宗梅 韓碩 郭寧 段蒙蒙 劉凡 王桂香

（北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蔬菜種質(zhì)改良北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100097）

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因生物安全問(wèn)題越來(lái)越引發(fā)人們的關(guān)注，這也是決定轉(zhuǎn)基因技術(shù)能否廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題?；贑RISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)在創(chuàng)制無(wú)外源片段插入的非轉(zhuǎn)基因突變材料方面具有很大的潛力。通?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因后代有性繁殖分離和標(biāo)記選擇去除含Cas9/sgRNA的外源載體，并保留編輯突變的方法獲得安全的非轉(zhuǎn)基因改良材料。同時(shí)，CRISPR/Cas9技術(shù)也提供了無(wú)需后代分離而直接獲得非轉(zhuǎn)基因突變株的可能。如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Cas9的瞬時(shí)表達(dá)［1-2］，及Cas9/sgRNA核糖核蛋白復(fù)合物（ribonucleoprotein complex，RNP）直接應(yīng)用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等［3-5］。然而，無(wú)論原生質(zhì)體還是離體轉(zhuǎn)化都要依賴于組織培養(yǎng)，受受體材料基因型和外植體類型的再生能力限制，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化不成功、效率低，及轉(zhuǎn)化體系不穩(wěn)定等問(wèn)題。因此，研究不依賴于組織培養(yǎng)的方法，通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)直接創(chuàng)制非轉(zhuǎn)基因突變體具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

白菜（Brassica campestris）是十字花科蕓薹屬的大眾蔬菜種類之一，自交不親和性較強(qiáng)，需要長(zhǎng)時(shí)間的春化才能開(kāi)花，利用物理或化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)突變和創(chuàng)造新種質(zhì)的難度較大［6］?；诮M織培養(yǎng)的傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因研究表明，白菜的外植體出芽困難、轉(zhuǎn)化效率低，造成其轉(zhuǎn)化技術(shù)研究進(jìn)展緩慢［7-9］，也阻礙了CRISPR/Cas9技術(shù)在白菜中的廣泛應(yīng)用。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法（floral-dip）是一種不依賴組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因方法，避開(kāi)組織培養(yǎng)和離體再生，直接獲得轉(zhuǎn)基因的種子，方法簡(jiǎn)單，省時(shí)省力，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于擬南芥。很多學(xué)者也利用經(jīng)過(guò)改良的floral-dip方法對(duì)白菜進(jìn)行原位轉(zhuǎn)化研究，并取得了一些可喜進(jìn)展，尤其在與擬南芥親緣關(guān)系較近的蕓薹屬植物中取得了一些成果。張廣輝等［10］和Liu等［11］通過(guò)真空滲入原位轉(zhuǎn)化法對(duì)白菜和油菜成功進(jìn)行轉(zhuǎn)化，為蕓薹屬蔬菜遺傳轉(zhuǎn)化提供了一條新途徑。嚴(yán)繼勇［12］采用真空抽濾轉(zhuǎn)化法對(duì)大白菜進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，付紹紅［13］對(duì)甘藍(lán)型油菜浸花法轉(zhuǎn)化進(jìn)行了系統(tǒng)研究。Xu 等［14］、He等［15］和 Chen 等［16］分別報(bào)道了真空轉(zhuǎn)化法在蕓薹屬小白菜、甘藍(lán)型油菜和烏塌菜轉(zhuǎn)化中的成功應(yīng)用，但原位轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較低，為0.01%左右。

菜薹又稱菜心（Brassica campestris L.ssp.chinensis），為不結(jié)球白菜類型中以幼嫩花莖為主要食用器官的一個(gè)常規(guī)栽培品種，播種至產(chǎn)品收獲需40-60 d，無(wú)需春化，生育期短，是研究白菜類蔬菜原位轉(zhuǎn)化技術(shù)的好材料。目前雖有菜薹原位轉(zhuǎn)化和CRISPR/Cas9基因編輯體系應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道［17-18］，但是尚未有將原位轉(zhuǎn)化和CRISPR/Cas9技術(shù)相結(jié)合創(chuàng)制菜薹非轉(zhuǎn)基因突變株的相關(guān)報(bào)道。

