 氯化膽堿 Choline chloride0.15 0.150 0.15 0.150 0.15 合計(jì) Total100.00100.000100.00100.000100.00營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels5)粗蛋白質(zhì) Crude protein53.07 53.05 53.10 53.04 53.10 粗脂肪 Crude lipid10.01 10.06 10.04 10.07 10.09 粗灰分 Ash13.87 13.70 13.61 13.67 13.90

1.2 試驗(yàn)魚(yú)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用魚(yú)(優(yōu)鱸3號(hào))為購(gòu)自荊州漁都特種水產(chǎn)養(yǎng)殖公司孵化的同一批魚(yú)。在正式養(yǎng)殖試驗(yàn)前，為盡快馴化大口黑鱸使之對(duì)投喂及投喂人員產(chǎn)生條件反射，適應(yīng)試驗(yàn)養(yǎng)殖環(huán)境，所有魚(yú)用TZ0飼料暫養(yǎng)2周，每日投喂3次，分別為08:30、12:30和16:30，表觀飽食投喂。但在馴化過(guò)程中，由于大口黑鱸在中午的攝食并不積極，攝食量較低，容易造成飼料浪費(fèi)，故在正式試驗(yàn)中對(duì)試驗(yàn)魚(yú)進(jìn)行每日2次投喂。

試驗(yàn)開(kāi)始前，試驗(yàn)魚(yú)禁食24 h。挑選出600尾個(gè)體健壯、規(guī)格一致，初始平均體重為(5.01±0.06) g的大口黑鱸。養(yǎng)殖于15個(gè)流水養(yǎng)殖桶中(直徑1.0 m，水深0.35 m，水體體積約270 L)，每桶40尾，將15個(gè)桶隨機(jī)分為5組，每組3個(gè)重復(fù)，分別投喂5種試驗(yàn)飼料。每日表觀飽食投喂2次(08:00和16:30)。每日記錄水溫、大口黑鱸攝食行為和死亡數(shù)量等，養(yǎng)殖用水為地下水。飼養(yǎng)期間的水質(zhì)條件為：水溫20～23 ℃，溶解氧含量大于5.0 mg/L，pH 6.8～7.3，氨氮含量小于0.1 mg/L，亞硝酸鹽含量小于0.01 mg/L。養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)8周。

1.3 樣品采集和分析

1.3.1 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h后，用MS-222麻醉(120 mg/L)，對(duì)每桶試驗(yàn)魚(yú)進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重，用于計(jì)算成活率、增重率和特定生長(zhǎng)率，并根據(jù)飼料總投喂量計(jì)算飼料系數(shù)。禁食48 h后，用MS-222麻醉(120 mg/L)，每桶隨機(jī)取3尾魚(yú)，測(cè)量體長(zhǎng)和體重，用于計(jì)算肥滿度，隨后進(jìn)行尾部靜脈取血，4 ℃冰箱內(nèi)靜置2 h，3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱中，用于測(cè)定血清生化指標(biāo)。解剖取相同部位的肝臟、腸道，置于4%多聚甲醛中，用于制作組織切片。每桶隨機(jī)取3尾魚(yú)，麻醉后解剖取內(nèi)臟，稱重并記錄用于計(jì)算臟體比。將肝臟由內(nèi)臟中分離，稱重并記錄用于計(jì)算肝體比，取肝臟樣品，用于測(cè)定抗氧化指標(biāo)和肝糖原含量，取去內(nèi)臟全魚(yú)魚(yú)體背部側(cè)線上方肌肉并保存肌肉樣品，用于測(cè)定肌糖原含量和營(yíng)養(yǎng)組成。每桶隨機(jī)取3尾魚(yú)，-20 ℃保存，用于測(cè)定全魚(yú)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)組成。每桶隨機(jī)取4尾魚(yú)，取魚(yú)體背部左側(cè)側(cè)線上方肌肉，立即用于肌肉質(zhì)構(gòu)的測(cè)定。

