李生花，楊全余，2，3，嘎 琴，2，3，靳國(guó)恩，2，3

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(青海-猶他高原醫(yī)學(xué)聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)；3.教育部高原醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001)

高原肺動(dòng)脈高壓(high altitude pulmonary hypertension，HAPH)是高原地區(qū)常見(jiàn)的一種疾病，是由于長(zhǎng)期低氧刺激誘發(fā)肺血管結(jié)構(gòu)重建，血管阻力增加，肺動(dòng)脈壓持續(xù)升高，繼而引起右心室結(jié)構(gòu)和功能改變的一種慢性疾病，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致右心衰或肺水腫而危及生命。由于機(jī)制不清，HAPH的有效治療仍是當(dāng)前醫(yī)學(xué)難題，尋找有效的藥物作用靶點(diǎn)和挖掘中藏藥潛在的藥效價(jià)值是當(dāng)前研究的主要方向之一。

中藏藥所具有的機(jī)體調(diào)理作用、多靶點(diǎn)作用和副作用小等特點(diǎn)，在治療慢性高原病方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。HAPH病理生理特點(diǎn)是由于肺血管平滑肌細(xì)胞增厚，管腔狹窄，血管內(nèi)阻力增大，使得心臟和血管收縮產(chǎn)生的推動(dòng)力受阻，其乃為“氣滯”現(xiàn)象，“氣滯”結(jié)果是使血液流動(dòng)緩慢而不通暢，產(chǎn)生“血瘀”。藏藥四味黃芪散中的四味藥材主要來(lái)源于高寒缺氧地區(qū)，具有補(bǔ)氣和活血化瘀的藥效，該藥在前期研究中已發(fā)現(xiàn)有比較好的抗低氧效果[1]，但作用機(jī)制仍然不清楚。

HAPH主要病理特征是肺動(dòng)脈平滑肌過(guò)度增殖，這也是肺動(dòng)脈壓持續(xù)升高，藥物效果不佳的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)胞的自噬活動(dòng)具有修復(fù)受損細(xì)胞的能力，在一定程度上具有保護(hù)組織的作用，而低氧在造成細(xì)胞損傷的同時(shí)也會(huì)促進(jìn)自噬活動(dòng)的增強(qiáng)，而自噬活動(dòng)的增強(qiáng)又可抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，從而減緩低氧性肺動(dòng)脈壓的升高[2]，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)自噬信號(hào)通路，是能量代謝的“調(diào)節(jié)器”，一方面其可促進(jìn)ATP生成，另一方面抑制組織對(duì)ATP的消耗。AMP/ATP比值升高可激活A(yù)MPK信號(hào)通路，而缺氧會(huì)引起 AMP/ATP比值升高。因此，本文通過(guò)藏藥四味黃芪散對(duì)AMPK誘導(dǎo)的自噬信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平的影響，探討該信號(hào)通路是否參與低氧下肺動(dòng)脈高壓的形成機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組動(dòng)物 由西安交通大學(xué)動(dòng)物中心提供(SCXK(陜)2017-003)，該研究獲得青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。110只SPF級(jí)別SD大鼠(160～200) g，均為雄性，隨機(jī)分成低氧對(duì)照組(50只)和低氧藥物組(50只)，兩組又根據(jù)暴露低氧時(shí)間分別細(xì)分為5個(gè)小組，即低氧1 d組、低氧3 d組、低氧7 d組、低氧15 d組和低氧30 d組，每小組10只大鼠，放置于模擬海拔5 000 m低壓氧艙，另有10只作為常氧對(duì)照組(西寧地區(qū)，海拔2 260 m)。

