張澤穎 范清鋒 鄧云峰 韋廷舟 周正富 周建 王勁江世杰

（1.西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010；2.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081；3.西南科技大學生物質(zhì)材料教育部工程研究中心，綿陽 621010）

脂肪酶（lipase，EC3.1.1.3，即甘油三酯水解酶）是催化長鏈甘油三酯水解為脂肪酸、二酰甘油、單酰甘油的酶類［1］。除水解活性外，脂肪酶還具有酯交換、酯化、氨解和醇解活性，被廣泛應用于多個領域［2-6］。研究發(fā)現(xiàn)，自然界大約有2%的微生物產(chǎn)脂肪酶，至少包括細菌的28個屬，如芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬和不動桿菌屬等［7］。產(chǎn)脂肪酶菌株分離篩選、脂肪酶活力測定及脂肪酶基因挖掘一直是國內(nèi)外的研究熱點，黃陽天等［8］利用橄欖油作為唯一碳源從海泥中篩選獲得兩株具有產(chǎn)脂肪酶能力的海洋細菌，即假單胞菌S11和芽孢桿菌S22，同時這兩株產(chǎn)脂肪酶細菌還表現(xiàn)出產(chǎn)電性能；Haq等［9］從石油污染的土壤中分離出產(chǎn)脂肪酶短桿菌SB11 MH715025和假單胞菌SB15 MH715026，所產(chǎn)生的脂肪酶可有效制備生物柴油，產(chǎn)率高達97%。

許多微生物受環(huán)境因子驅(qū)動進化出一系列適應新環(huán)境的特異基因（簇），為進一步從獲得的微生物中挖掘特殊功能基因和比較種間/內(nèi)基因的差異，隨著測序技術成本的降低，基于全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS）的組學技術已然成為快速、精確、有效的策略［10］。許多研究者采用WGS技術獲得物種全基因組序列進而揭示其發(fā)揮特殊功能的機制，呂瑞瑞采用PacBio SMRT三代測序技術對Lactobacillus paracasei PC-01進行全基因組測序，通過比較基因組學方法揭示39株L.paracasei菌株之間的差異［11］。Lim等［12］對紅樹林土壤中分離的Bacillus solimangrovi GH 2-4T菌株進行全基因組測序，明確了與修復基團和色素形成、蛋白質(zhì)及碳水化合物代謝有關的基因；Patel報道了一株脂肪酶活性較高的印度不動桿菌UBT1菌株，并通過基因組序列探明了菌株所產(chǎn)脂肪酶活性較高的原因是由于三酰甘油脂肪酶、磷脂酶等的特異酶的存在［13］。因此利用全基因組測序技術對于產(chǎn)脂肪酶微生物的功能解析、挖掘特異脂肪酶基因具有重要意義。

不動桿菌是微生物脂肪酶的重要菌株來源，不動桿菌屬來源脂肪酶具有良好的溫度適應性和底物廣譜性，是脂肪酶研究的一個重要方向。本研究將前期篩選獲得的一株不動桿菌屬高產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9進行全基因組測序與分析，對深入了解脂肪酶產(chǎn)生菌WCO-9的產(chǎn)酶機制及新型脂肪酶特異基因挖掘具有重要意義，為后期高產(chǎn)脂肪酶工程菌的創(chuàng)制及工業(yè)化應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所用產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9為本實驗室從餐廚廢油污染的土壤中分離篩選獲得，16S rRNA基因序列鑒定該菌為Acinetobacter junii，并于廣東省微生物菌種保藏中心保藏（編號為GDMCC No：61851）。對照菌株Acinetobacter junii ATCC 17908購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，121℃、1.304×105Pa滅菌30 min。細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 將WCO-9菌株于LB培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)16 h。取50 mL菌液4 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清收集菌體，用無菌水重懸洗菌2次，根據(jù)細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明提取細菌總DNA，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測及濃度和純度測定。提取的樣品總DNA干冰保存寄送并委托北京百邁客生物科技有限公司完成測序工作。