1.3.2 飼料和魚(yú)體組成分析

飼料、全魚(yú)和肌肉營(yíng)養(yǎng)組成的分析方法如下：水分含量測(cè)定采用105 ℃干燥法(GB/T 5009.3—2003)，粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2003)，粗脂肪含量測(cè)定采用索式抽提法(GB/T 5009.6—2003)，粗灰分含量測(cè)定采用灼燒稱重法(GB/T 5009.4—2003)。糖原含量測(cè)定采用南京建成生物工程研究所試劑盒(比色法)，按照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3.3 血清生化指標(biāo)測(cè)定

血清葡萄糖(glucose,GLU)、甘油三酯(triglyceride,TG)、總蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,ALB)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)含量及谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、脂肪酶(lipase,LIP)和α-淀粉酶(α-amylase,α-AMY)活性由全自動(dòng)生化分析儀(BS-460，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)測(cè)定，所用試劑均為購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司生產(chǎn)的同一批次試劑。

1.3.4 血清和肝臟抗氧化指標(biāo)測(cè)定

抗氧化指標(biāo)采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)包括丙二醛(MDA,TBA法)含量及過(guò)氧化氫酶(CAT,鉬酸銨法)和超氧化物歧化酶(SOD,WST-1法)活性，按照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3.5 肌肉質(zhì)構(gòu)測(cè)定

每桶隨機(jī)取4尾魚(yú)，取魚(yú)體背部左側(cè)側(cè)線上方肌肉，立即用于肌肉質(zhì)構(gòu)測(cè)定。樣本修整為1 cm×1 cm×1 cm塊狀。使用質(zhì)構(gòu)分析儀(TVT-300XP型，波通瑞華科學(xué)儀器北京有限公司)依據(jù)文獻(xiàn)[29]中使用的質(zhì)地剖面分析法(texture profile analysis,TPA)進(jìn)行測(cè)定，參數(shù)設(shè)定如下：采用25 mm×25 mm的柱形探頭，測(cè)定間隔時(shí)間為5 s，接觸感應(yīng)力為5 g，壓縮比為60%，數(shù)據(jù)獲得速率為200.00 pps，測(cè)試速度1 mm/s，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,取平均值。肌肉質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定指標(biāo)包括：硬度、彈性、凝聚性、膠黏性、咀嚼性、黏連性、回復(fù)性、黏附性。

1.3.6 肝臟、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

肝臟、腸道經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片，厚度為6 μm，蘇木精-伊紅(HE)染色，制作切片。

肝臟和腸道組織標(biāo)本石蠟切片采用光學(xué)顯微鏡(CX33型，奧林巴斯工業(yè))觀察并用成像系統(tǒng)進(jìn)行成像和圖像采集。其中，肝臟細(xì)胞長(zhǎng)度、細(xì)胞寬度、細(xì)胞核直徑、腸道組織絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度由軟件Image-pro plus 9.0測(cè)量。

肝臟組織顏色由測(cè)色色差計(jì)(WSC-1B型，上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司)測(cè)定。將所取肝臟樣品置于干凈濾紙上，測(cè)色色差計(jì)探頭對(duì)準(zhǔn)肝臟樣品，測(cè)定亮度(L*)值、紅度(a*，+a*偏紅，-a*偏綠)值和黃度(b*，+b*偏黃,-b*偏藍(lán))值。

1.4 計(jì)算公式

成活率、增重率、攝食率、特定生長(zhǎng)率、飼料系數(shù)、肥滿度、肝體比和臟體比參照以下公式計(jì)算：

成活率(%)=100×(試驗(yàn)?zāi)~(yú)總數(shù)/
試驗(yàn)初魚(yú)總數(shù))；增重率(%)=100×(終末體重-
初始體重)/養(yǎng)殖天數(shù)；攝食率(%)=100×投喂飼料總重/[(初始總重+
終末總重)/2]/養(yǎng)殖天數(shù)；特定生長(zhǎng)率(%/d)=100×(1n終末體重-
1n初始體重)/養(yǎng)殖天數(shù)；飼料系數(shù)=投喂飼料總重/(終末體重-初始體重)；肥滿度(g/cm3)=100×終末體重/
終末體長(zhǎng)3；臟體比(%)=100×內(nèi)臟團(tuán)重/終末體重；肝體比(%)=100×肝臟重/終末體重。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)由Excel 2019整理后用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。先進(jìn)行ANOVA單因子方差分析，若組間差異顯著，再用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著。結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(n=3)表示。二次回歸模型采用Origin 2021進(jìn)行多項(xiàng)式擬合分析后制作。