1.1.2儀器與試劑 青海大學(xué)低壓氧艙DYC-3000(中航風(fēng)雷)，MP150用生理信號(hào)采集系統(tǒng)(美國(guó)Biopac)；Bio-Rad垂直電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)；Tecnai Spirit Bio TWIN FEI投射電子顯微鏡(美國(guó)FEI公司)；LEICA EM UC7超薄切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)；p-AMPK(EPR3051(ab92701，Abcam公司)；ULK-1(ab240916，abcam公司)；LC3重組抗體(EPR18709)。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216，碧云天生物技術(shù)公司)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(A0208，碧云天生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物模型構(gòu)建 將100只SD大鼠置于低壓氧艙內(nèi)，以2 m·s-1的速度升至模擬海拔5 000 m，艙內(nèi)溫度(22±2) ℃，濕度50%～60%，采用慢性低壓低氧來(lái)模擬高原低氧環(huán)境(暴露低氧≤7 d為急性低氧，>7 d為慢性低氧暴露)，大鼠自由取食水。

1.2.2藥物及給藥方法 藏藥四味黃芪散水提液以備用。藏黃芪(內(nèi)蒙古)，川芎(四川)，沉香(甘肅)，藏紅花(伊朗)四味藥，多用于治療腦中風(fēng)等疾病，按臨床已明確的方劑量比例(40 g ∶20 g ∶20 g ∶1 g)稱(chēng)重，再按物料比1 ∶12的比例加入水，用旋轉(zhuǎn)儀蒸煮，每次2 h，共3次，提取液濃縮至終濃度為0.84 kg·L-1。根據(jù)2015版中國(guó)藥典對(duì)復(fù)方中各飲片中活性成分進(jìn)行含量測(cè)定，其中黃芪中黃芪甲苷含量為0.11%，川芎中阿魏酸含量為0.15%、沉香中沉香四醇含量為0.14%，西紅花苷中西紅花苷Ⅰ、Ⅱ含量分別為8.5%、3.1%。低氧藥物組給予藏藥四味黃芪散水劑灌胃(根據(jù)人和大鼠等效劑量換算，大鼠藥量為0.42 g/100 g體重)，每天1次；低氧對(duì)照組用0.9%生理鹽水灌胃。

1.2.3肺動(dòng)脈壓(Ppa)和左右心室比重測(cè)定(RV/(LV+S)) 將大鼠給予25%烏拉坦(125 mg/100 g)麻醉，麻醉平穩(wěn)后，仰臥位固定，分離出右側(cè)頸外靜脈，用肝素化的彎頭聚次亞乙烯管(內(nèi)徑0.28 mm)沿頸外靜脈向向心端插入，通過(guò)顯示器觀察壓力波形變化，出現(xiàn)典型的肺動(dòng)脈壓力波形后，固定好導(dǎo)管，用16導(dǎo)生理信號(hào)采集系統(tǒng)(MP150，美國(guó)Biopac公司)進(jìn)行肺動(dòng)脈壓進(jìn)行測(cè)定，保存和分析；取出心臟，剪去左右心房組織，確定好右心室，沿右心室壁與心間隔連接處剪下整個(gè)右心室壁，采用電子秤對(duì)大鼠右心室質(zhì)量和左心室+室間隔質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，求出比值。

1.2.4免疫印跡法 取適量冰凍肺組織，用適量裂解液處理至完全裂解，離心機(jī)離心，取上清液，用BCA試劑進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)蛋白濃度符合要求后，進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳(120 V電壓)、轉(zhuǎn)移、顯影等一系列處理之后，封閉并加已稀釋p-AMPK，ULK-1和LC3單克隆抗體(1 ∶1 000～3 000)，置于4 ℃環(huán)境16 h過(guò)夜，次日加羊抗兔二抗(1 ∶10 000)于室溫下進(jìn)行搖床孵育1 h，然后洗膜3次，加ECL發(fā)光試劑，再在光化學(xué)發(fā)光成像儀曝光、拍照。用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.5光鏡觀察 將固定于4%多聚甲醛溶液中的肺組織取出，通過(guò)梯度濃度酒精脫水、二甲苯浸透、浸蠟包埋一系列過(guò)程，然后再通過(guò)切片、粘片、脫蠟、醇化和蘇木精、伊紅染色，最后在顯微鏡下觀察、拍片；電鏡觀察：取在2.5%戊二醛固定的1×1 ×3 mm3肺組織，磷酸緩沖液清洗后，用1%鋨酸固定，再經(jīng)過(guò)脫水、置換、浸潤(rùn)、樹(shù)脂聚合包埋、修塊，切片。染色，最后在電鏡下觀察、拍片。

