鄭青波 葉娜 張嘵蘭 包鵬甲 王福彬 任穩(wěn)穩(wěn) 廖月姣閻萍 潘和平

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050）

天祝白牦牛是甘肅省天祝藏族自治縣一種獨(dú)有的牦牛地方品種，主要集中在海拔3 000 m以上的高寒草原上，有著草原“白珍珠”和祁連“雪牡丹”的美譽(yù)［1］。牦牛能在高寒高海拔地帶生存得益于獨(dú)特的混合型毛被結(jié)構(gòu)，周身被毛可分為粗毛、絨毛和兩型毛。天祝白牦牛毛具有含絨率高、可紡性好以及被毛純白等特點(diǎn)，因而被稱為“雪絨”產(chǎn)品［2］，是一種獨(dú)特的毛紡工業(yè)原料資源，具有較高的商業(yè)價(jià)值，備受國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)青睞。毛囊隸屬于皮膚的亞器官是產(chǎn)生毛發(fā)的基本單位。哺乳動(dòng)物出生后毛囊呈周期性生長(zhǎng)發(fā)育，分為生長(zhǎng)期、退行期和休止期。毛囊周期性生長(zhǎng)使牦牛能夠在秋冬時(shí)節(jié)長(zhǎng)出絨毛來抵御高原高寒，在春夏時(shí)節(jié)褪去絨毛給機(jī)體增加散熱，這對(duì)其適應(yīng)高寒環(huán)境具有重要意義。毛囊的周期性循環(huán)需要不同類型細(xì)胞相互協(xié)調(diào)和諸多信號(hào)通路的調(diào)控。退行期的毛發(fā)停止生長(zhǎng)，毛囊開始皺縮，與生長(zhǎng)期相比，毛囊形態(tài)、細(xì)胞類群及相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)和互作也發(fā)生巨大變化。探究退行期毛囊細(xì)胞類群和基因表達(dá)情況，對(duì)牦牛毛囊發(fā)育過程中不同細(xì)胞類型調(diào)控規(guī)律的研究具有重要意義。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（single cell RNA sequencing，scRNA-seq）通過二代測(cè)序技術(shù)在單個(gè)細(xì)胞水平上對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，能夠分析單個(gè)細(xì)胞間遺傳和基因表達(dá)水平的差異，解決組織和器官發(fā)育過程中細(xì)胞異質(zhì)性難題。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序直觀地反應(yīng)了單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)情況，能更好地揭示細(xì)胞種類、亞型和狀態(tài)［3-4］。北京大學(xué)湯富酬教授2009年在Nature Methods上首次報(bào)道了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究，從而揭開了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究時(shí)代的序幕［4］。近幾年scRNA-seq技術(shù)以及下游數(shù)據(jù)生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，使其在單個(gè)試驗(yàn)中可同時(shí)分析上萬個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息，并已成為胚胎發(fā)育，器官分化，癌癥發(fā)生以及構(gòu)建細(xì)胞圖譜等研究最有力的研究手段。為探究天祝白牦牛毛囊在退行期發(fā)育過程中不同類型細(xì)胞的功能，本研究采用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)天祝白牦牛退行期毛囊進(jìn)行異質(zhì)性分析，利用已知標(biāo)記分子對(duì)細(xì)胞類群進(jìn)行篩選鑒定，并對(duì)鑒定得到的細(xì)胞類群進(jìn)行GO等分析，研究結(jié)果將為進(jìn)一步探究牦牛毛囊發(fā)育規(guī)律以及發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

皮膚樣品來自甘肅省武威市天?？h天祝白牦牛育種場(chǎng)。

主要試劑：中性樹脂、二甲苯、DAPI、BSA、DynabeadsTMMyOneTMSILANE PN-2000048、Chromium i7 MuLtiplex Kit、ChromiumTMSingle Cell 3′Library& Gel Bead Kit v3、ChromiumTMSingle Cell A Chip Kit等。