1.2.2 菌株WCO-9比較基因組學分析 將WCO-9菌株16S rRNA基因序列經(jīng)BLAST比對，選取NCBI數(shù)據(jù)庫中同源性較高的10個菌株進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。使用MEGA6.0軟件，采用Neighbor-joining 法和1 000次重復的Bootstrap值構(gòu)建進化樹。使用Mauve軟件Mauvealigner算法將WCO-9菌株基因全基因組序列與參考近源菌株ATCC 17908全基因組序列進行共線性分析。設置局部共線區(qū)的最小權重值（locally collinear block weight，LCB weight）為 325。

1.2.3 菌株WCO-9的脂肪酶活性測定 取培養(yǎng)至對數(shù)中期的WCO-9與ATCC 17908菌液各5 μL點至羅丹明-油脂同化平板圓孔內(nèi)，于30℃培養(yǎng)4 d后觀察透明圈情況，初步判斷菌株產(chǎn)脂肪酶的能力。分別以不同鏈長的對硝基苯酯ρ-NPC10、ρ-NPC14和ρ-NPC18為底物，采用對硝基苯酚法測量WCO-9菌株和對照菌株ATCC 17908粗酶液的脂肪酶活力。1個酶活單位（1U）定義為每分鐘釋放1 μmoL的對硝基苯酚需要的酶量。分別取菌株WCO-9與ATCC 17908發(fā)酵上清液作為粗酶液，參考國標GB/T 23535-2009 《脂肪酶制劑》方法，測定脂肪酶對橄欖油的水解活性。

1.2.4 菌株WCO-9基因組測序與組裝 提取的WCO-9樣品總DNA經(jīng)質(zhì)量驗證合格，使用Canu v1.5軟件對過濾后reads進行組裝，通過Racon v3.4.3軟件利用三代reads對組裝結(jié)果進行矯正，通過Circlator v1.5.5軟件進行環(huán)化和調(diào)整起始位點，采用Pilon v1.22軟件利用二代數(shù)據(jù)進一步進行糾錯，得到準確度更高的基因組后進行后續(xù)分析。

1.2.5 基因功能注釋 使用軟件tRNAscan-SE v2.0、Infernal v1.1.3、Genewise v2.2.0、RepeatMasker v4.0.5預測基因組中的tRNA、rRNA、ncRNA、假基因及重復序列。通過Prodigal v2.6.3軟件對組裝后的基因組進行編碼基因預測，將預測得到的基因序列與COG、KEGG、Swiss-Prot、TrEMBL、Nr、GO、Pfam等數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得基因功能注釋結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 基于16S rRNA基因的系統(tǒng)進化分析

為了獲得能夠降解油脂的微生物，本研究前期從餐廚廢油污染的土壤中通過選擇平板篩選獲得一批具有產(chǎn)脂肪酶能力的菌株，經(jīng)16S rRNA基因序列分析，其中產(chǎn)酶能力最強的菌株為不動桿菌屬細菌，與ATCC 17908菌株［14］的同源性最高（99.99%），本研究命名為WCO-9。從WCO-9 16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）可以看出，WCO-9菌株與ATCC 17908的親緣關系最近，因此選擇該菌株作為對照菌株對WCO-9的產(chǎn)脂肪酶能力進一步比較分析。

圖1 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

2.2 菌株WCO-9產(chǎn)脂肪酶活性比較分析

通過羅丹明B-油脂同化平板和國標法測定脂肪酶水解活性，分析WCO-9菌株與ATCC 17908對照菌株對底物油脂的降解能力，初步比較其產(chǎn)脂肪酶活力。結(jié)果顯示，與對照菌株相比，WCO-9菌株能夠產(chǎn)生明顯較大的降解圈，且其水解底物橄欖油的酶活力為2 833 U/L，是對照菌株ATCC 17908的116倍（表1）。同時，測定WCO-9菌株與對照菌株ATCC 17908對含有不同鏈長脂肪酸的對硝基苯酯 ρ-NPC10、ρ-NPC14和 ρ-NPC18的水解能力。結(jié)果顯示，WCO-9菌株所產(chǎn)脂肪酶活性遠高于對照菌株ATCC 17908，WCO-9菌株對底物 ρ-NPC10、ρ-NPC14和ρ-NPC18的降解能力分別為對照菌株的2 000倍、10倍和4倍，且對ρ-NPC10的水解能力最強，達到2 400 U/mL，隨著脂肪酸鏈的延長酶活性降低（圖2-B）?？傮w而言，相比于親緣性較高的ATCC 17908對照菌株，WCO-9菌株對底物油脂具有較強的降解能力。