本研究通過(guò)真空滲入結(jié)合農(nóng)桿菌浸花法，擬實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9體系在菜薹原位轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，并通過(guò)Cas9和gRNA的瞬時(shí)表達(dá)，獲得無(wú)外源片段插入的非轉(zhuǎn)基因植株，旨在為無(wú)選擇標(biāo)記的基因編輯技術(shù)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2020年3-5月、8-10月在北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所溫室進(jìn)行，供試材料為早熟菜薹商品種‘49菜心’。種子分批播種在溫室營(yíng)養(yǎng)缽中，約40 d后，開(kāi)花植株達(dá)到50-60 cm，進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)化處理。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯載體pBSE401［19］，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)陳其軍教授課題組惠贈(zèng)，北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所田守蔚老師對(duì)載體進(jìn)行了Bar選擇標(biāo)記改造。依照Tian等［20］方法構(gòu)建載體，將等體積100 μmol/L的引物PDS-F和PDS-R（表1）混合，95℃孵育5 min，緩慢冷卻至室溫。由于2條引物靶點(diǎn)序列的互補(bǔ)配對(duì)和引物兩端添加的接頭，得到一個(gè)帶有Bsa I酶切末端的雙鏈DNA片段，可以與pBSE401載體上的Bsa I酶切位點(diǎn)切割并連接。因此可利用Bsa I和T4連接酶（New England Biolabs，Ipswich，MA，USA）將此DNA短片段組裝到pBSE401載體上。

1.2.2 真空滲透法轉(zhuǎn)化菜薹植株 按照He等［15］方法進(jìn)行菜薹浸花原位轉(zhuǎn)化。用一個(gè)含有20 L農(nóng)桿菌懸浮液的干燥器，將植株整個(gè)花序浸入農(nóng)桿菌懸浮液中，用連接到干燥器的真空泵抽真空，使干燥器內(nèi)部形成負(fù)壓環(huán)境，壓力約104Pa，持續(xù)5 min；隨后打開(kāi)控制閥，使處理器內(nèi)壓力慢慢恢復(fù)正常，再次抽真空（約104Pa，持續(xù)5 min）。從干燥器中取出處理后的植株，移載至溫室中，并進(jìn)行人工授粉，收獲種子。

1.2.3 轉(zhuǎn)化菜薹種子苗的初步檢測(cè) 用于轉(zhuǎn)化的pBSE401載體攜帶除草劑草丁膦抗性基因Bar，Bar檢測(cè)試紙條（a07-13-413北京奧創(chuàng)生物有限公司，中國(guó)北京）可以快速檢測(cè)極微量的Bar蛋白。鑒于測(cè)試樣品較多，采用了混合樣品測(cè)定，用打孔器取直徑0.5 cm的鮮嫩葉片，每30株為一組，混合放入研缽中，加入20 mL的ddH2O，研磨成汁，用Bar試紙測(cè)試液體。如果混合樣本產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果，則可以通過(guò)減少混合樣本數(shù)量來(lái)找到目標(biāo)陽(yáng)性單株。

1.2.4 基因編輯植株的分子鑒定 使用植物DNA小提試劑盒（Qiagen，CA）提取菜薹基因組DNA，用設(shè)計(jì)的Cas9和gRNA特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物PDS-1和PDS-356擴(kuò)增包含靶點(diǎn)區(qū)的PDS基因片段，所用引物具體序列見(jiàn)表1。純化PCR產(chǎn)物測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果顯示PDS基因發(fā)生編輯的PCR樣品進(jìn)行克隆，隨機(jī)選取單克隆20個(gè)，進(jìn)行單克隆測(cè)序。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 基因編輯靶點(diǎn)選擇與載體構(gòu)建

八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）作為類胡蘿卜素生物合成途徑的關(guān)鍵酶，是葉綠素合成所必須的。PDS基因的敲除會(huì)使植株產(chǎn)生白化性狀，便于識(shí)別。因此，選取白菜PDS基因?yàn)榘谢颍湓贜CBI（National Center for Biotechnology Information） 數(shù) 據(jù)庫(kù)的基因編號(hào)為：103863556。如圖1-a所示，‘49菜心’的PDS基因含4個(gè)外顯子，第一外顯子最末端的序列選為靶點(diǎn)gRNA，圖中用下劃線序列標(biāo)識(shí)，紅色字體序列CCC（互補(bǔ)序列為GGG）表示PAM（protospacer adjacent motif，NGG）區(qū)，將靶點(diǎn)gRNA克隆到pBSE401載體上（圖1-b），經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確，完成基因編輯載體構(gòu)建。