主要儀器：包埋機(jī)、病理切片機(jī)、熒光掃描顯微鏡、10×Genomics Chromium 微流控平臺(tái)（10×Genomics）；10×Genomics Chromium Controller（10×Genomics）；Illumina NovaSeq 6000；Agilent 2100 Bioanalyze（Agilent）等。

1.2 方法

1.2.1 皮膚組織切片與HE染色 將皮膚表面的絨毛與粗毛除凈，切成較小的組織塊，在用固定液固定24 h以上。將目的部位組織修理平整，放進(jìn)脫水機(jī)內(nèi)用梯度酒精進(jìn)行脫水浸蠟。再將融化的蠟放入包埋框內(nèi)，在蠟?zāi)讨皩⒔M織取出，放-20℃條件下冷卻。用切片機(jī)將組織塊切成4 μm的薄片，把切片攤于溫水上，用載玻片將組織撈起，并在60℃條件下進(jìn)行烤片。待蠟烤化后進(jìn)行脫蠟、伊紅染色和中性樹膠封片，等晾干后可進(jìn)行觀察。

1.2.2 免疫熒光組化分析 先將組織切片進(jìn)行脫蠟，再用抗原修復(fù)緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，用組化筆畫圈，甩干PBS，滴加3%的BSA進(jìn)行封閉。在切片上滴加稀釋好的一抗，然后放入濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，將切片用PBS洗滌，待切片稍干后滴加二抗，進(jìn)行避光孵育，最后滴加DAPI進(jìn)行染核，用抗熒光淬滅封片劑封片。

1.2.3 單細(xì)胞懸液制備 選擇2歲左右健康的天祝白牦牛3只，均為母牛。采集退行期肩胛處皮膚組織，清洗消毒后置于組織保護(hù)液中帶回實(shí)驗(yàn)室。在超凈工作臺(tái)繼續(xù)用PBS和75%酒精清洗消毒，用0.25%的dispase 酶消化2 h，拔出單根毛發(fā)置于培養(yǎng)皿中，將胰蛋白酶消化后的毛發(fā)放在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否脫落。后經(jīng)反復(fù)吹打、過濾、離心和重懸獲得細(xì)胞懸液，最后進(jìn)行計(jì)數(shù)和單細(xì)胞活力檢測(cè)。

1.2.4 10 ×Genomics單細(xì)胞測(cè)序 由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司完成單細(xì)胞文庫的構(gòu)建和測(cè)序?；?0×Genomics ChromiumTM系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，含有Barcode 信息的Gel Beads 與細(xì)胞的油珠混合形成GEMs。每個(gè)GEM 中，細(xì)胞破裂后釋放的mRNA被反轉(zhuǎn)錄成帶有Barcode的cDNA。然后將所有細(xì)胞的cDNA 收集到一起，擴(kuò)增后按Illumina 測(cè)序文庫構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行測(cè)序文庫構(gòu)建。再用 Qubit 2.0進(jìn)行初步定量。然后用Agilent 2100對(duì)文庫中的Insert DNA大小進(jìn)行檢測(cè)。Insert DNA大小符合預(yù)期后，使用QPCR方法對(duì)文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。庫檢合格后，使用Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)進(jìn)行PE150測(cè)序。

1.2.5 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控與下游分析 對(duì)單細(xì)胞測(cè)序得到的原始序列進(jìn)行過濾。去除N的個(gè)數(shù)大于3和含adaptor的Reads。檢測(cè)有無AT、GC分離現(xiàn)象。使用10×Genomics官方分析軟件CellRanger進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)，用CellRanger中的STAR對(duì) Reads 進(jìn)行參考基因組剪接識(shí)別比對(duì)。通過CellRanger糾正UMI序列中的測(cè)序錯(cuò)誤。CellRanger完成后就可以對(duì)scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。本研究通過R語言Seurat包對(duì)低質(zhì)量細(xì)胞進(jìn)行過濾剔除，再用NormalizeData函數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，之后用降維算法將表達(dá)矩陣降低到重要特征值，使用主成分分析將表達(dá)矩陣的維度從Cells×Genes降低到cell×M，同時(shí)將數(shù)據(jù)傳遞到具有可視化的UMAP中，在最大限度保留原始數(shù)據(jù)特征的同時(shí)降低數(shù)據(jù)維度，在質(zhì)量控制和scRNA-seq數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，得到聚類的細(xì)胞cluster結(jié)果。