2 結(jié) 果

2.1 植物甾醇對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能和飼料利用的影響

各組試驗(yàn)魚(yú)均無(wú)死亡情況發(fā)生，成活率為100%。由表2可知，與TZ0組相比，飼料中添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能和飼料利用無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表2 飼料添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能和飼料利用的影響

2.2 植物甾醇對(duì)大口黑鱸體成分的影響

由表3可知，在全魚(yú)中，植物甾醇對(duì)試驗(yàn)魚(yú)的粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量無(wú)顯著影響(P>0.05)，但是飼料中添加植物甾醇有提高水分含量、降低粗脂肪含量的趨勢(shì)。與TZ0組相比，TZ22、TZ67和TZ90組全魚(yú)肌肉水分含量顯著提高(P<0.05)，TZ45、TZ67和TZ90組粗脂肪含量顯著降低(P<0.05)。在肌肉中，試驗(yàn)魚(yú)肌肉的水分含量隨植物甾醇添加量的提高呈上升趨勢(shì)。其中，與TZ0組相比，TZ22、TZ67和TZ90組水分含量顯著提高(P<0.05)。TZ45、TZ67和TZ90組肌糖原含量顯著降低(P<0.05)。在肝臟中，飼料中添加植物甾醇顯著降低了試驗(yàn)魚(yú)肝糖原含量(P<0.05)。其中，肝糖原含量在TZ90組時(shí)達(dá)到最低，顯著低于TZ0組(P<0.05)。隨著飼料中植物甾醇添加量的提高，肝臟粗脂肪含量呈先下降后上升的趨勢(shì)，在TZ45組達(dá)到最低，與TZ0組差異不顯著(P>0.05)。

2.3 植物甾醇對(duì)大口黑鱸血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知，飼料中添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸血清中的LDL-C、HDL-C、TC、TP、ALB含量及ALP、LIP和α-AMY活性無(wú)顯著影響(P>0.05)。與TZ0組相比，TZ22和TZ67組血清ALT活性顯著降低(P<0.05)；TZ22、TZ45和TZ67組血清AST活性顯著降低(P<0.05)；TZ45和TZ90組血清GLU含量顯著升高(P<0.05)；TZ22、TZ67和TZ90組血清TG含量顯著升高(P<0.05)。

2.4 植物甾醇對(duì)大口黑鱸血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

由表5可知，與TZ0組相比，飼料中添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸血清SOD活性、肝臟SOD活性和肝臟MDA含量無(wú)顯著影響(P>0.05)。在血清中，與TZ0組相比，TZ90組MDA含量顯著降低(P<0.05)，TZ67組CAT活性顯著升高(P<0.05)；在肝臟中，與TZ0組相比，TZ90組CAT活性顯著降低(P<0.05)。

表3 飼料中添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸體成分的影響

表4 飼料中添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸血清生化指標(biāo)的影響

表5 飼料添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

續(xù)表5項(xiàng)目 Items組別 GroupsTZ0TZ22TZ45TZ67TZ90肝臟 Liver丙二醛 MDA/(nmol/mg prot)0.83±0.130.43±0.03 0.55±0.120.50±0.18 0.40±0.06超氧化物歧化酶 SOD/(U/mg prot)13.39±0.3310.03±0.90 12.74±0.5710.92±0.17 12.48±1.21過(guò)氧化氫酶 CAT/(U/mg prot)10.31±0.66b7.80±1.77ab9.71±0.84b9.61±0.18b4.30±0.20a