2.2 種子苗的轉(zhuǎn)化鑒定

利用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)，通過(guò)真空滲透浸花法轉(zhuǎn)化‘49菜心’花芽。分3批共轉(zhuǎn)化菜心25株，收獲種子2 000余粒。將獲得的種子播種后，得到2 032株種子苗。首先用Bar試紙條對(duì)這些幼苗進(jìn)行抗性檢測(cè)，結(jié)果顯示，2 032株幼苗中只有一株（#1）陽(yáng)性苗。提取其DNA進(jìn)行外源載體的PCR檢測(cè)，可以擴(kuò)增出Cas9和sgRNA條帶。

2.3 表型及基因編輯鑒定

#1陽(yáng)性植株的表型與野生型一致，沒(méi)有表現(xiàn)出PDS基因敲除應(yīng)該表現(xiàn)的白化、矮小等性狀。但有2株（#2和#3）表現(xiàn)出明顯矮小、白化的表型（圖1-d），表明其PDS基因可能發(fā)生敲除突變。提取白化幼苗#2和#3的DNA，未能檢測(cè)到Cas9和sgRNA的載體片段。對(duì)#1、#2和#3植株的PDS基因進(jìn)行擴(kuò)增和基因編輯鑒定，結(jié)果（圖1-c）表明，這3株植株的PDS基因靶點(diǎn)區(qū)域均發(fā)生多峰變化。單克隆測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步顯示#1植株的PDS基因發(fā)生雜合編輯，野生型等位基因保留；而#2和#3植株的PDS基因靶點(diǎn)區(qū)均發(fā)生了不同類型的插入或缺失突變（圖1-e），未檢測(cè)到野生型等位基因。

圖1 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過(guò)真空滲透原位轉(zhuǎn)化獲得菜薹PDS突變體Fig.1 CRISPR/Cas9-mediated gene editing and vacuum infiltration in planta transformation to creates PDS mutants in B.campestris

3 討論

利用CRISPR/Cas9技術(shù)，不經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)直接獲得非轉(zhuǎn)基因突變體具有重要的研究?jī)r(jià)值。本研究以敲除PDS引起的白化表型作為可視標(biāo)記，獲得2株沒(méi)有任何外源篩選標(biāo)記的菜心突變體和1株有外源載體插入的編輯株。2 032株幼苗中有3株發(fā)生基因編輯突變，突變率為0.15%，遠(yuǎn)高于前人報(bào)道的通過(guò)真空滲透法進(jìn)行的有外源序列插入的植株轉(zhuǎn)化效率（0.01%）［7，10，14-15］。本研究結(jié)果顯示，真空滲透原位轉(zhuǎn)化可以不經(jīng)過(guò)植物組織培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)基因編輯。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，通過(guò)真空滲透瞬時(shí)表達(dá)可以產(chǎn)生多等位基因、無(wú)外源片段插入的突變體。該方法適用于蕓薹屬蔬菜，并且可為其他作物，特別是雜合和多年生作物的基因編輯提供參考。

在實(shí)際應(yīng)用中，絕大多數(shù)用于作物改良所需的突變不會(huì)在發(fā)育早期表現(xiàn)出可視的表型。如果不能簡(jiǎn)單地從植物的表型中確定目標(biāo)基因控制的性狀，或者如本研究中#1植株，目標(biāo)基因發(fā)生了雜合突變，未能產(chǎn)生可見(jiàn)表型，將會(huì)給突變株鑒定帶來(lái)困難?，F(xiàn)有檢測(cè)方法是在一定數(shù)量樣本的混合物中鑒定編輯突變，然而這種方法的有效性取決于樣本的數(shù)量和突變效率。如果樣本數(shù)量非常大，突變效率較低，則需要更有效的檢測(cè)方法。Chen等［1］報(bào)道了利用兩步法通過(guò)高通量測(cè)序篩選一定數(shù)量混合群體，并通過(guò)高分辨率溶解曲線分析鑒定突變個(gè)體，這種方法可嘗試用于本研究中的突變體鑒定。相信隨著現(xiàn)有技術(shù)的發(fā)展，在大樣本量中檢測(cè)突變個(gè)體會(huì)越來(lái)越經(jīng)濟(jì)、快速和準(zhǔn)確。

4 結(jié)論

不經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)的真空滲透原位轉(zhuǎn)化可以在菜薹中實(shí)現(xiàn)基因編輯。外源載體沒(méi)有整合到植物的基因組中，通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)CRISPR/Cas9系統(tǒng)，獲得無(wú)標(biāo)記的非轉(zhuǎn)基因菜薹突變體。