2 結(jié)果

2.1 藏藥四味黃芪散對(duì)暴露于低壓低氧下大鼠肺動(dòng)脈壓的影響低氧對(duì)照組大鼠暴露于低壓低氧環(huán)境后，隨暴露低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，肺動(dòng)脈壓力逐漸升高，特別是于暴露低氧d 7出現(xiàn)明顯的變化(28.5±7.25) mmHg，于低氧30 d，肺動(dòng)脈壓升高更加明顯，達(dá)到(34.8±4.30) mmHg(P<0.01)。藥物對(duì)照組大鼠暴露于低氧后，肺動(dòng)脈壓也會(huì)隨暴露低氧時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，但與低氧對(duì)照組相比，其升高速率明顯減緩(P<0.05)，于低氧15 d，出現(xiàn)肺動(dòng)脈壓的改變(24.2±2.68) mmHg，低氧30 d后其平均肺動(dòng)脈壓為(26.2±3.03) mmHg，明顯低于同期低氧對(duì)照組大鼠水平(Fig 1，2)。

Fig 1 Pulmonary artery pressure curves of rats in hypoxic control group and hypoxic drug group exposed to hypoxic at different time points

Fig 2 Comparison of mean pulmonary artery pressure of rats between hypoxic control group and hypoxia drug group at different time points of exposure to hypoxia

2.2 藏藥四味黃芪散對(duì)暴露于低壓低氧下大鼠左右心室比值的影響低氧對(duì)照組大鼠左右心室比值變化趨勢(shì)同肺動(dòng)脈壓變化，即隨暴露低氧時(shí)間延長(zhǎng)，左右心室比值逐漸升高，暴露低氧d 7為(0.41±0.05)，與暴露低氧d 1的0.24±0.03相比，變化最為明顯(P<0.05)，隨后增加相對(duì)比較緩慢，至低氧30 d，其比值為0.45±0.04。而藥物組暴露低氧d 7，其左右心室比值為0.31±0.04，而暴露低氧30 d，其比值為0.38±0.03，即其右心室肥厚程度明顯低于低氧對(duì)照組(P<0.05)

Fig 3 Comparison of left and right ventricular mass ratio between hypoxic control group and hypoxic drug group at different time points of exposure to hypoxic

2.3 藏藥四味黃芪散對(duì)暴露于低壓低氧下大鼠肺動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)的影響與常氧組相比，隨著暴露于低壓低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，低氧對(duì)照組和低氧藥物組大鼠肺動(dòng)脈壁均有逐漸增厚的趨勢(shì)，然而藥物組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖明顯低于低氧對(duì)照組(P<0.05)(Fig 4A)。

Fig 4A Comparison of pulmonary vascular wall thickness between hypoxic drug group and hypoxic control group at different time points of exposure to hypoxia

電鏡觀察發(fā)現(xiàn)隨著暴露低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，低氧對(duì)照組大鼠肺組織細(xì)胞線(xiàn)粒體出現(xiàn)腫脹、溶解、嵴斷裂和脫顆粒現(xiàn)象，也可見(jiàn)肺泡Ⅱ型細(xì)胞板層結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)空泡樣狀，于低氧d 3、7、15最為明顯。然而，低氧藥物組大鼠肺組織細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)損傷相對(duì)減輕。