2.5 植物甾醇對(duì)大口黑鱸肌肉質(zhì)構(gòu)特性的影響

由表6可知，飼料中添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸肌肉彈性、內(nèi)聚性、膠黏性、咀嚼性和回復(fù)性無(wú)顯著影響(P>0.05)，但飼料中添加植物甾醇顯著增加了試驗(yàn)魚(yú)肌肉硬度、黏連性和黏附性(P<0.05)。其中，試驗(yàn)魚(yú)的肌肉硬度隨著植物甾醇添加量的增加，表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，并在TZ67組達(dá)到最大；黏連性和黏附性隨植物甾醇添加量的提高有上升的趨勢(shì)，其中，黏連性在TZ45組達(dá)到最大，黏附性在TZ90組達(dá)到最大。

表6 飼料中添加甾醇對(duì)大口黑鱸肌肉質(zhì)構(gòu)特性的影響

2.6 植物甾醇對(duì)大口黑鱸細(xì)胞形態(tài)和肝臟顏色的影響

由表7可知，飼料中添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸肝細(xì)胞的細(xì)胞核直徑、細(xì)胞長(zhǎng)度、L*和b*值無(wú)顯著影響(P>0.05)。與TZ0組相比，除TZ90組外，各組間試驗(yàn)魚(yú)肝細(xì)胞寬度無(wú)顯著差異(P>0.05)；TZ45組a*值顯著高于TZ0組(P<0.05)。

表7 飼料中添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸肝細(xì)胞形態(tài)和肝臟顏色的影響

由圖1可知，與TZ0組相比，飼料中添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸肝臟組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影影響。各組試驗(yàn)魚(yú)的肝臟組織較為完整，細(xì)胞與細(xì)胞之間界限清晰，未出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肝細(xì)胞損傷情況。但是，各組試驗(yàn)魚(yú)肝細(xì)胞均有細(xì)胞腫脹、細(xì)胞核偏移和細(xì)胞空泡化的發(fā)生。

2.7 植物甾醇對(duì)大口黑鱸腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖2可知，TZ0組試驗(yàn)魚(yú)的腸道存在明顯的受損現(xiàn)象，表現(xiàn)為增生、壞死、萎縮情況，甚至出現(xiàn)紋狀緣局部受損現(xiàn)象，且腸絨毛排列不規(guī)則。相比于TZ0組，TZ22、TZ45、TZ67和TZ90組腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，紋狀緣排列整齊，腸絨毛異常現(xiàn)象不明顯。

由表8可知，飼料中添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸腸道絨毛特征無(wú)顯著影響(P>0.05)。但相比于TZ0組，飼料中添加植物甾醇有提高試驗(yàn)魚(yú)的腸絨毛高度的趨勢(shì)，在TZ67組達(dá)到最高；而絨毛寬度則呈下降趨勢(shì)，TZ90組時(shí)達(dá)到最低。

2.8 大口黑鱸飼料中植物甾醇最適添加量

以飼料中植物甾醇添加量為自變量(x)，以大口黑鱸全魚(yú)粗脂肪含量為因變量(y)作回歸分析，得到二次回歸方程y=3.014×10-4x2-0.038 6x+7.425 (R2=0.961)。當(dāng)x為64.0 mg/kg，大口黑鱸全魚(yú)粗脂肪含量達(dá)到最低(圖3)；以肝糖原含量(y)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)二次回歸方程y=8.95×10-4x2-0.106x+8.203(R2=0.818)計(jì)算得到當(dāng)飼料中植物甾醇添加量為59.2 mg/kg時(shí)，大口黑鱸肝糖原含量達(dá)到最低(圖4)。

VH：絨毛高度 villus height；VW:絨毛寬度 villus width；MT:肌層厚度 muscles thickness。

3 討 論

3.1 飼料中添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能的影響

在團(tuán)頭魴的研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加植物甾醇可以顯著提高魚(yú)體的增重率和特定生長(zhǎng)率，對(duì)魚(yú)體生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[26]。這與植物甾醇具有類激素作用，能夠調(diào)節(jié)垂體與肝臟功能，促進(jìn)生長(zhǎng)激素和胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)的分泌有關(guān)[30]。但在本研究中并未發(fā)現(xiàn)大口黑鱸的生長(zhǎng)性能隨植物甾醇的添加出現(xiàn)顯著提高。這可能與大口黑鱸的生物學(xué)特性有關(guān)。大口黑鱸屬溫水性魚(yú)類，其生長(zhǎng)最適水溫為25～30 ℃[31]，本試驗(yàn)期間的水溫為20～23 ℃，而研究表明，當(dāng)水溫在25 ℃以上時(shí)，大口黑鱸特定生長(zhǎng)率可達(dá)到最高[32]。因此，可能由于本試驗(yàn)期間水溫未能達(dá)到大口黑鱸最適水溫，影響了大口黑鱸的生長(zhǎng)速度。