圖2 WCO-9菌株產(chǎn)脂肪酶活性分析Fig.2 Lipase activity analysis of WCO-9 strain

表1 菌株WCO-9所產(chǎn)脂肪酶對底物橄欖油的水解能力分析Table 1 Analysis of the hydrolysis ability of lipase from WCO-9 strain on the substrate olive oil by GB/T 23535-2009 method

2.3 菌株WCO-9基因組組裝與全基因組概況

基于WCO-9菌株高產(chǎn)脂肪酶的特異性，為深入挖掘脂肪酶特異編碼基因，本研究對WCO-9菌株進行了全基因組測序?；蚪M序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為CP090890。測序結(jié)果表明WCO-9基因組大小為3 193 903 bp，基因組圈圖如圖3所示。通過組裝構(gòu)建，獲得1個Contig，1個Scaffold，平均GC含量為38.62%。通過Prodigal v2.6.3軟件預測，獲得組裝后WCO-9菌株的編碼基因信息，預測含有2 929個編碼基因，總長度達2 796 966 bp，平均長度954 bp。非編碼RNA預測結(jié)果顯示，包含18個rRNA，74個tRNA，48個其它的ncRNA。此外，預測獲得1個207 bp的假基因。

圖3 菌株WCO-9基因組圖譜Fig.3 Genome map of strain WCO-9

2.4 基因功能注釋

2.4.1 GO數(shù)據(jù)庫注釋 將預測基因與GO數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，獲得基因的分類注釋信息，包括細胞組分（cellar component，CC）、細胞分子功能（molecular function，MF）和生物過程（biological process，BP）。產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9在GO數(shù)據(jù)庫中的統(tǒng)計結(jié)果如圖4所示，該分類中共有2 251個基因注釋，共39種功能分類。其中按照分子功能注釋，WCO-9所涉及基因在GO-CC分類的有3 010個，前3種功能分別是細胞膜、細胞膜部分和細胞。按照分子功能注釋，WCO-9所涉及基因所屬的GO-MF分類有2 714個，前3位功能分別是催化活性、結(jié)合和轉(zhuǎn)運活性，具有甘油三酯脂肪酶活性的基因有 GE001015、GE001718、GE001892、GE001931、GE002660。按照生物學過程分類，基因所屬的GO-BP分類有3 884個，得到注釋最多的3種途徑分別是代謝過程、細胞過程、單生物過程。

圖4 產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9基因功能注釋GO功能分類Fig.4 GO function classification map of lipase-producing strain WCO-9’s gene functions

2.4.2 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋 將產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9的氨基酸序列與KEGG數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，得到功能注釋結(jié)果。該菌株在KEGG數(shù)據(jù)庫中共有1 602個基因分別在環(huán)境信息處理、遺傳信息處理和新陳代謝3大功能50個通路上得到功能注釋，結(jié)果如圖5所示。其中983個基因在代謝通路上獲得注釋，41個代謝通路中，氨基酸生物合成相關的基因高達100個，占代謝通路注釋基因的10.17%，其中與脂肪代謝相關基因的Pathway通路信息及其Pathway ID如表2所示。134個基因在環(huán)境信息處理層面注釋，其中與膜運輸相關的基因為54個，與雙組分體系信號傳導系統(tǒng)相關的基因有54個。

圖5 產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9基因功能注釋KEGG代謝通路Fig.5 KEGG metabolic pathways annotated with the gene functions of lipase-producing strain WCO-9

表2 產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9基因組脂肪代謝降解通路及相關基因Table 2 Fat metabolism and degradation pathways in lipase-producing strain WCO-9 genome and their related genes

2.4.3 COG數(shù)據(jù)庫注釋 將獲得的數(shù)據(jù)與COG蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得細菌完整基因組編碼蛋白系統(tǒng)進化關系分類（圖6）。在不同的功能類中，基因所占比例反映對應時期和環(huán)境下代謝或者生理偏向等內(nèi)容，可以結(jié)合研究對象在各個功能類別的分布做出科學解釋。

圖6 產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9 COG功能分類Fig.6 COG function classification chart of lipase-producing strain WCO-9