1.2.6 細(xì)胞類群鑒定 細(xì)胞類群根據(jù)已知marker基因進(jìn)行鑒定，如表1所示。

表1 細(xì)胞類型標(biāo)記分子Table 1 Cell type marker molecules

1.2.7 GO富集分析 GO 富集分析采用Metascape（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）對(duì)差異基因進(jìn)行 GO 富集分析，同時(shí)用R語言將調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的基因名稱轉(zhuǎn)化為基因的ID，應(yīng)用ClusterProfiler包、Ggplot2包、Enrichplot包從生物學(xué)途徑（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）3個(gè)方面對(duì)潛在通路進(jìn)行GO富集分析，并將BP、CC、MF前10條進(jìn)行可視化。

1.2.8 KEGG與基因互作分析 運(yùn)用Metascape篩選出P-adjust值＜0.01，細(xì)胞相關(guān)通路頻次≥3的特征基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析和基因互作分析。

2 結(jié)果

2.1 毛囊結(jié)構(gòu)

通過HE染色可以直觀的觀察到毛囊結(jié)構(gòu)情況，確定毛囊發(fā)育時(shí)期。根據(jù)毛囊的形態(tài)可以清晰的觀察到天祝白牦牛毛囊IRS、Bulb、ORS、HS等基本結(jié)構(gòu)。退行期毛干部分脫落，毛囊群開始變得不完整，部分細(xì)胞已經(jīng)凋亡，毛乳頭和基質(zhì)減少，毛球萎縮變小，同時(shí)毛囊中出現(xiàn)空腔如圖1所示。

圖1 天祝白牦牛皮膚組織結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Skin tissue structure of Tianzhu white yak

2.2 單細(xì)胞數(shù)據(jù)質(zhì)控

通過scRNA-seq技術(shù)分析天祝白牦牛毛囊退行期肩胛部皮膚單細(xì)胞基因表達(dá)情況，獲得退行期毛囊大約12 000個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息。比對(duì)到基因組上的比率為93.3%，基因中位數(shù)為927，測(cè)序飽和度為70.7%，平均Reads數(shù)為62 282。數(shù)據(jù)整體質(zhì)量可靠。使用 Read 10×函數(shù)讀取細(xì)胞表達(dá)矩陣，創(chuàng)建Seruratd對(duì)象，用FilterCells函數(shù)過濾低質(zhì)量細(xì)胞，僅保留至少在3個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的基因以及表達(dá)量不低于 200 個(gè)基因的細(xì)胞，本試驗(yàn)根據(jù)樣本中每個(gè)細(xì)胞的總UMI數(shù)目、表達(dá)基因數(shù)目以及線粒體基因表達(dá)占比分布（圖2-A），對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步篩選，保留基因數(shù)在200-4 000且線粒體基因表達(dá)量小于5%的細(xì)胞，用于后續(xù)分析。同時(shí)還分析了基因數(shù)與UMI數(shù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.92，說明UMI數(shù)越高，基因數(shù)也就越高，相關(guān)性符合預(yù)期（圖2-B）。

圖2 檢測(cè)到的細(xì)胞中基因數(shù)與UMI總數(shù)統(tǒng)計(jì)以及相關(guān)性分析Fig.2 Statistics and correlation analysis of gene number and total UMI in detected cells