2.4 藏藥四味黃芪散對(duì)暴露于低壓低氧下大鼠肺組織 AMPK蛋白及其信號(hào)通路的影響從Fig 5A和Fig 5B可以看出，暴露低氧3 d和7 d時(shí)，低氧對(duì)照組大鼠肺組織磷酸化AMPK蛋白水平明顯升高，而在暴露低氧d 15、30時(shí)，該蛋白表達(dá)水平逐漸降低。相比于低氧對(duì)照組，低氧藥物組大鼠肺組織磷酸化AMPK蛋白表達(dá)在整個(gè)低氧暴露期均呈現(xiàn)更高的水平，隨著暴露低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，其磷酸化AMPK蛋白雖有降低的趨勢(shì)，但仍比低氧對(duì)照組高。同樣，F(xiàn)ig 5A和Fig 5C顯示，無(wú)論低氧對(duì)照組或是低氧藥物組ULK-1蛋白水平呈現(xiàn)表達(dá)增加的現(xiàn)象，并隨暴露低氧時(shí)間的延長(zhǎng)而進(jìn)一步增加，低氧30 d后突然降低，但低氧藥物組仍高于低氧對(duì)照組。Fig 5A和Fig 5D顯示，自噬蛋白LC3Ⅱ表達(dá)水平隨暴露低氧時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，尤以藥物干預(yù)組增加更為明顯。

Fig 4B Comparison of type Ⅱ cell substructure changes in lung tissues of rats in different groups at different time points of hypoxic exposure(×12 000)

另外，對(duì)電鏡下自噬小體的觀察，無(wú)論是低氧對(duì)照組還是低氧藥物組，其共同點(diǎn)就是暴露低氧d 1，均觀察不到自噬小體，但從d 3起，兩組均出現(xiàn)自噬小體，并且以急性低氧期為明顯。不同點(diǎn)是，隨著暴露低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，低氧對(duì)照組自噬體減少，而低氧藥物組自噬體仍然維持在較高的數(shù)量，見(jiàn)Fig 5E。

Fig 5A Changes of p-AMPK，ULK-1 and LC3Ⅱ protein level in lung tissues of rats in different groups under hypoxic

Fig 5B Comparison of p-AMPK/β- actin levels of lung tissues of rats in hypoxic control group and hypoxic drug group

Fig 5C Comparison of ULK-1/β- actin levels of lung tissues of rats in hypoxic control group and hypoxic drug group

Fig 5D Comparison of LC3Ⅱ/β- actin levels of lung tissues of rats in hypoxic control group and hypoxia drug group

Fig 5E Observation and comparison of autophagy corpuscles in lung tissues of rats exposed to hypoxic at different time points(×6 000)