在團(tuán)頭魴[26]、羅氏沼蝦[27]和大口黑鱸[28]等報(bào)道中，根據(jù)生長(zhǎng)表現(xiàn)得到的飼料中植物甾醇最適添加量分別為40、40和30 mg/kg，而在本研究中也發(fā)現(xiàn)以生長(zhǎng)性能作為效應(yīng)指標(biāo)時(shí)，大口黑鱸飼料中植物甾醇最適添加量為45 mg/kg。但是，本研究以全魚(yú)粗脂肪含量、肝糖原含量為效應(yīng)指標(biāo)時(shí)，大口黑鱸飼料中植物甾醇適宜添加量為59.2～64.0 mg/kg，稍高于以生長(zhǎng)需要而確定的最適添加量。這可能和生長(zhǎng)與生理需要(如抗氧化能力、消化酶活性和免疫力等)不同有關(guān)，這在魚(yú)類維生素的相關(guān)研究中也有類似發(fā)現(xiàn)[33-35]。

表8 飼料中添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸腸道絨毛特征的影響

圖3 飼料添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸

圖4 飼料添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸

3.2 飼料中添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸肝臟健康的影響

肝臟是魚(yú)類糖代謝的主要場(chǎng)所，魚(yú)類攝入含高水平糖類的飼料會(huì)造成肝糖原含量升高[36]，當(dāng)糖原積累過(guò)量時(shí)，會(huì)導(dǎo)致肝臟異常增大從而使肝細(xì)胞功能受損[37]。本研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量植物甾醇可以有效減少肝糖原的積累。這與在田鼠[38]和大鼠[25]中的研究結(jié)果一致。這或許與植物甾醇能提高肝糖原磷酸化酶活性有關(guān)[38]，糖原磷酸化酶可以催化糖原的磷酸解。在本研究中，飼料中添加植物甾醇提高了大口黑鱸的血清GLU含量，與Panda等[39]研究中大鼠的表現(xiàn)類似。這可能與植物甾醇對(duì)肝糖原分解的促進(jìn)作用有關(guān)[25]。

在正常狀態(tài)下,AST和ALT在血液中的活性較低。但當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生病變和損傷時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞膜通透性增加,導(dǎo)致這2種酶由細(xì)胞內(nèi)釋放到血液中[40]。因此,AST和ALT活性也常作為反映肝臟功能受損的特異性指標(biāo)。本研究中發(fā)現(xiàn)，與TZ0組相比，TZ22和TZ67組血清ALT活性顯著降低，TZ22、TZ45和TZ67組血清AST活性顯著降低，這表明飼料中添加植物甾醇可以改善大口黑鱸肝臟健康。

細(xì)胞在能量代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧(ROS)，當(dāng)ROS產(chǎn)生過(guò)多會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷,即氧化應(yīng)激[41]。而SOD和CAT可以清除自由基，保護(hù)細(xì)胞免受ROS損傷[42]。MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，其含量常被用于評(píng)估機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化程度[43]。而植物甾醇可以通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶和自由基的產(chǎn)生來(lái)保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激的傷害[44-47]。在本試驗(yàn)中，肝臟MDA含量隨著飼料中植物甾醇添加量的升高呈下降趨勢(shì)，這與在羅非魚(yú)[27]中的研究結(jié)果一致，說(shuō)明植物甾醇可以提高肝臟抗氧化能力。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)，TZ90組肝臟CAT活性顯著降低。這可能是添加植物甾醇后肝臟的健康狀況得到改善，肝臟中過(guò)氧化氫含量減少，而無(wú)需表達(dá)或激活CAT的活性[48]。