2.3 高變基因分析

為保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，利用Seurat選擇前2 000個(gè)高變基因進(jìn)行后續(xù)的基因表達(dá)矩陣降維和細(xì)胞聚類分析。圖3展示了所有細(xì)胞中基因表達(dá)豐度的變異情況，并挑選出在細(xì)胞間變異系數(shù)最大的前10個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)KRT85、KRT25、PMP2、KLK7等基因在毛囊退行期變異系數(shù)較大。

圖3 基因離散度分布圖Fig.3 Gene dispersion distribution map

2.4 主成分分析

通過正交變換將一系列可能存在線性相關(guān)的變量轉(zhuǎn)換為一系列線性不相關(guān)的新變量，再將新變量放在更小的維度下展示數(shù)據(jù)的特征，并用散點(diǎn)圖的形式進(jìn)行多維數(shù)據(jù)的可視化。結(jié)果如圖4-A所示，每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞所在的位置，聚集在一起的點(diǎn)代表這些細(xì)胞具有一定的相關(guān)性，距離越近說明其相關(guān)程度越高。挑選出已知在細(xì)胞間變異系數(shù)最大的前4個(gè)基因，觀察其在散點(diǎn)圖中的分布情況（圖4-B）。挑選前20個(gè)主成分進(jìn)行計(jì)算，之后進(jìn)行UMAP聚類分析（圖4-C）。

圖4 主成分分析Fig.4 Principal component analysis

2.5 聚類與主要細(xì)胞類型鑒定

Seurat 中的表達(dá)矩陣使用 PCA分析之后，再采用 UMAP 進(jìn)行降維，得到了14個(gè)細(xì)胞cluster（圖5-A），根據(jù)已知的標(biāo)記基因?qū)γ總€(gè) cluster 的細(xì)胞類型進(jìn)行鑒定（圖5-B），結(jié)果顯示cluster 0，3，8，9表達(dá)表皮細(xì)胞（epidermal）的標(biāo)記基因 KRT14，KRT15；cluster1，4，10表達(dá)濾泡間上皮分化細(xì)胞（interfollicular epidermis differentiated cell，IFE-DC）標(biāo)記基因 KRT10，KRTDAP；cluster2，6 表達(dá)毛干（hair shaft，HS）細(xì)胞標(biāo)記基因 SPARC，LHX2；cluster5表達(dá)內(nèi)根鞘細(xì)胞（inner root sheath，IRS）標(biāo)記基因KRT28，KRT71；cluster7表達(dá)漏斗細(xì)胞（infundibulum，INFU）標(biāo)記基因TOP2A，UBE2C；cluster13表達(dá)黑素細(xì)胞標(biāo)記基因PMEL，TYRP1（圖5-C）。其中特征基因 KRT71、KRT28、TOP2A、UBE2C、TYRP1、PMEL在不同細(xì)胞類型中的表達(dá)水平如圖5-D所示。

圖5 UMAP聚類與主要類型細(xì)胞鑒定Fig.5 UMAP clustering and identification of major cell types

2.6 主要細(xì)胞類型的分子特征

在對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行不同類型聚類之后，利用點(diǎn)狀圖進(jìn)一步對(duì)每個(gè)cluster特異性表達(dá)的基因進(jìn)行比較分析。結(jié)果如圖6所示，表皮細(xì)胞高表達(dá) KRT14、KRT15、KRT5；IFE-DC高 表 達(dá) KRT1、KRT10、KRTDAP、SBSN；Hair shaft高表達(dá)SPARC、LHX2、CXCL14、LGR5；IRS高 表 達(dá) KRT28、KRT-27、KRT71、DLX3；INFU高表達(dá)TOP2A、UBE2C、CKAP2、CENPE、DLX3；黑色素細(xì)胞高表達(dá)PMEL、TYRP1、PECAM1、RGS1。

圖6 不同細(xì)胞類群差異基因比較分析Fig.6 Comparative analysis of differential genes in different cell clusters