2.5 菌株WCO-9比較基因組學分析

2.5.1 Acinetobacter屬菌株基因組比較分析 為比較WCO-9菌株與不動桿菌屬中親緣關系較近菌株的差異性，將3株菌株基因組特征進行統(tǒng)計，結(jié)果如表3。在這4株菌的全基因組信息中，Acinetobacter baumannii ATCC 19606可預測的編碼基因最多。4株菌的基因組大小和GC含量相似，基因組大小在3.19-3.93 Mb，GC含量在38.47%-42.48%。

表3 菌株WCO-9與3株不動桿菌全基因組序列基本特征比較Table 3 Comparison of basic characteristics of whole genome sequences of strain WCO-9 and 3 strains of Acinetobacter

2.5.2 共線性分析 基于系統(tǒng)發(fā)育樹分析選取同源關系最近的ATCC 17908菌株與目標菌株WCO-9基因組進行Mauve共線性比對，快速分析基因組之間有無大片段序列重排現(xiàn)象。從圖7可以看出，WCO-9與ATCC 17908之間的共線性關系較差，存在大量的插入、缺失、倒位和易位等基因重排事件，說明WCO-9菌株在特殊油污土壤環(huán)境中可能進化出一套適應新環(huán)境基因組的現(xiàn)象。

圖7 菌株WCO-9與菌株ATCC 17908基因組共線性分析Fig.7 Genomic collinearity analysis of strain WCO-9 and strain ATCC 17908

2.5.3 菌株WCO-9脂肪酶相關基因序列分析 由數(shù)據(jù)庫注釋分析可知，WCO-9菌株全基因組序列中含有11個編碼脂肪酶的基因（表4）。通過BLAST比對分析獲得預測的脂肪酶的相似性，從表中可以看出，GE001931氨基酸序列相似度最低（90.76%），推測其為一個新型脂肪酶基因。在基因功能注釋分析中，將WCO-9菌株與Pfam蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得3個脂肪酶分子伴侶（表4）。另外，將這14個基因與ATCC 17908菌株中的基因進行比對的過程中，發(fā)現(xiàn)脂肪酶基因GE001931與脂肪酶分子伴侶基因GE000502在ATCC 17908菌株中沒有相對應的基因。值得注意的是在脂肪酶基因中，GE001701與GE001702與參考菌株ATCC 17908中的編碼基因差異很大，分別為42.90%和40.29%。

表4 脂肪酶基因與NCBI數(shù)據(jù)庫中基因序列相似度Table 4 Sequence similarity between lipase genes and genes in NCBI database

3 討論

微生物適應性進化很大程度受環(huán)境因子驅(qū)動，油污環(huán)境中更易進化出降解油脂的脂肪酶產(chǎn)生菌［15］?；谕诰蛐滦吞禺愔久富虻哪繕藢颍捌趶膹N余廢油污染的土壤中篩選獲得一株高產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9，從菌落形態(tài)、生理生化和分子水平初步鑒定該菌為瓊氏不動桿菌（Acinetobacter junii）。已有大量文獻報道，不動桿菌屬微生物具有產(chǎn)脂肪酶的能力［16-21］，其中一些不動桿菌能夠產(chǎn)低溫脂肪酶［22-23］。本研究篩選的瓊氏不動桿菌WCO-9發(fā)酵液中脂肪酶活力表現(xiàn)極佳，具有重要研究價值。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示不動桿菌屬來源的脂肪酶為細菌脂肪酶第I亞家族（I.1）［24-25］，與瓊氏不動桿菌、抗輻射不動桿菌和鮑曼不動桿菌親緣關系較近。通過比較WCO-9菌株與同源性最高的A.junii ATCC 17908菌株的脂肪酶活力，發(fā)現(xiàn)WCO-9菌株的脂肪酶水解活力均顯著高于ATCC 17908菌株。然而，近年來雖有多株不動桿菌屬脂肪酶的報道，也有研究者采用紫外誘變育種、克隆脂肪酶基因構(gòu)建工程菌等多種方法提高菌株降解油脂的能力，但仍存在菌株所產(chǎn)酶活力較低的缺點，如Snellman等［26］從Acinetobacter sp.RAG-1中克隆表達了胞外脂肪酶LipA，該酶對底物對硝基苯基脂肪酸酯具有普適性，對中等長度?；淐6的降解能力最強，接近3 U/mL；Zheng等［27］從Acinetobacter sp.XMZ-26中獲得脂肪酶Lip26，其水解豆蔻酸對硝基苯酯酶活力為30 U/mL；桑鵬等［28］從云南熱泉底泥中篩選的不動桿菌屬耐高溫脂肪酶產(chǎn)生菌Acinetobacter sp.Lip-43，采用棕櫚酸對硝基苯酯（C16）作底物測定的脂肪酶活力僅為106.5 U/mL。而本研究中WCO-9菌株對ρ-NPC10底物表現(xiàn)出最高活性，接近2 500 U/mL，遠高于所報道的不動桿菌屬脂肪酶活力。表明WCO-9菌株與其同屬菌株相比，具有獨特的高效產(chǎn)脂肪酶能力。