3 討論

高原低氧環(huán)境對(duì)肺組織的影響是十分復(fù)雜的，特別是自噬活動(dòng)對(duì)肺組織細(xì)胞的影響存在兩面性：損傷(或增殖)和修復(fù)(抑制)。兩者之間的轉(zhuǎn)換機(jī)制并不十分清楚，但自噬活動(dòng)最初的目的就是對(duì)已經(jīng)損傷的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，而對(duì)于無(wú)法修復(fù)的細(xì)胞通過(guò)過(guò)度激活的自噬活動(dòng)將進(jìn)一步觸發(fā)凋亡程序[3]。另一方面，自噬活動(dòng)可具有抑制干細(xì)胞增殖[4]和平滑肌細(xì)胞增殖[5]的作用。本研究的生理、形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，藏藥四味黃芪散能夠明顯緩解低氧引起的大鼠肺動(dòng)脈壓升高及右心室肥厚，尤其減緩了血管平滑肌層的厚度。這種作用機(jī)制是否與自噬活動(dòng)有關(guān)？通過(guò)對(duì)AMPK自噬信號(hào)通路各蛋白測(cè)定，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是低氧或是藥物均能增強(qiáng)自噬活動(dòng)，而且與暴露低氧時(shí)間密切相關(guān)。雖然，低氧會(huì)促進(jìn)AMPK蛋白的上調(diào)[6-7]，但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性低氧期磷酸化AMPK蛋白水平增加十分明顯，但在慢性低氧期，其水平略有降低趨勢(shì)，其原因可能與急性低氧損傷啟動(dòng)了以自噬等修復(fù)功能為主的代償反應(yīng)，隨著慢性低氧對(duì)機(jī)體損傷的減弱，其自噬活動(dòng)也出現(xiàn)相應(yīng)的改變，也或許出現(xiàn)了自噬活動(dòng)的“鈍化”現(xiàn)象。而四味黃芪散可以進(jìn)一步上調(diào)磷酸化AMPK蛋白的表達(dá)，能夠保持AMPK在一定水平以維持其適宜的自噬活動(dòng)，有助于對(duì)細(xì)胞損傷的修復(fù)和平滑肌細(xì)胞增殖的抑制，該藥的抗慢性低氧效果要比抗急性低氧的效果明顯。同樣，對(duì)AMPK自噬信號(hào)通路中的下游蛋白ULK-1和自噬蛋白LC3I和LC3Ⅱ水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是低氧對(duì)照組或是藥物干預(yù)組，ULK-1和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平均隨暴露低氧時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，低氧藥物組肺組織中的ULK-1和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平在低氧初期雖高于常氧對(duì)照組，但仍低于低氧對(duì)照組。然而，隨著暴露低氧的延長(zhǎng)，特別是在低氧15 d以后，四味黃芪散上調(diào)ULK-1和LC3Ⅱ的作用明顯提高。急性期ULK-1和LC3Ⅱ蛋白增高，表明組織受急性低氧損傷的同時(shí)，自噬修復(fù)能力也增強(qiáng)。但自噬活動(dòng)不是越強(qiáng)越好，過(guò)度自噬會(huì)觸發(fā)凋亡程序[8-9]，甚至加重細(xì)胞的死亡[10-11]。

因此，急性低氧期，四味黃芪散能夠適當(dāng)降低其自噬水平，可能與其防止平滑肌細(xì)胞自噬的過(guò)度活動(dòng)有關(guān)，而慢性低氧下，低氧誘導(dǎo)的自噬活動(dòng)逐漸減弱，但平滑肌細(xì)胞增殖逐漸增強(qiáng)，其時(shí)藥物能夠增強(qiáng)自噬活動(dòng)發(fā)揮預(yù)防肺動(dòng)脈平滑肌的過(guò)度增殖，該藥物所具有的的兩面性可能與其所特有的調(diào)理作用有關(guān)。研究的結(jié)果還表明，急、慢性低氧下磷酸化AMPK、ULK-1和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平并非完全一致，可能與該信號(hào)通路的調(diào)節(jié)復(fù)雜性有關(guān)，如mTOR蛋白水平，一種抗凋亡因子，因?yàn)閁LK-1蛋白可以被mTOR蛋白所抑制[12-13]。另外，自噬活動(dòng)并非AMPK-ULK-1這一條途徑調(diào)控，還受其他自噬信號(hào)通路或自噬蛋白、抗凋亡蛋白的調(diào)節(jié)，如Becline-1、Bcl-2等。有研究認(rèn)為磷酸化AMPK和總AMPK蛋白對(duì)下游蛋白皆有調(diào)節(jié)，只是調(diào)節(jié)的程度存在差異[14-15]，甚至有研究[16]認(rèn)為，藥物激活A(yù)MPK不僅僅使ɑ亞基的磷酸化，也可以使AMPK復(fù)合物全部被激活的可能，這些因素也導(dǎo)致磷酸化AMPK水平與其下有游蛋白存在不一致。當(dāng)然，大量的研究發(fā)現(xiàn)，自噬活動(dòng)與平滑肌細(xì)胞的增殖活動(dòng)仍然存在矛盾的地方，而本研究所表現(xiàn)出藥物對(duì)自噬活動(dòng)的干預(yù)能否闡明低氧下肺血管重構(gòu)有關(guān)？仍值得關(guān)注。