2.7 不同細(xì)胞類型富集分析

對(duì)聚類之后主要細(xì)胞類群進(jìn)行富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表皮細(xì)胞聚類得到0、3、8、9共4個(gè)cluster，特異表達(dá)基因分別為460、408、655、690個(gè)。GO富集結(jié)果顯示，4個(gè)亞群主要富集在GO：0008544表皮發(fā)育、GO：0030855上皮細(xì)胞分化、GO：0009611損傷應(yīng)答、GO：0000904調(diào)控細(xì)胞形態(tài)發(fā)生等生物過程，而circos圖也顯示，這4個(gè)亞群之間存在密集的共同信號(hào)通路（圖7-A）；IFE-DC細(xì)胞聚類得到1、4、10共3個(gè)cluster，分別有582、1 061、341個(gè)特異表達(dá)基因，GO富集結(jié)果顯示：這3個(gè)亞群主要富集在GO：0008544表皮發(fā)育、GO：0097435超纖維組織發(fā)育、GO：0030155細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)以及GO：0048729組織形態(tài)發(fā)生等生物過程中，同時(shí)circos圖顯示，這3個(gè)亞群之間存在許多相同基因以及富集通路（圖7-B）。

圖7 表皮細(xì)胞系與IFE-DC細(xì)胞不同cluster特征基因富集分析Fig.7 Enrichment analysis of different clusters characteristic genes in epidermal cell lineage and IFE-DC

HS聚類得到2、6共2個(gè)cluster，分別有480、669個(gè)特異表達(dá)基因，通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)亞群主要富集在GO：0008544表皮發(fā)育、GO：0034330細(xì)胞連接、GO：0000165 MAPK級(jí)聯(lián)激活以及GO：0048729組織形態(tài)發(fā)生等生物過程（圖8-A）。對(duì)黑色素細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)了752個(gè)差異基因，GO富集結(jié)果顯示黑色素細(xì)胞主要富集在GO：0030155細(xì)胞黏附的調(diào)控、GO：0030855上皮細(xì)胞分化、GO：0030335細(xì)胞遷移的正向調(diào)控以及GO：0030029肌動(dòng)蛋白等生物過程（圖8-B）。

圖8 HS與黑色素細(xì)胞特征基因富集分析Fig.8 Enrichment analysis of HS and melanocytes characteristic genes

對(duì)INFU進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其BP共有486個(gè)條目，主要與表皮發(fā)育、上皮細(xì)胞增殖、肌動(dòng)蛋白絲以及細(xì)胞-底物黏附等有關(guān)；CC分析中共有82個(gè)條目，主要包括細(xì)胞-底物連接、黏著斑通路、細(xì)胞間連接以及細(xì)胞皮層；MF分析中共有27個(gè)條目，主要富集在鈣粘蛋白結(jié)合、肌動(dòng)蛋白結(jié)合以及肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合等條目中（圖9-A）。對(duì)IRS進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其BP共有733個(gè)條目，主要與核糖核蛋白復(fù)合體的生物發(fā)生、ncRNA代謝過程和表皮發(fā)育等相關(guān)；CC分析中共有104個(gè)條目，特征基因主要富集在細(xì)胞-底物連接、黏著斑通路等GO通路；MF分析中共有63個(gè)條目，主要富集于轉(zhuǎn)錄核心調(diào)節(jié)因子活性和鈣黏蛋白結(jié)合等條目中（圖9-B）。

圖9 INFU細(xì)胞與IRS細(xì)胞特征基因的GO富集分析Fig.9 GO enrichment analysis of characteristic genes in INFU and IRS cells