肝臟顏色通常也是判斷肝臟健康的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[15]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，代表肝臟紅度的a*值隨著植物甾醇添加量的增加呈上升趨勢(shì)，表明隨著植物甾醇添加量的提高，肝臟顏色更紅，而這通常被認(rèn)為是肝臟健康的表現(xiàn)。本研究中，組織學(xué)分析結(jié)果顯示，各組肝臟組織較為完整，細(xì)胞與細(xì)胞之間界限清晰，未出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肝細(xì)胞損傷情況。但是，各組肝細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞空泡化以及細(xì)胞核受擠壓偏移的現(xiàn)象發(fā)生。一般來(lái)講，這種情況在養(yǎng)殖魚(yú)類中較為常見(jiàn)[49]?？张莺兄|(zhì)和糖原，這與肝臟的正常代謝功能有關(guān)[50]。一些研究發(fā)現(xiàn)，肝臟中脂質(zhì)和糖原沉積過(guò)高會(huì)導(dǎo)致肝臟病變，對(duì)魚(yú)的健康造成不良影響[51]。從本試驗(yàn)中有關(guān)肝臟健康狀況評(píng)價(jià)的血清生化指標(biāo)，如血清ALT、AST活性的結(jié)果來(lái)看，飼料中添加適量植物甾醇確實(shí)可以改善肝臟健康，但是在組織學(xué)上這種改善并不明顯。

3.3 飼料中添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸腸道健康的影響

研究表明，飲食因素可能會(huì)干擾魚(yú)體腸內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和結(jié)構(gòu)特征[52-53]。在本研究中，TZ0組腸道存在明顯增生、壞死、萎縮情況，甚至出現(xiàn)紋狀緣局部受損現(xiàn)象，且腸絨毛排列不規(guī)則。而添加植物甾醇后，腸道結(jié)構(gòu)得到明顯改觀，表明植物甾醇有利于大口黑鱸腸道健康。

腸道是食物消化、吸收和運(yùn)輸?shù)闹饕鞴?，腸道功能對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收非常重要[54]，可通過(guò)測(cè)量絨毛特征來(lái)評(píng)估腸道的健康和功能[55]。在本研究中，植物甾醇在一定程度上有提高大口黑鱸腸絨毛高度和降低絨毛寬度的趨勢(shì)，這通常被認(rèn)為是腸道結(jié)構(gòu)形態(tài)得到改善的表現(xiàn)[56]。

3.4 飼料中添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸肌肉質(zhì)構(gòu)的影響

肌肉的質(zhì)構(gòu)特性是決定其可口性的重要因素，是肉質(zhì)主要的感官和理化指標(biāo)[57-58]。硬度是指使食品達(dá)到一定變形所需要的力，食品保持形狀的內(nèi)部結(jié)合力[59]。硬度越大，抵抗牙齒壓力的能力越大，發(fā)生斷裂所需的變形力越大，彈性也相應(yīng)的越大。一般而言，魚(yú)肉硬度的提高表明肉質(zhì)得到了改善[60]。黏連性是指樣品在與壓力探頭分離前減壓過(guò)程中的延展距離，黏連性越大，表明樣品延展性越好。黏附性是指探頭脫離樣品所需的能量，反映在咀嚼魚(yú)肉時(shí)，魚(yú)肉表面與舌、齒等之間的黏力[59]。在本研究中，TZ22、TZ45、TZ67組大口黑鱸肌肉硬度、黏連性和黏附性均顯著高于TZ0組，表明大口黑鱸肌肉質(zhì)構(gòu)特性得到提升，植物甾醇顯著改善了大口黑鱸的肌肉品質(zhì)。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，飼料中添加植物甾醇對(duì)大口黑鱸的生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響，但也發(fā)現(xiàn)適量的植物甾醇可以顯著降低大口黑鱸肝臟和肌肉的糖原積累，提高其肌肉品質(zhì)，并改善其肝臟和腸道健康情況。以全魚(yú)粗脂肪含量、肝糖原含量為效應(yīng)指標(biāo)，經(jīng)二次回歸模型分析后，發(fā)現(xiàn)大口黑鱸飼料中植物甾醇適宜添加量為59.2～64.0 mg/kg。