隨著測序成本降低和測序技術快速發(fā)展，全基因組測序已然成為最簡潔、有效、快速的挖掘特異功能基因、探明作用機制的有力工具。陳體強等［29］采用PacBio SMART 技術完成了對紫芝栽培品種‘武芝2號’的測序工作，發(fā)掘了漆酶同工酶基因、鯊烯合酶、羊毛甾醇合酶基因等代謝相關功能基因，為紫芝栽培品種（系）的分子鑒定系統(tǒng)建立和品種改良提供可靠信息。Singh等［30］將鮑曼不動桿菌AB030與高抗性病原菌LAC-4進行了基因組和表型比較，發(fā)現(xiàn)AB030中包含許多LAC-4不存在的抗生素耐藥和毒力相關基因。本研究結(jié)合二代和三代測序技術對菌株WCO-9全基因組進行精細測序、分析和功能注釋，從分子層面對該菌株的生物學特性和基因功能進行了分析。注釋結(jié)果表明該菌株涉及脂質(zhì)分解代謝的相關基因較為豐富，這些代謝途徑及基因與菌株產(chǎn)脂肪酶密切相關，由此推測產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9擁有一套完備的高效脂肪酶合成路徑和分泌體系，解釋了WCO-9菌株對油脂具有較強分解能力的原因。

基因組共線性分析顯示W(wǎng)CO-9與ATCC 17908菌株基因組差異較大，表明WCO-9菌株可能為瓊氏不動桿菌新亞種，其形成是由于長期環(huán)境選擇壓力驅(qū)動所致。在長期選擇壓力下，菌株通過基因水平轉(zhuǎn)移或定向進化在局部共線區(qū)域擴充基因以增加新功能，更好地適應復雜多變環(huán)境［31］。因此，WCO-9可能存在一套高產(chǎn)且胞外分泌的新型脂肪酶合成路徑，具有良好的研究價值與應用前景。通過比較基因組學分析挖掘出WCO-9的14個脂肪酶基因及分子伴侶基因中，GE001931為該菌所特有的脂肪酶基因，推測其可能是WCO-9菌株脂肪酶活性遠高于親緣關系最近的ATCC 17908對照菌株的主要原因。3個脂肪酶分子伴侶可能參與脂肪酶的表達分泌途徑，輔助脂肪酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成，其中ATCC 17908中未發(fā)現(xiàn)分子伴侶GE000502的同源基因，且脂肪酶GE001701和GE001702在菌株ATCC 17908的同源性很低，由此推測兩株菌的較大基因組差異影響了各自甘油三酯的代謝通路，最終導致脂肪酶活性的差異。

4 結(jié)論

本研究報道了一株高產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9的全基因組序列，并通過基因功能數(shù)據(jù)庫注釋與比較基因組學分析了該菌株高產(chǎn)脂肪酶活性的原因。脂肪酶產(chǎn)生菌WCO-9的基因組大小為3.19 Mb，GC含量38.62%，含有2 929個編碼基因。其中含有11個具有脂肪酶活性的基因，3個脂肪酶分子伴侶基因，1個特異性脂肪酶基因，2個與對照菌株差異較大的脂肪酶基因；因WCO-9菌株中特異脂肪酶基因的存在及部分基因?qū)Ω视腿ゴx的影響，導致了其酶活遠高于對照菌株ATCC 17908。