通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)，Epidermal特征基因主要富集于ko03010：核糖體、ko04520：黏附連接等通路；IFE-DC特征基因主要富集于ko03050：蛋白酶體等通路；HS特征基因主要富集于ko04530：緊密連接、ko04360：軸子引導(dǎo)等通路；IRS特征基因主要富集于ko03030：DNA復(fù)制、ko03040：剪接體等通路；INFU特征基因主要富集于ko03050：蛋白酶體、ko03013：RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、ko04110：細(xì)胞周期、ko03030：DNA復(fù)制、ko03040：剪接體等通路；Melanocyte特征基因主要富集于ko03010：核糖體、ko04360：軸子引導(dǎo)信號(hào)通路等（圖10-A）。運(yùn)用metascape對(duì)特征基因進(jìn)行互作分析，獲得不同類型細(xì)胞基因互作網(wǎng)絡(luò)圖，共同靶基因有28個(gè)，分別為FKBP4、KRT1、KRT80、KRT17、KRT10、RPL15、RPL8、RPL14、NSA2、HSPA8、GJA1、CLTB、LGALS1、CST3、DSG2、PERP、PKP1、DSC2、JUP、DSG1、DSP、LGALS3、COL17A1、FGFR2、NCK1、GGT6、LY6G6C、CD109（圖10-B）。

圖10 不同細(xì)胞類群特征基因KEGG富集分析Fig.10 KEGG Enrichment analysis of characteristic gene in different cell clusters

2.8 熒光免疫組化分析

利用熒光免疫組化對(duì)天祝白牦牛退行期皮膚組織進(jìn)行了染色分析如圖11所示。結(jié)果顯示，SPARC陽性的細(xì)胞主要集中在HS中，其次在表皮細(xì)胞系以及內(nèi)根鞘中也存在一定的表達(dá)；KRT10主要在表皮中高表達(dá)，而在真皮細(xì)胞系中呈現(xiàn)出弱表達(dá)；此外，從皮膚組織中的表達(dá)情況中可以看出DLX3在毛干周圍的內(nèi)根鞘和外根鞘中高表達(dá)。對(duì)關(guān)鍵標(biāo)記基因進(jìn)行免疫組化分析得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述分析結(jié)果基本一致。

圖11 關(guān)鍵標(biāo)記基因熒光免疫組化分析Fig.11 Fluorescence immunohistochemical analysis of key marker genes

3 討論

毛囊作為皮膚組織中的微型器官，與微環(huán)境的其他組織、細(xì)胞共同的受到諸多信號(hào)通路調(diào)控［9］。毛囊的發(fā)育與成熟、毛囊的周期性循環(huán)均依賴于真皮與表皮的相互作用［10］。真皮細(xì)胞發(fā)出的啟動(dòng)信號(hào)使相鄰部位表皮增厚，表皮細(xì)胞發(fā)出的信號(hào)促使真皮細(xì)胞在基板下聚集，誘發(fā)基板下的真皮細(xì)胞發(fā)育為毛乳頭，并由毛乳頭誘使毛囊內(nèi)表皮細(xì)胞繼續(xù)增殖分化，形成毛干并突出皮膚生長(zhǎng)［11］。在退行期，毛乳頭分泌的調(diào)控因子減少，毛母質(zhì)細(xì)胞萎縮，毛囊再生部分退化，毛球部與外根鞘內(nèi)的部分細(xì)胞凋亡，到退行期后期基質(zhì)消失［12-13］。因此利用scRNA-seq對(duì)細(xì)胞進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可為下一步試驗(yàn)提供指導(dǎo)。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序一次可以檢測(cè)產(chǎn)生上萬個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄信息，因此在對(duì)細(xì)胞類型進(jìn)行注釋之前需要進(jìn)行降維。主成分分析是一種利用投影矩陣將高維數(shù)據(jù)投影到低維空間的線性降維方法，可將多個(gè)變量轉(zhuǎn)換為少數(shù)幾個(gè)反映絕大部分信息的綜合變量即主成分［14］。tSNE是一種非線性降維方法，其巧妙的解決了集群表示過度擁擠問題。但有研究發(fā)現(xiàn)該算法比較消耗計(jì)算機(jī)資源，易丟失集群間關(guān)系而無法有效地表示數(shù)量龐大的數(shù)據(jù)集［15-16］。UMAP是建立在黎曼幾何和代數(shù)拓?fù)淅碚摽蚣苌系囊环N可視化降維方法，并對(duì)嵌入維數(shù)沒有計(jì)算限制。Satpathy等［17］發(fā)現(xiàn)UMAP在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的可視化過程中效果理想。

Ryan等［18］發(fā)現(xiàn)Rho家族GTPases能夠通過調(diào)節(jié)鈣粘蛋白、整合素和黏附結(jié)構(gòu)來對(duì)表皮功能進(jìn)行調(diào)控。Fuchs［19］發(fā)現(xiàn)表皮必須通過增殖、分化和凋亡不斷補(bǔ)充和維持自身穩(wěn)態(tài)。正常表皮功能的主要決定因素是細(xì)胞黏附，除了維持表皮結(jié)構(gòu)外，細(xì)胞-基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞黏附在調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和表皮層的細(xì)胞功能方面也起著關(guān)鍵作用［20］。葛偉［21］對(duì)陜北白絨山羊毛囊發(fā)育過程中的表皮細(xì)胞進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，表皮細(xì)胞聚類得到的5個(gè)cluster共同富集了表皮發(fā)育、上皮細(xì)胞分化等信號(hào)通路。這與本研究中牦牛表皮細(xì)胞富集結(jié)果相似，說明牦牛與其他動(dòng)物毛囊發(fā)育存在相似性。葉娜［22］對(duì)聚類得到的IFE-DC細(xì)胞進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，IFE-DC細(xì)胞主要富集在表皮發(fā)育、超纖維組織發(fā)育以及創(chuàng)傷反應(yīng)調(diào)控等通路。與本研究IFE-DC細(xì)胞富集分析結(jié)果一致。

MAPK級(jí)聯(lián)是毛干細(xì)胞主要富集通路之一。而MAPK信號(hào)通路能誘導(dǎo)毛囊細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)毛囊的周期性發(fā)育。有研究顯示，Tβ4能夠影響p-catenin、VEGF以及MMP2的表達(dá)，使MAPK通路中的P38被激活，進(jìn)而影響絨毛生長(zhǎng)、毛囊分布和毛干數(shù)量［23］。在本研究中，黑色素細(xì)胞特征基因主要富集在軸突引導(dǎo)、細(xì)胞黏附的調(diào)控、細(xì)胞遷移的正向調(diào)控以及肌動(dòng)蛋白等通路中。有研究發(fā)現(xiàn)黑色素在黑色素細(xì)胞內(nèi)合成后，通過黑色素細(xì)胞的樹突結(jié)構(gòu)以黑色素顆粒的形式轉(zhuǎn)運(yùn)至周邊表皮，黑色素轉(zhuǎn)運(yùn)過程需要微管驅(qū)動(dòng)蛋白以及動(dòng)力蛋白等的參與［24］。高澤成［25］利用HE染色發(fā)現(xiàn)天祝白牦牛毛囊毛球部黑色素細(xì)胞無法生成黑色素顆粒，導(dǎo)致天祝白牦牛毛纖維中不存在黑色素顆粒而呈現(xiàn)白色。在毛囊形態(tài)發(fā)生期間，黑色素細(xì)胞前體遷移到發(fā)育的毛囊中，并產(chǎn)生去分化的黑色素細(xì)胞，該黑色素細(xì)胞能夠主動(dòng)產(chǎn)生色素并將色素運(yùn)輸?shù)浇琴|(zhì)細(xì)胞中［26］。但黑色素細(xì)胞在軸突引導(dǎo)方面的生物學(xué)功能仍需進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

對(duì)天祝白牦牛毛囊退行期進(jìn)行分析，鑒定出IFE-DC細(xì)胞、表皮細(xì)胞以及INFU細(xì)胞等細(xì)胞類型，特征基因主要參與表皮發(fā)育、上皮細(xì)胞分化以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生等生物學(xué)過程，KEGG分析顯示特征基因顯著富集于黏附連接、細(xì)胞周期以及RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等通路中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)退行期主要細(xì)胞類型擁有GJA1、KRT1、KRT80、FGFR2等28個(gè)共同基因。